【關(guān)鍵詞】骨質(zhì)疏松；人參皂苷Rg3；腸鈣吸收；骨密度；維生素D膜相關(guān)快速反應(yīng)結(jié)合蛋白

骨質(zhì)疏松癥（radiation proctitis，OP）屬于臨床常見(jiàn)的慢性進(jìn)展性疾病之一，OP患者后期發(fā)生骨折風(fēng)險(xiǎn)居高且難以自愈。近年OP 發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，對(duì)患者的生存質(zhì)量造成威脅。在中醫(yī)學(xué)中將OP歸屬于“骨痿”“骨痹”等，病機(jī)屬肝腎虧虛，髓失所養(yǎng)導(dǎo)致骨痿[1]。鈣是人體重要的骨礦物質(zhì)元素，其減少和丟失能夠引起骨密度下降并最終導(dǎo)致OP的發(fā)生[2]。人參皂苷Rg3提取自五加科植物人參，既往研究顯示，人參皂苷Rg3能夠有效抑制炎癥介質(zhì)釋放，保護(hù)腸道黏膜，調(diào)控骨重塑及骨代謝[3-4]，但其是否通過(guò)干預(yù)Notch信號(hào)通路來(lái)影響OP發(fā)病機(jī)制尚不清楚。本研究建立OP大鼠模型并通過(guò)人參皂苷Rg3進(jìn)行干預(yù)治療，探究人參皂苷Rg3調(diào)控Notch信號(hào)通路對(duì)OP大鼠骨代謝及腸鈣吸收的影響機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

人參皂苷Rg3（英文名：20（R）Ginsenoside Rg3，分子式：C42H72O13，分子量：785.013，規(guī)格：50 mg，純度：98%，批號(hào)：20200210，維克奇生物），分子結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1。阿侖膦酸鈉維D3片（固邦佳，70 mg：2800IU*1片 ，國(guó)藥準(zhǔn)字H20110079，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司），雙能 X 線骨密度儀（DXA-800E，徐州品源），熒光顯微鏡（DM1000，日本OLYMPAS），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化），熒光定量PCR儀（ABI公司，型號(hào)：STEPONE PLUS）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)BIO-RAD）；TUNEL（KGA7071，江蘇凱基）；Masson 三色染試劑盒（GP1038，武漢谷歌生物）；OPG、PINP、TRACP 及CTX-IELISA試劑盒均購(gòu)自上海聯(lián)碩；1，25-D3-MARRS及Jagged1、Notch1、Hes1相關(guān)抗體均購(gòu)自北京百奧萊博。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3 個(gè)月齡SPF 級(jí)雌性Wistar 大鼠60 只，體質(zhì)量（250±20） g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（甘）2020-0001。所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)造模。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與造模 按照隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為4組，分別為空白組、模型組、陽(yáng)性組及實(shí)驗(yàn)組，每組大鼠各15只。除空白組外，其他3組大鼠均采用去勢(shì)（OVX法）法制備OP大鼠模型。本次實(shí)驗(yàn)大鼠均OP造模成功。

1.3.2 干預(yù) 按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人用藥量的新?lián)Q算方法[5]計(jì)算大鼠給藥量，空白組及模型組生理鹽水灌胃[10 mL（/ kg·d）]，陽(yáng)性組給予阿侖膦酸鈉維D3灌服（每周6.25 mg/kg），實(shí)驗(yàn)組給予人參皂苷Rg3[80 mg（/ kg·d）]灌胃治療，連續(xù)干預(yù)治療12周。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 骨密度檢測(cè) 大鼠處死后，取各組大鼠部分股骨、脛骨組織，使用雙能X線骨密度儀進(jìn)行骨密度檢測(cè)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算骨密度值。

1.4.2 ELISA法檢測(cè) 大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈取血2 mL，置于離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速2 500 r/min，離心半徑10 cm，離心20 min，取上清液，ELISA法檢測(cè)OP大鼠血清中OPG、PINP、TRACP及CTX-I含量水平變化。

1.4.3 Masson 染色 大鼠處死后，取部分小腸黏膜組織切片常規(guī)脫蠟，蘇木素染色10 min，酸性乙醇分化后水洗，Masson藍(lán)化液返藍(lán)，蒸餾水洗后弱酸工作液洗滌，脫水，二甲苯透明后樹膠封固。

1.4.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化 取各組大鼠小腸黏膜部分組織，置于4%多聚甲醛溶液內(nèi)浸泡24 h，不同濃度乙醇按順序脫水后，切片，脫蠟后將標(biāo)本置于蘇木精中進(jìn)行染色15 min，最后脫水透明10 min，TUNEL試劑盒檢測(cè)各組腸黏膜組織切片標(biāo)本中細(xì)胞凋亡情況，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.4.5 免疫組化檢測(cè)1，25-D3-MARRS 蛋白表達(dá) 取各組部分腸黏膜組織切片，脫蠟水化后，3％過(guò)氧化氫溶液浸泡10 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶處理，然后將切片煮沸以進(jìn)行抗原修復(fù)，5% 山羊血清孵育分別加入一抗、二抗處理，用PBS洗5次后加入DAB顯色，蘇木精復(fù)染藍(lán)化后，顯微鏡下觀察捕獲圖像。

1.4.6 Western blot法檢測(cè)Jagged1、Notch1、Hes1蛋白量表達(dá)變化 RIPA裂解緩沖液加入黏膜組織中，冰上固定30 min，提取組織中的總蛋白，BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定各組黏膜組織中蛋白質(zhì)的濃度。SDS-PAGE對(duì)蛋白進(jìn)行等量分離后移至PDVF膜上，4 ℃下添加一抗與β-actin（1∶500）孵育過(guò)夜。洗滌后添加二抗（1∶500）放置在常溫下孵育2 h。ECL試劑進(jìn)行顯影并對(duì)蛋白相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.4.7 RT-PCR 法檢測(cè)Jagged1、Notch1、Hes1mRNA 表達(dá)變化 液氮研磨凍存的大鼠腸黏膜組織，按照試劑盒說(shuō)明提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增目的基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)腸黏膜組織Jagged1、Notch1、Hes1 mRNA的表達(dá)情況。DNA擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，PCR循環(huán)后再變性15 s，60 ℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。引物：Jagged1上游：GGACTTTCTGAGGGAGGT，下游：CAGTCAGGGCGTTAGATCT；Notch1上游：CAGGGCCTAGAAGCAGGCT，下游：CCGTAACGATCCGATGT；Hes1上游：CGAGAAGTTCAGGCTAG，下游：TCAGCATCTAAGAACGGT；β-actin上游：TGGTGGATATGCATCCCG，下游：GTTAGTTCGCCGTAT。結(jié)果以2-ΔΔCt表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較分別實(shí)施LSD-t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 股骨、脛骨骨密度比較

與空白組比較，造模后各組大鼠股骨、脛骨骨密度明顯降低（Plt;0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性組及實(shí)驗(yàn)組大鼠股骨、脛骨骨密度明顯升高（Plt;0.05），見(jiàn)表1。

2.2 血清OPG、PINP、TRACP及CTX-I含量比較

與空白組比較，模型組大鼠血清中OPG、PINP 明顯降低，TRACP、CTX-I 含量明顯升高（Plt;0.05）；干預(yù)治療6 周后，與模型組比較，陽(yáng)性組及實(shí)驗(yàn)組大鼠OPG、PINP明顯升高，TRACP、CTX-I含量明顯降低（Plt;0.05）；其中實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性組對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），見(jiàn)表2。

2.3 腸黏膜組織膠原纖維變化比較

Masson染結(jié)果顯示，正常組大鼠腸黏膜組織正常，無(wú)明顯膠原增生；造模后，模型組大鼠黏膜下層出現(xiàn)明顯膠原纖維增生；與模型組比較，干預(yù)治療后，大鼠腸黏膜組織膠原纖維增生程度明顯降低（圖2）。

2.4 腸黏膜組織細(xì)胞凋亡情況比較

TUNEL染色提示藍(lán)色熒光為正常細(xì)胞核，綠色熒光為凋亡細(xì)胞的分布。結(jié)果顯示，空白組大鼠腸黏膜組織中細(xì)胞正常表達(dá)，綠色熒光極少；模型組大鼠造模后綠色熒光增多，提示免疫應(yīng)答發(fā)生，細(xì)胞凋亡增加；干預(yù)治療后，大鼠腸黏膜組織中細(xì)胞凋亡情況明顯減少（圖3）。

2.5 腸黏膜組織中1，25-D3-MARRS蛋白表達(dá)比較

與空白組比較，大鼠造模后腸黏膜組織中1，25-D3-MARRS蛋白表達(dá)量明顯下降（Plt;0.05）；與模型組比較，干預(yù)治療后，大鼠腸黏膜組織中1，25-D3-MARRS蛋白表達(dá)量明顯升高（Plt;0.05）（表3、圖4）。

2.6 腸黏膜組織中Jagged1、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)

與空白組比較，造模后模型組大鼠腸黏膜組織中Jagged1、Notch1蛋白表達(dá)量明顯下降，Hes1蛋白表達(dá)量明顯上升（Plt;0.05）；與模型組比較，干預(yù)治療后，陽(yáng)性組及實(shí)驗(yàn)組Jagged1、Notch1蛋白表達(dá)量明顯上升，Hes1蛋白表達(dá)量明顯下降（Plt;0.05）（表4、圖5）。

2.7 腸黏膜組織中Jagged1、Notch1、Hes1 mRNA 表達(dá)水平比較

與空白組比較，造模后模型組大鼠腸黏膜組織中Jagged1、Notch1mRNA表達(dá)量明顯下降，Hes1 mRNA表達(dá)量明顯上升（Plt;0.05）；與模型組比較，干預(yù)治療后，陽(yáng)性組及實(shí)驗(yàn)組Jagged1、Notch1mRNA表達(dá)量明顯上升，Hes1mRNA表達(dá)量明顯下降（Plt;0.05）（表5）。

3 討論

骨代謝及腸鈣吸收異常是OP的重要特征，OP腸鈣吸收異常早期會(huì)出現(xiàn)組織間氧自由基損傷，生物膜脂質(zhì)逐步發(fā)生過(guò)氧化導(dǎo)致細(xì)胞損傷加劇，多種炎性信號(hào)通路被激活，產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞因子并引發(fā)細(xì)胞凋亡進(jìn)程[5-6]。目前西醫(yī)學(xué)治療OP導(dǎo)致的骨代謝及腸鈣吸收異常主要以營(yíng)養(yǎng)支持輔助腸黏膜保護(hù)措施為主，患者常出現(xiàn)不良反應(yīng)，且易復(fù)發(fā)。

人參皂苷Rg3提取自五加科植物人參，是人參的主要藥效成分之一。研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，人參皂苷可以明顯增加骨代謝，參與多種骨細(xì)胞的凋亡與自噬過(guò)程。人參皂苷Rg3能夠有效調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，控制炎癥介質(zhì)，調(diào)控骨重塑及骨代謝，有效保護(hù)腸道黏膜，促進(jìn)腸鈣吸收[9-10]。

鈣作為細(xì)胞代謝中重要的骨礦物質(zhì)元素，其減少及丟失是引起骨密度下降及OP發(fā)生的主要原因之一，而機(jī)體內(nèi)鈣的吸收與1，25-D3-MARRS 蛋白存在密切關(guān)系。1，25-D3-MARRS是體內(nèi)維生素D的活性形式，可在小腸、骨等多種器官組織中表達(dá)，對(duì)人體鈣磷代謝及骨細(xì)胞分化及骨的吸收有重要作用[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，1，25-D3-MARRS在小腸內(nèi)與受體蛋白結(jié)合后，激活磷脂酶A2及磷脂酶C，從而促進(jìn)鈣磷在小腸內(nèi)迅速吸收[13]。本研究還發(fā)現(xiàn)，OP大鼠造模后，1，25-D3-MARRS含量下降，骨密度明顯降低，這說(shuō)明大鼠腸道鈣的吸收下降，促進(jìn)骨質(zhì)疏松的發(fā)生，而經(jīng)過(guò)治療后，1，25-D3-MARRS含量及骨密度均發(fā)生改善，說(shuō)明人參皂苷Rg3促進(jìn)了大鼠腸道內(nèi)1，25-D3-MARRS的增加，改善了OP大鼠的骨密度。

Notch 通路是一類高保守的細(xì)胞表面受體通路，影響多種細(xì)胞正常形態(tài)的發(fā)生，包括多能祖細(xì)胞的分化、凋亡、增殖及細(xì)胞邊界的形成等過(guò)程，研究指出[14]，Notch通路能夠調(diào)節(jié)組織中骨代謝及骨重建，調(diào)控骨吸收及骨形成過(guò)程。而OPG、PINP、TRACP及CTX-I等是破骨細(xì)胞形成、分化和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子[15-16]。Canalis E 等[17]研究表明，骨細(xì)胞中Notch通路表達(dá)能促進(jìn)小鼠血清OPG含量增加，從而抑制骨吸收過(guò)程。Jagged1 是Notch 的主要配體之一，Notch1 是Notch 信號(hào)分子的主要受體之一，Hes1是主要的靶分子；相鄰細(xì)胞之間Jagged1及Jagged1分子在靶分子Hes1作用下通過(guò)受體與配體的結(jié)合傳遞Notch信號(hào)，從而擴(kuò)大并固化細(xì)胞間的分子差異，影響細(xì)胞形態(tài)發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，OP大鼠造模后血清中OPG、PINP、TRACP及CTX-I含量發(fā)生明顯變化，細(xì)胞凋亡程度增加，腸纖維化及炎癥水平均發(fā)生變化，這表明OP大鼠造模后體內(nèi)細(xì)胞凋亡程度增加，骨的形成和吸收發(fā)生改變，這與OP的病理表現(xiàn)一致。大鼠在人參皂苷 Rg3 干預(yù)治療后，OPG、PINP、TRACP及CTX-I等標(biāo)志物水平均明顯改善，細(xì)胞凋亡減輕，腸纖維化改善，這與以往學(xué)者[18]研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示，大鼠造模后Notch 通路相關(guān)蛋白Jagged1、Notch1、Hes1 表達(dá)明顯變化，但經(jīng)人參皂苷Rg3干預(yù)治療后，相關(guān)蛋白表達(dá)趨向好轉(zhuǎn)，這說(shuō)明人參皂苷Rg3干預(yù)了OP大鼠Notch通路的表達(dá)，影響OP大鼠腸黏膜組織細(xì)胞凋亡，改善組織纖維化，促進(jìn)鈣吸收，改善腸黏膜功能。

綜上所述，人參皂苷Rg3能夠有效改善OP大鼠骨代謝水平及腸吸收功能，改善腸黏膜組織纖維化及細(xì)胞凋亡過(guò)程，促進(jìn)腸道鈣吸收。