【摘 要】目的：基于生物信息學(xué)分析探究種植體周?chē)祝╬eri-implantitis）疾病發(fā)展中明顯浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞及關(guān)鍵的免疫相關(guān)基因。方法：整合美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus，GEO）中的GSE106090、GSE33774及GSE57631數(shù)據(jù)集，通過(guò)單樣本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）評(píng)估種植體周?chē)准敖】笛例l組織中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分?jǐn)?shù)，并利用套索算法（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）篩選關(guān)鍵的免疫基因。結(jié)果：整合3個(gè)數(shù)據(jù)集并去批次效應(yīng)后，使用“ClusterProfiler”包實(shí)現(xiàn)種植體周?chē)椎幕虮倔w論（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)的富集分析，以識(shí)別在種植體周?chē)字兄饕险{(diào)和下調(diào)的信號(hào)通路及生物學(xué)過(guò)程。本研究進(jìn)一步將差異基因與ImmPort數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的免疫相關(guān)基因取交集，通過(guò)LASSO 回歸篩選變量后，成功鑒定關(guān)鍵的疾病免疫特征性基因，包括趨化因子CC 配體18（C-C motif chemokine ligand 18，CCL18）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin 1 beta，IL-1β）、補(bǔ)體C3（complement C3，C3）、白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL6）、利鈉肽受體-3（natriuretic peptide receptor 3，NPR3）、肽酶抑制因子-3（peptidase inhibitor 3，PI3）、白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體-B3（leuko?cyte immunoglobulin like receptor B3，LILRB3）、富亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體-4（leucine rich repeat containing G proteincoupledreceptor 4，LGR4）。隨后，本研究進(jìn)行與ssGSEA免疫浸潤(rùn)分?jǐn)?shù)的相關(guān)性分析，這些基因與種植體周?chē)浗M織內(nèi)明顯增加的23種免疫細(xì)胞呈現(xiàn)出不同程度的相關(guān)性。通過(guò)GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的富集分析，發(fā)現(xiàn)IL1B、IL6、CCL18、C3、LGR4、PI3、LILRB3 等基因主要參與體液免疫、適應(yīng)性免疫、白細(xì)胞遷移以及皮膚表皮發(fā)育等生物過(guò)程，而NPR3 主要與白細(xì)胞增殖和體液水平調(diào)節(jié)等生物過(guò)程相關(guān)。結(jié)論：通過(guò)運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)免疫相關(guān)差異基因進(jìn)行篩選，本研究成功識(shí)別出8個(gè)關(guān)鍵的免疫特征性基因，參與了種植體周?chē)酌庖邞?yīng)答及炎癥響應(yīng)的多個(gè)環(huán)節(jié)，并對(duì)種植體周?chē)准膊”尘熬哂休^高敏感性。這些免疫特征性基因的識(shí)別為深入理解種植體周?chē)椎陌l(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的治療策略提供重要的分子靶標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】種植體周?chē)?；生物信息；免疫；機(jī)器學(xué)習(xí)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R780.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-02-02

目前，隨著牙種植體的制造技術(shù)的發(fā)展及價(jià)格成本的降低，牙種植體已經(jīng)逐漸成為牙缺失的重要修復(fù)方式之一。盡管如此，種植治療仍然可能因術(shù)后或遠(yuǎn)期的并發(fā)癥而失敗。種植體周?chē)资?種由菌斑引發(fā)的感染炎性疾病，其病理過(guò)程主要表現(xiàn)為植體周?chē)浗M織及硬組織的慢性炎癥，導(dǎo)致種植體周?chē)浻步M織慢性吸收，最終使種植體失去骨組織的支持，從而引發(fā)脫落并導(dǎo)致種植治療失敗。這一病癥通常由多種因素，如微生物感染、機(jī)械刺激以及宿主免疫反應(yīng)等因素的相互作用所致。1項(xiàng)Meta分析顯示，在歐洲、南美和北美，種植體周?chē)衬ぱ缀头N植體周?chē)椎募訖?quán)平均患病率分別為43%和22%[1]。1項(xiàng)前瞻性研究顯示，國(guó)內(nèi)患者種植體周?chē)准胺N植體骨水平略微降低的概率分別為19%和11.2%[2]。種植體周?chē)啄壳叭允欠N植治療失敗的主要原因，患者經(jīng)過(guò)個(gè)性化的治療及護(hù)理后，5年留存率有明顯升高，但約3/4的種植體仍存在種植體周?chē)M織的慢性炎癥，難以根治[3]。

種植體周?chē)椎陌l(fā)病過(guò)程與多數(shù)慢性炎癥相似，涉及多種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)以及它們之間復(fù)雜的相互作用，這些相互作用共同引發(fā)免疫反應(yīng)并導(dǎo)致炎癥的激活[4-5]。為了深入了解這一過(guò)程，本研究采用了生物信息學(xué)的方法，通過(guò)單樣本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）對(duì)種植體周?chē)装Y組織的免疫細(xì)胞進(jìn)行分析。這種方法能夠提供關(guān)于疾病發(fā)生過(guò)程中免疫細(xì)胞活動(dòng)的關(guān)鍵信息，有助于更全面地理解種植體周?chē)椎陌l(fā)病機(jī)制[6]。Albrektsson T等[7]的研究表明，植入物在體內(nèi)存活是由于慢性炎癥和先天免疫系統(tǒng)激活形式的平衡防御反應(yīng)，當(dāng)防御/愈合平衡被破壞時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致種植體邊緣骨吸收。以前的研究主要集中在牙周炎與種植體周?chē)字g的差異，如差異表達(dá)的lncRNA 和mRNA[8]，不同的疾病機(jī)制[9]。Zhang XG 等[10]報(bào)道了種植體周?chē)椎臐撛诨驑?biāo)志物，但未能深入探索種植體周?chē)椎拿庖呒?xì)胞及其相關(guān)調(diào)節(jié)的功能。鑒于深入理解免疫生物學(xué)過(guò)程對(duì)于開(kāi)發(fā)精準(zhǔn)治療策略至關(guān)重要，本研究聚焦于這一核心且尚未得到充分探索的領(lǐng)域，以期為種植體周?chē)椎闹委熖峁┬碌耐黄泣c(diǎn)。

本文運(yùn)用生物信息學(xué)手段，篩選出與種植體周?chē)酌庖邞?yīng)答相關(guān)的差異免疫基因，并通過(guò)最小絕對(duì)收縮和選擇算法（least absolute shrinkage and se?lection operator，LASSO）邏輯回歸進(jìn)行變量縮減，鑒定種植體周?chē)酌庖邞?yīng)答的特征性基因，結(jié)合KEGG及GO富集分析，進(jìn)一步闡述特征性基因在種植體周?chē)撞±磉^(guò)程中主要參與的生物學(xué)過(guò)程及通路。這一研究旨在為未來(lái)種植體周?chē)酌庖咿D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的深入研究及治療方案的開(kāi)發(fā)提供新的視角和思路。

1 材料與方法

1.1 微陣列數(shù)據(jù)

從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gge/）下載3 個(gè)基因微陣列數(shù)據(jù)集（GSE106090、GSE33774、GSE57631）。GSE106090 包含6 個(gè)種植體周?chē)籽例l樣本和6 個(gè)健康牙齦組織樣本。GSE33774包含7個(gè)種植體周?chē)讟颖竞?個(gè)健康牙齦組織樣本。GSE57631包含6個(gè)種植體周?chē)讟颖竞?個(gè)健康牙齦組織樣本。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理和免疫相關(guān)差異基因篩選

根據(jù)每個(gè)數(shù)據(jù)集平臺(tái)注釋信息將探針轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)基因名，使用R 軟件包limma（version 3.4.2）的removeBatchEffect函數(shù)進(jìn)行去除批次效應(yīng)，獲得去除批次效應(yīng)后的矩陣。篩選種植體周?chē)着c健康牙齦組織之間的差異表達(dá)基因（differ?entially expressed genes，DEG），篩選條件為：Plt;0.05，|log2FC|gt;1。下載ImmPort 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//immport.org/shared/）收錄的免疫相關(guān)基因，與差異基因取交集，獲得免疫相關(guān)差異基因。

1.3 篩選免疫特征性基因

將免疫相關(guān)差異基因進(jìn)行LASSO邏輯回歸。本研究采用R 軟件包glmnet 中的cv.glmnet 函數(shù)進(jìn)行擬合LASSO 模型。以上述處理后的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，生成受試者工作特征（re?ceiver operating characteristic，ROC）曲線驗(yàn)證篩選出疾病敏感性基因。

1.4 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析及相關(guān)性分析

為探索免疫特征性基因和免疫細(xì)胞之間的關(guān)系。使用“GSVA”軟件包（Version 1.50.0）進(jìn)行ssGSEA分析，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化的ssGSEA評(píng)分以評(píng)價(jià)每個(gè)樣品中免疫細(xì)胞的富集水平。免疫細(xì)胞的標(biāo)志基因從前人研究中獲得[11]，包含12種類(lèi)型的固有免疫細(xì)胞亞群和16種類(lèi)型的適應(yīng)性免疫細(xì)胞亞群，從TISIDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//cis.hku.hk/TISIDB/）下載。該標(biāo)志基因列表用于免疫細(xì)胞亞型的共有分子亞型分型和估計(jì)免疫細(xì)胞豐度。分析得到的免疫細(xì)胞ssGSEA 評(píng)分采用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)比較健康組與種植體周?chē)捉M的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

將免疫特征性基因的表達(dá)量與免疫細(xì)胞ssGSEA評(píng)分進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，以評(píng)估基因與種植體周?chē)酌庖邞?yīng)答的相關(guān)性。

1.5 基因富集分析

為確定免疫特征性基因相關(guān)的信號(hào)通路及生物學(xué)過(guò)程，基于R軟件包“ClusterProfiler”（Version 4.10.0），對(duì)基因名轉(zhuǎn)化的ENTREZ ID及l(fā)og2FC矩陣進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）和傳統(tǒng)的GO富集分析，獲得種植體周?chē)装l(fā)生主要變化信號(hào)通路及生物過(guò)程，篩選得到免疫特征性基因及差異基因主要參與的種植體周?chē)撞±頇C(jī)制。

2 結(jié) 果

2.1 差異基因篩選

整合并將GSE106090、GSE33774及GSE57631標(biāo)準(zhǔn)化去批次后，每個(gè)數(shù)據(jù)集的表達(dá)量分布具有均一性。將標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)矩陣進(jìn)行差異基因分析，其中Plt;0.05 共有1 701 個(gè)基因，Plt;0.05且|log2FC|gt;1共有242個(gè)基因。為排除具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異但表達(dá)量變化不大的基因，本研究采用后者限定差異基因標(biāo)準(zhǔn)。從ImmPort數(shù)據(jù)庫(kù)下載了1 793個(gè)免疫相關(guān)基因列表，并與差異基因取交集，結(jié)果顯示差異基因中有41個(gè)涉及免疫應(yīng)答的差異基因（圖1）。

2.2 LASSO邏輯回歸尋找種植體周?chē)酌庖咛卣餍曰?/p>

將以上篩選出的41個(gè)基因通過(guò)LASSO邏輯回歸篩選變量，隨著log（λ）回歸系數(shù)不斷收斂，最終收斂成0，在變量為8時(shí)二分類(lèi)偏差降至最低，模型擬合效果最佳。如表1所示，最終LASSO回歸算法得到以下基因：趨化因子CC配體18（C-Cmotif chemokine ligand 18，CCL18）、白細(xì)胞介素-1β（interleu?kin 1 beta，IL1β）、補(bǔ)體C3（complement C3，C3）、白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL6）、利鈉肽受體-3（natriuretic peptide recep?tor 3，NPR3）、肽酶抑制因子-3（peptidase inhibitor 3，PI3）、白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體-B3（leukocyte immunoglobulin like re?ceptor B3，LILRB3）、富亮氨酸重復(fù)序列G 蛋白偶聯(lián)受體-4（leucine rich repeat containing G protein-coupled receptor 4，LGR4）。為驗(yàn)證得到的基因是否對(duì)種植體周?chē)拙哂屑膊∶舾行?，使?個(gè)數(shù)據(jù)集整合的矩陣?yán)L制了受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，結(jié)果顯示8個(gè)免疫特征性基因均具有0.8以上的曲線下面積（area under thecurve，AUC），其中NPR3的AUC達(dá)到了0.964（圖2）。

2.3 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分分析

采用ssGSEA分析得到每個(gè)樣本中28種免疫細(xì)胞亞型的浸潤(rùn)評(píng)分。其中包含活化樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、骨髓來(lái)源抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）等12種固有免疫細(xì)胞亞群，主要對(duì)侵入的病原體迅速應(yīng)答，產(chǎn)生非特異抗感染免疫作用，還包含T細(xì)胞和B細(xì)胞的16種適應(yīng)性免疫細(xì)胞亞群，主要對(duì)非己抗原性異物產(chǎn)生特異性的免疫排斥反應(yīng)，并對(duì)抗原產(chǎn)生免疫記憶。相比健康牙齦組織，種植體周?chē)讟颖局?3種免疫細(xì)胞亞型ssGSEA評(píng)分均有不同程度增高。將免疫細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分與免疫特征性基因進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，C3、CCL18、IL1B、LGR4、LILRB3 及NPR3 與多種免疫細(xì)胞均有明顯相關(guān)性（圖3）。

2.4 GSEA富集分析及免疫特征性基因功能評(píng)估

對(duì)種植體周?chē)捉M的基因表達(dá)變化進(jìn)行GSEA富集分析后，發(fā)現(xiàn)種植體周?chē)自贕O數(shù)據(jù)庫(kù)中主要促進(jìn)白細(xì)胞粘附正向調(diào)控、白細(xì)胞遷移、細(xì)胞趨化、細(xì)胞活化的正向調(diào)控和白細(xì)胞趨化等生物學(xué)功能，主要促進(jìn)表皮形態(tài)發(fā)生、皮膚生長(zhǎng)、角化、表皮生長(zhǎng)、半橋粒裝配等生物學(xué)功能（表2）。

在KEGG的通路富集中，主要促進(jìn)N-聚糖生物合成、趨化因子信號(hào)通路、移植物抗宿主疾病、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞因子-受體相互作用等信號(hào)通路，主要抑制嗅覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)、丁酸代謝、細(xì)胞色素p450對(duì)外源性的代謝、細(xì)胞色素p450藥物代謝、核苷酸切除修復(fù)等信號(hào)通路（表3）。

進(jìn)一步分析免疫特征性基因在GO數(shù)據(jù)庫(kù)的GSEA富集結(jié)果中發(fā)揮的作用，發(fā)現(xiàn)CCL18 富集在白細(xì)胞遷移，PI3 富集在體液免疫反應(yīng)中，說(shuō)明其在抗體產(chǎn)生和體液免疫調(diào)節(jié)中扮演關(guān)鍵角色。LILRB3 富集在適應(yīng)性免疫反應(yīng)中，可能參與了T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化與調(diào)控。C3 在體液免疫反應(yīng)及適應(yīng)性免疫反應(yīng)中均有富集，IL1B 和IL6 在以上提到的3個(gè)生物學(xué)過(guò)程中均富集到，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了它們?cè)诿庖叻磻?yīng)中的多功能性和重要性。LGR4 作為免疫特征性基因中少有的下調(diào)表達(dá)基因，富集在皮膚表皮生長(zhǎng)生物過(guò)程中，提示其在表皮穩(wěn)態(tài)和再生中可能發(fā)揮重要作用（圖4）。

然而，在KEGG與GO數(shù)據(jù)庫(kù)的GSEA富集分析結(jié)果中均未發(fā)現(xiàn)NPR3 所參與的生物過(guò)程或信號(hào)通路，為深入探究NPR3 在種植體周?chē)字械拇_切作用，本研究另做了傳統(tǒng)富集分析。傳統(tǒng)富集基于超幾何分布方法，專(zhuān)注于在兩組樣本中識(shí)別那些明顯富集差異基因的功能類(lèi)別或生物通路。需要注意的是，與GSEA分析相比，傳統(tǒng)富集結(jié)果雖然能夠指出哪些功能或通路在疾病狀態(tài)下存在差異，但無(wú)法提供這些通路或功能在疾病狀態(tài)下的具體表達(dá)趨勢(shì)。通過(guò)傳統(tǒng)的GO富集分析，結(jié)果顯示NPR3 參與了GO生物過(guò)程的白細(xì)胞增殖和體液水平調(diào)節(jié)（FDRlt;0.05）（表4，圖5）。

3 討 論

種植體周?chē)资强谇环N植體周?chē)浗M織及骨組織的感染性慢性炎癥，造成支持種植體的牙槽骨慢性骨溶解，最終導(dǎo)致種植體松動(dòng)脫落，是種植治療失敗的主要原因[12]。越來(lái)越多的研究證據(jù)顯示，免疫應(yīng)答在種植體周?chē)字衅痍P(guān)鍵的作用[13-14]，但目前的研究?jī)H關(guān)注少數(shù)幾種免疫細(xì)胞在種植體周?chē)字械墓敲庖叽當(dāng)_，且不易將免疫反應(yīng)與疾病病理過(guò)程中關(guān)鍵治療靶點(diǎn)聯(lián)系起來(lái)。本文旨在研究種植體周?chē)装l(fā)生過(guò)程中重要的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和重要的免疫特征性基因，并進(jìn)一步探討篩選出的免疫特征性基因的生物學(xué)機(jī)制。通過(guò)LASSO邏輯回歸和GSEA 富集分析，本研究發(fā)現(xiàn)IL1B、IL6、LILRB3、CCL18、C3 及PI3 主要調(diào)節(jié)種植體周?chē)装l(fā)展過(guò)程中的體液免疫、適應(yīng)性免疫及白細(xì)胞遷移等生物學(xué)過(guò)程，而LGR4 主要參與負(fù)調(diào)控種植體周?chē)椎纳掀どL(zhǎng)過(guò)程。通過(guò)差異基因的GO 富集分析，發(fā)現(xiàn)NPR3 主要參與白細(xì)胞增殖及體液水平調(diào)節(jié)的生物過(guò)程。

將ImmPort數(shù)據(jù)庫(kù)下載的免疫相關(guān)基因與差異基因交集，得到41個(gè)涉及免疫應(yīng)答的基因，在GSEA的富集分析結(jié)果中進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)這些基因大多都參與到種植體周?chē)酌黠@上調(diào)的炎癥免疫相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程中，但41個(gè)基因的數(shù)量對(duì)于疾病特征性基因的篩選顯然過(guò)多。在此本研究采用了LASSO邏輯回歸的算法來(lái)進(jìn)一步收縮特征性基因，LASSO回歸目前已是一種廣泛采用的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，可將數(shù)據(jù)中不重要的變量系數(shù)壓縮為0，既實(shí)現(xiàn)了較為準(zhǔn)確的參數(shù)估計(jì)，也實(shí)現(xiàn)了變量選擇或者變量降維。在此本研究將41 個(gè)免疫相關(guān)差異基因納入LASSO邏輯回歸模型的構(gòu)建，選取了二變量偏差最低時(shí)的8個(gè)基因組成的模型，即IL1B、IL6、LILRB3、CCL18、C3、PI3、LGR4 及NPR3。在此8 個(gè)基因中，有常見(jiàn)的與免疫-炎癥串?dāng)_的經(jīng)典炎癥因子，如IL1B、IL6，已被證實(shí)在多種炎癥反應(yīng)及骨免疫中發(fā)揮重要作用[15]。LILRB3全名為白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體B3，在免疫細(xì)胞上表達(dá)，與抗原呈遞細(xì)胞上的MHC I類(lèi)分子結(jié)合，并轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制免疫應(yīng)答刺激的負(fù)信號(hào)，在大量研究中提示可抑制免疫活性從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展[16-17]。但在本研究的種植體周?chē)捉M織中發(fā)現(xiàn)LILRB3 存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的上調(diào)變化，可能是慢性炎癥刺激中的負(fù)反饋反應(yīng)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究探討。CCL18作為一種趨化因子，在調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，CD4+/CD8+ T淋巴細(xì)胞及活化的巨噬細(xì)胞顯示趨化活性，在體液免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮作用[18]。補(bǔ)體成分C3在補(bǔ)體系統(tǒng)的激活中起著核心作用，目前已有大量證據(jù)表明補(bǔ)體系統(tǒng)與骨骼的免疫有緊密聯(lián)系，補(bǔ)體C3在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞中均有表達(dá)，且C3能促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化[19]。PI3 編碼彈性蛋白酶特異性抑制劑，作為抗革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌以及真菌病原體的抗菌肽發(fā)揮作用，其表達(dá)受到細(xì)菌脂多糖和炎癥細(xì)胞因子而上調(diào)。PI3最早發(fā)現(xiàn)于過(guò)度增殖的人表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞中，在持續(xù)受到炎癥刺激的上皮中組成性表達(dá)，例如口腔牙齦上皮中，在上皮完整性調(diào)控中起到重要作用[20]。

種植體周?chē)资怯煞N植體周?chē)e聚的細(xì)菌生物膜引起的，然而，細(xì)菌不會(huì)直接進(jìn)入軟組織，因?yàn)榻琴|(zhì)形成細(xì)胞和黏膜軟組織的生物密封起到保護(hù)屏障的作用[21]。在種植體周?chē)着c健康組的GSEA富集分析中觀察到了與角化黏膜生物屏障相關(guān)的結(jié)果，GO數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果中角化、表皮生長(zhǎng)等生物學(xué)過(guò)程明顯下調(diào)，其中特征性免疫基因LGR4 也參與了該過(guò)程，提示炎癥反應(yīng)下種植體周?chē)つて琳系钠茐?。種植體周?chē)闹旅芙腔l在控制牙菌斑和抵抗口腔咀嚼運(yùn)動(dòng)的機(jī)械刺激中起到關(guān)鍵作用。根據(jù)觀察到的明顯下調(diào)結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)種植體周?chē)椎拿庖叻磻?yīng)引發(fā)的炎癥破壞了周?chē)M織的防御能力，使得外源性刺激更容易突破上皮并深入至骨組織，進(jìn)而引發(fā)骨組織的炎癥反應(yīng)和邊緣性骨吸收[22]。另外，通過(guò)種植體周?chē)谆虮磉_(dá)模式的分析，本研究發(fā)現(xiàn)IL1B、IL6、LILRB3、CCL18、C3、PI3 參與調(diào)控的白細(xì)胞遷移、體液免疫反應(yīng)、適應(yīng)性免疫反應(yīng)也存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的明顯上調(diào)。且這些基因在種植體周?chē)譍SEA結(jié)果中P 值居前5位以內(nèi)，結(jié)合ssGSEA分析結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)了特征性免疫基因在種植體周?chē)酌庖叻磻?yīng)中的重要功能。在Ganesan SM等[23]最近的微生物組學(xué)研究中，種植體周?chē)总浗M織在鋅指蛋白、凋亡、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、免疫炎癥系統(tǒng)和細(xì)胞-細(xì)胞粘附方面比健康軟組織表現(xiàn)出更多富集。這與本研究的富集分析結(jié)果一致，即與健康樣品相比，先天免疫系統(tǒng)、適應(yīng)性免疫系統(tǒng)、白細(xì)胞趨化遷移、生物粘附功能在種植體周?chē)捉M織中上調(diào)。

NPR3 在表現(xiàn)上與其他7種免疫特征性基因有所不同，其在ROC曲線分析中展現(xiàn)出了最大的AUC值（AUC=0.964），并與10種免疫細(xì)胞亞群之間存在明顯的相關(guān)性，在種植體周?chē)酌庖叻磻?yīng)中的關(guān)鍵作用得到了驗(yàn)證。但在GSEA富集分析中，本研究并未發(fā)現(xiàn)NPR3 直接參與任何GO 生物過(guò)程或KEGG通路。在后續(xù)的差異基因GO富集結(jié)果中顯示NPR3 主要富集于白細(xì)胞增殖和體液水平調(diào)節(jié)生物過(guò)程中。NPR3也稱(chēng)利鈉肽受體C，是C型利鈉肽的主要受體，廣泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞上，針對(duì)NPR3的研究主要與心血管系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)和疾病相關(guān)[24]。在免疫炎癥領(lǐng)域，Harrington EO等[25]發(fā)現(xiàn)NPR3能夠介導(dǎo)心房利鈉肽抑制急性肺損傷中的中性粒細(xì)胞肺部募集，這表明NPR3在調(diào)控急性炎癥反應(yīng)中具有一定作用，另1項(xiàng)由Cheng C等[26]進(jìn)行的研究則揭示了NPR3在動(dòng)脈粥樣硬化病理過(guò)程中的重要性，研究發(fā)現(xiàn)NPR3與炎癥、氧化應(yīng)激以及自噬等過(guò)程緊密相關(guān)。盡管有這些關(guān)于NPR3在急性或慢性炎癥中的研究，但關(guān)于其在感染性慢性炎癥，尤其是種植體周?chē)字械淖饔?，目前的研究仍顯不足。有趣的是，一項(xiàng)基于生物信息學(xué)的侵襲性牙周炎研究同樣觀察到了NPR3 明顯下調(diào)的趨勢(shì)（log2FC=-1.69），且該基因位于前10位明顯下調(diào)的基因之列[27]，與本研究的結(jié)果高度一致（log2FC=-1.66，明顯性排名第8）。在類(lèi)似疾病背景下的相同趨勢(shì)暗示了NPR3在牙齦、牙槽骨等口腔組織感染性慢性炎癥中可能發(fā)揮著潛在的重要作用。這為進(jìn)一步深入研究NPR3 在口腔慢性感染性疾病中的具體作用機(jī)制提供了有力的證據(jù)。

本研究對(duì)種植體周?chē)椎倪z傳和免疫生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行了深入探討。研究結(jié)果顯示，IL1B、IL6、LILRB3、CCL18、C3、PI3、LGR4 及NPR3 等基因在疾病免疫反應(yīng)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，被鑒定為免疫特征性基因。這些基因共同參與了種植體周?chē)装l(fā)展過(guò)程中固有免疫及適應(yīng)性免疫的多種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，其中白細(xì)胞的浸潤(rùn)在GSEA富集分析中顯示出關(guān)鍵的作用。此外，這些特征性基因與差異基因共同調(diào)控種植體周?chē)椎亩喾N免疫反應(yīng)和種植體周?chē)つて琳系钠茐?，進(jìn)一步突顯了其在疾病發(fā)展中的重要功能。但本研究仍存在一些局限性，分析共納入了19例種植體周?chē)捉M織和16例健康牙齦組織，樣本量較少，在建立LASSO回歸模型時(shí)無(wú)法再次將樣本拆分做“內(nèi)部-外部”交叉驗(yàn)證，于是本文中僅在內(nèi)部模型中驗(yàn)證免疫特征性基因?qū)膊〉拿舾行?。為了更深入地解釋本文的結(jié)論，后續(xù)研究將計(jì)劃收集更多的種植體周?chē)讟颖荆瑢?duì)樣本量進(jìn)行擴(kuò)充并作基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的驗(yàn)證。另外，在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)選取的數(shù)據(jù)集中，并非所有種植體周?chē)捉M織均為同一解剖位置，這可能導(dǎo)致生物信息學(xué)富集分析中的偏差，但本研究結(jié)果中組內(nèi)同質(zhì)性尚可，分析結(jié)果仍對(duì)關(guān)注種植體周?chē)椎难芯空呔哂袇⒖家饬x。

參 考 文 獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：周一青）

基金項(xiàng)目：重慶英才計(jì)劃“包干制”資助項(xiàng)目（編號(hào)：cstc2021ycjhbgzxm0336）。