關(guān)鍵詞：AQPs；NO；α-淀粉酶；種子萌發(fā)；種子吸脹

中圖分類號：S511 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

種子萌發(fā)是植物生長的開始，是一個(gè)受內(nèi)源及外源因素精確調(diào)控的復(fù)雜生理生化過程[1]。種子要完成萌發(fā)，必須得先吸收水分，因此，吸水膨脹觸發(fā)了種子的萌發(fā)過程[2]。

植物水通道蛋白（aquaporins， AQPs）可促進(jìn)植物根部對水分吸收，而后通過莖將水輸送到葉或種子等器官中，并且AQPs 可根據(jù)細(xì)胞需水量來調(diào)節(jié)水跨膜運(yùn)輸[3-5]。植物可通過促進(jìn)AQPs 編碼基因過表達(dá)，增強(qiáng)自身吸水能力，從而響應(yīng)低氧脅迫[6]。在AQPs 活性抑制劑HgCl₂ 處理下，蠶豆種子的吸水能力顯著降低，而AQPs 過表達(dá)提高了番茄種子的導(dǎo)水率和存活率，同時(shí)增強(qiáng)滲透脅迫下油菜種子萌發(fā)特性及吸水率[7-9]。

一氧化氮（nitric oxide， NO）是一種小的水溶性和脂溶性氣體，易透膜擴(kuò)散。它既是生物體內(nèi)主要的信號分子[10]，也是種子休眠的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑，可促進(jìn)種子萌發(fā)，并參與緩解鹽、干旱以及重金屬等逆境對種子萌發(fā)的脅迫作用[11-16]。鹽脅迫下，外源NO 供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）可以適當(dāng)提高水稻、紫蘇及白菜的種子發(fā)芽指數(shù)，促進(jìn)種子萌發(fā)及早期幼苗生長，而NO合成抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯[N（G）-nitro-Largininemethyl ester， L-NAME]和鎢酸鈉（sodiumtungstate， ST）則顯著降低種子的活力，阻止種子的萌發(fā)[17-20]。

水稻等禾谷類種子萌發(fā)時(shí)，所需的物質(zhì)能量來源于胚乳中淀粉降解的小分子物質(zhì)[21]。淀粉的降解可通過α-淀粉酶、β-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的共同作用實(shí)現(xiàn)，其中α-淀粉酶是貫穿被子植物生長周期和生命周期的關(guān)鍵酶，也是第一個(gè)附著在淀粉顆粒上的酶，可以釋放葡聚糖，進(jìn)一步降解底物，為發(fā)育中的胚提供營養(yǎng)物質(zhì)[22]。大多數(shù)水稻α-淀粉酶只在發(fā)育的種子胚中表達(dá)，并在種子萌發(fā)過程中被誘導(dǎo)[23]。

外源NO可通過提高七葉一枝花種子的淀粉酶活性，加速淀粉的溶解，促進(jìn)種子的萌發(fā)[24]，而SNP 可緩解鹽脅迫抑制蒺藜苜蓿種子中淀粉酶活性及淀粉水解的效應(yīng)[25]。

本研究通過藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)并結(jié)合表觀分析和指標(biāo)檢測等手段，探究AQPs、NO 對水稻種子萌發(fā)的影響，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 采用雜交品種博Ⅱ優(yōu)767 的水稻（Oryza sativa L.）種子，購自海南儋州種子站。選取大小均一、谷粒飽滿的水稻籽粒，剝?nèi)ス葰?，將余下的種子用0.1%高錳酸鉀消毒10 min。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別用90 mg/L HgCl2 、15 mmol/L L-NAME 和80 μmol/L ST 浸種水稻種子12 h 后，再設(shè)置以下8個(gè)處理：（1）H₂O（CK）；（2）90 mg/L HgCl₂（HgCl₂）；（3）15 mmol/LL-NAME（L-NAME）；（4）80 μmol/L ST（ST）；（5）200 μmol/L SNP（SNP）；（6）HgCl₂+SNP（90 mg/L HgCl₂ 預(yù)處理12h 后，將處理液換成200 μmol/L SNP）；（7）L-NAME+SNP（15 mmol/LL-NAME 預(yù)處理12h 后， 將處理液換成200 μmol/L SNP）；（8）ST+SNP（80 μmol/L ST預(yù)處理12h 后，將處理液換成200 μmol/L SNP）。

1.2 方法

1.2.1 種子萌發(fā)率的測定 在不同處理液中播種50 粒水稻種子，分別記錄20、24、36 h 下的種子露白數(shù)目。種子萌發(fā)率=對應(yīng)時(shí)間的露白數(shù)/供試種子總數(shù)×100%。

1.2.2 種子吸水量的測定 將水稻種子消毒后用蒸餾水清洗干凈，播種于分別盛有8 個(gè)處理液的培養(yǎng)皿中，并分別在0、8、16、24 h 吸干種子表面水分，稱取每個(gè)處理中所有種子的重量，計(jì)算每個(gè)處理時(shí)間段種子的吸水重量。每個(gè)培養(yǎng)皿中放置50 粒種子，加處理液7 mL。

1.2.3 胚根長和胚芽長的測定 隨機(jī)從每個(gè)處理中選取萌發(fā)4 d 的10 粒種子，用直尺測量胚根長及胚芽長，取其平均值。

1.2.4 總淀粉酶及α-淀粉酶的表觀活性測定 總淀粉酶表觀活性測定。取200 mL 蒸餾水置于微波爐加熱2 min，加入4 g 瓊脂粉及2 g 可溶性淀粉，制成培養(yǎng)基。隨機(jī)取不同處理萌發(fā)4 d 的水稻種子3 粒，將其去胚后，置于盛有液氮的小研缽中研磨，靜置20 min。取上層酶液20 μL，垂直滴至配好的培養(yǎng)基上，靜置15 min，加入10 mL的0.01 mol/L 碘-碘化鉀溶液，觀察淀粉酶與淀粉反應(yīng)形成的圓斑大小及亮度，并拍照記錄。

α-淀粉酶表觀活性測定。將4 g 瓊脂粉和0.5 g可溶性淀粉溶于198 mL 蒸餾水中，充分溶解后，分別加入0.06 g 的CaCl2、2 mL 10 mmol/L pH 5.3的醋酸緩沖液和4 mL 0.1 mol/L 的碘-碘化鉀溶液，混勻后倒入培養(yǎng)皿待用。隨機(jī)選取10 粒萌發(fā)4 d 的水稻種子進(jìn)行橫切，將帶有胚的一半種子接種在上述培養(yǎng)基上，25 ℃下放置12 h，觀察種子周圍白色斑點(diǎn)直徑大小及亮度，并拍照記錄。

1.2.5 淀粉含量的測定 待水稻種子萌發(fā)至第4天，稱取0.4 g 胚乳，用液氮進(jìn)行研磨，置于25 mL試管中，加入10 mL 1 mol/L 稀硫酸，沸水浴20 min。過濾后，取上清液0.5 mL 定容至50 mL。向試管中加入2 mL 待測液與1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，沸水浴5 min，定容至20 mL，并于540 nm 測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出其淀粉含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，用Microsoft Excle 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及處理，采用SPSS 23.0 軟件分析差異顯著性（Plt;0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 AQPs 和NO 對水稻種子吸水量的影響

由圖1 可知，隨著處理時(shí)間的延長，各處理的吸水量均呈現(xiàn)上升趨勢。在8 h，HgCl₂ 處理的種子其吸水量比對照的降低了11.89%；處理16 h，HgCl₂+SNP 結(jié)合處理的種子吸水量比單獨(dú)HgCl₂處理的提高了12.56%；處理24 h，與對照相比，單獨(dú)HgCl₂ 處理的種子吸水量降低了16.86%，而加入SNP 后的HgCl₂+SNP 處理的吸水量僅下降了7.61%，說明抑制AQPs 活性，水稻種子的吸水能力受阻，而SNP 則可逆轉(zhuǎn)HgCl₂ 對水稻種子吸水的阻礙。

在8 h，與對照的吸水量相比，SNP 處理的種子吸水量提高了3.53%，而L-NAME 與ST 處理的水稻種子的吸水量則分別下降了8.59% 和4.61%（Plt;0.05）；處理16 h，與對照的吸水量相比，L-NAME 與ST 處理的水稻種子的吸水量分別下降了13.07%和9.45%，而L-NAME+SNP 處理和ST+SNP 處理的吸水量僅分別降低了4.65%和2.73%；處理24 h，與L-NAME 處理的吸水量相比，L-NAME+SNP 結(jié)合處理的吸水量提高了10.51%，ST+SNP 結(jié)合處理的吸水量也比單獨(dú)ST處理的提高了9.17%。以上結(jié)果說明，抑制種子中AQPs 的活性，種子的吸水能力降低，而外源NO 則可以逆轉(zhuǎn)HgCl₂ 受抑的效應(yīng)。同樣，抑制NO 的合成對種子的吸水能力也造成一定的影響。

綜上可推測，在水稻種子早期吸水階段，NO可介導(dǎo)水稻種子中AQPs 運(yùn)輸水分。

2.2 AQPs 和NO 對水稻種子萌發(fā)率的影響

由圖2 可知，在20 h，HgCl₂+SNP 結(jié)合處理的種子萌發(fā)率比HgCl₂ 單獨(dú)處理的高16.66%（Plt;0.05），且這2 個(gè)處理的種子萌發(fā)率均比對照的低；在24 h，與單獨(dú)HgCl₂ 處理的萌發(fā)率相比，HgCl₂+SNP 處理的種子萌發(fā)率提高了20.00%；在36 h，HgCl₂ 及HgCl₂+SNP 兩個(gè)處理的種子萌發(fā)率與對照的一致，說明外源NO供體SNP 的加入可逆轉(zhuǎn)HgCl₂ 對水稻種子萌發(fā)的抑制效應(yīng)。在20h，與對照的種子萌發(fā)率相比，單獨(dú)SNP 處理的萌發(fā)率提高了10.66%，而NO 抑制劑L-NAME及ST 處理的萌發(fā)率則分別降低了28.00%和18.00%。加入SNP 后的L-NAME+SNP 結(jié)合處理的種子萌發(fā)率比單獨(dú)L-NAME 處理的提高了12.00%，ST+SNP 處理的種子萌發(fā)率比單獨(dú)ST 處理的提高了14.66%；在24 h，L-NAME+SNP 處理的種子萌發(fā)率比單獨(dú)L-NAME 處理的提高了12.00%，與單獨(dú)ST 處理的萌發(fā)率相比，ST+SNP處理的提高了6.66%，此時(shí)，ST+SNP 處理的萌發(fā)率與對照的一致；在36 h，各處理及對照的種子均具有相同的萌發(fā)率。以上結(jié)果說明，外源NO可促進(jìn)水稻種子的萌發(fā)，并緩解AQPs 活性抑制劑及NO 合成抑制劑對種子萌發(fā)的抑制效應(yīng)。

2.3 AQPs 和NO 對萌發(fā)水稻種子胚根長和胚芽長的影響

通過對圖3A 和圖3B 進(jìn)行分析可看出，加入SNP 后的HgCl2+SNP 處理的種子胚根及胚芽的長度比單獨(dú)HgCl₂ 處理的分別增加了2.50 倍和0.31倍，說明AQPs 活性抑制劑HgCl₂ 處理水稻種子后，均對胚根和胚芽的生長起到了抑制作用，而外源NO 供體SNP 則緩解了HgCl₂ 對胚根及胚芽的抑制效應(yīng)。此外，與對照處理的種子其胚根長相比，單獨(dú)L-NAME 及單獨(dú)ST 兩個(gè)處理的胚根長分別降低了59.52%和92.86%（Plt; 0.05），而與對照處理的胚芽長相比，SNP 單獨(dú)處理的胚芽增加了6.39%（Plt;0.05），單獨(dú)L-NAME 及單獨(dú)ST兩個(gè)處理的胚芽長分別下降了56.55%（Plt;0.05）和11.82%（Plt;0.05））。將外源NO 分別與NO 合成抑制劑L-NAME 和ST 組合的L-NAME+SNP及ST+SNP 兩個(gè)處理的胚根長與對照的胚根長相比分別僅降低了42.86%和35.71%（Plt;0.05），且L-NAME+SNP 處理及ST+SNP 處理的胚芽長比對照的胚芽長相比分別僅下降了8.63%和5.43%（Plt;0.05）。

從萌發(fā)種子外觀（圖3C）上看，HgCl₂、L-NAME 和ST 三個(gè)處理的胚根長和胚芽長均明顯短于對照，其中，ST 處理對水稻種子胚根生長的抑制幅度最大。相比于上述3 個(gè)處理的種子形態(tài)，加入外源NO 供體SNP 后的組合處理均緩解胚根及胚芽生長遲緩的效應(yīng)。說明抑制AQPs 的活性及內(nèi)源性NO 的合成會阻礙水稻種子胚根及胚芽的生長，而外源NO 供體SNP 則緩解這種抑制作用。

以上結(jié)果可推測，AQPs 和NO均可促進(jìn)水稻種子萌發(fā)過程中胚根及胚芽的生長，且AQPs 可能通過NO 發(fā)揮作用。

2.4 AQPs 和NO 對萌發(fā)水稻種子淀粉酶活性的影響

根據(jù)總淀粉酶表觀活性的測定方法，培養(yǎng)基上圓斑的亮度越大，表示總淀粉酶活性越強(qiáng)，因此，圓斑的明暗可代表總淀粉酶活性的強(qiáng)弱。由圖4A 可知，單獨(dú)SNP 處理的圓斑亮度是所有處理液中最亮的，而HgCl₂、L-NAME 和ST 三個(gè)處理的圓斑亮度都比對照的暗。分別加入SNP 后，含HgCl₂、L-NAME 和ST的3個(gè)處理均提高了圓斑的亮度。

使用Image J軟件將不同處理的圓斑亮度轉(zhuǎn)化成數(shù)值繪制柱形圖（圖4B），以便更直接地比較不同處理間的總淀粉酶相對活性。與對照相比，單獨(dú)HgCl₂ 處理的萌發(fā)水稻種子的總淀粉酶相對活性降低了24.77%，而加入SNP 后的HgCl₂+SNP處理的僅降低了8.18%，說明了AQPs 活性受抑制時(shí)，萌發(fā)水稻種子中總淀粉酶的活性減弱，外源NO則阻緩HgCl₂ 引起總淀粉酶活性的下調(diào)。單獨(dú)SNP 處理的萌發(fā)水稻種子其總淀粉酶相對活性比對照的高7.50%，而單獨(dú)L-NAME 處理和單獨(dú)ST 處理的萌發(fā)水稻種子的總淀粉酶相對活性分別比對照的低22.50%和16.36%。加入SNP 后，L-NAME+SNP 處理及ST+SNP處理的總淀粉酶相對活性分別比對照的降低了5.45%和3.41%。說明外源NO可顯著提高總淀粉酶活性，并緩解AQPs 活性抑制劑及NO合成抑制劑降低水稻種子總淀粉酶相對活性的效應(yīng)。

根據(jù)α-淀粉酶表觀活性的測定方法，培養(yǎng)基上白色斑塊的大小及亮度可代表α-淀粉酶活性的強(qiáng)弱，白色斑塊越大越亮表明α-淀粉酶活性越強(qiáng)。由圖4C 可知，在所有的處理中，單獨(dú)SNP 處理的萌發(fā)水稻種子其對應(yīng)的白斑直徑最大，亮度最亮，其次為對照的。單獨(dú)HgCl₂ 處理的白斑直徑最小，且亮度最暗，而HgCl₂+SNP 處理的白斑直徑比單獨(dú)HgCl₂ 處理的大且亮，說明抑制AQPs活性，α-淀粉酶活性受到顯著抑制，而這種抑制效應(yīng)可被外源NO供體SNP 所緩解。NO合成抑制劑L-NAME 及ST 分別單獨(dú)處理的白斑直徑比對照的小且暗，而加入SNP 后的L-NAME+SNP處理和ST+SNP 處理比單獨(dú)L-NAME、單獨(dú)ST處理的白斑直徑大且亮。說明AQPs 活性及NO合成受抑下，萌發(fā)水稻種子的α-淀粉酶活性大幅度降低，而且外源NO 均可適當(dāng)解除AQPs 活性抑制劑和NO 合成抑制劑對萌發(fā)水稻種子中α-淀粉酶活性的抑制作用。

上述結(jié)果說明，AQPs 活性及外源NO 均有助于提高萌發(fā)水稻種子中總淀粉酶及α-淀粉酶的活性。由此以上結(jié)果推測，NO 可通過介導(dǎo)AQPs 增強(qiáng)萌發(fā)水稻種子中總淀粉酶及α-淀粉酶的活性。

2.5 AQPs 和NO 對萌發(fā)水稻種子淀粉含量的影響

圖5顯示，單獨(dú)HgCl₂處理的萌發(fā)水稻種子其淀粉含量比對照的提高0.99倍，是所有處理中淀粉含量最高的，而加入SNP 后的HgCl2+SNP處理的萌發(fā)種子淀粉含量僅比對照的提高了0.39倍，說明抑制AQPs 的活性會顯著減弱其降解淀粉的能力，而這種能力的下降可由外源NO逆轉(zhuǎn)。單獨(dú)L-NAME 處理和單獨(dú)ST 處理的種子中淀粉含量分別比對照的高0.74倍和0.59倍；而L-NAME+SNP 處理及ST+SNP 處理的種子中淀粉含量則分別比單獨(dú)L-NAME 處理和單獨(dú)ST 處理的降低了25.41%和23.90%。說明抑制AQPs的活性及內(nèi)源性NO的合成會減少水稻種子中淀粉的降解，而SNP 既可顯著增加水稻種子中淀粉的降解，也可緩解AQPs 活性抑制劑及NO 合成抑制劑對淀粉降解的阻礙效應(yīng)。

3 討論

植物的AQPs 具有運(yùn)輸水分的功能，可通過協(xié)調(diào)細(xì)胞水分平衡，控制植物的生長，其活性受到HgCl₂ 的抑制[26-27]。研究表明，汞化合物影響AQPs功能是通過與NPA 基序的半胱氨酸殘基的-SH 基團(tuán)結(jié)合，引起AQPs 孔隙堵塞，從而影響AQPs活性[28]。在水分及鹽脅迫下，種子萌發(fā)及根系生長均受到明顯的抑制，而AQPs 轉(zhuǎn)基因植株及過表達(dá)系賦予植物脅迫耐受性，種子顯示出高活力，根長得到明顯改善[29-31]。在本研究中，采用AQPs活性抑制劑HgCl₂ 處理水稻種子后，種子吸水量減少，萌發(fā)率降低，胚根及胚芽的生長受到抑制，VANDER 等[32]的研究也得到與此類似的結(jié)果。而外源信號分子（如乙烯和NO）可通過增強(qiáng)白楊根及水稻種子的AQPs 轉(zhuǎn)錄水平，介導(dǎo)水分運(yùn)輸[33-34]。本研究結(jié)果表明，在AQPs 的活性受到抑制時(shí)，外源NO供體SNP 可提高HgCl₂ 處理后的吸水量，促進(jìn)水稻種子對水分的吸收，提高種子的萌發(fā)率。田又升等[35]的研究也顯示，NO 可解除HgCl₂ 對種子萌發(fā)的脅迫作用，與本研究結(jié)果一致。為了進(jìn)一步探究AQPs 與NO 在水稻種子萌發(fā)早期（0～24 h）的關(guān)系，采用NO 合成抑制劑L-NAME和ST 及NO 供體SNP 分別處理萌發(fā)水稻種子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)SNP 處理的水稻種子其吸水量及萌發(fā)率均明顯比對照的高，而抑制NO 的合成，種子的吸水能力受阻，萌發(fā)率亦隨之下降。因此，推測在水稻種子早期吸水階段，NO 可通過介導(dǎo)AQPs 活性，誘發(fā)水稻種子吸收水分，促進(jìn)種子發(fā)芽。

淀粉酶是淀粉類種子萌發(fā)過程最主要的水解酶類，主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。只有α-淀粉酶才能完成水稻種子中淀粉的降解[36]，其活性與水稻的發(fā)芽率和幼苗生長屬性高度相關(guān)[37-38]。外源NO 可增強(qiáng)高粱及小麥種子早期萌發(fā)過程中的淀粉酶活性，提高淀粉轉(zhuǎn)化能力，為種子的胚根及胚芽的伸長提供物質(zhì)基礎(chǔ)[39-40]。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)SNP 處理水稻種子后，其總淀粉酶及α-淀粉酶的活性均顯著上升，淀粉則快速降解，水稻種子胚芽得到較快的生長。HAJIHASHEMI 等[41]的研究表明，SNP 可顯著提高藜麥種子中α-淀粉酶的活性，并降低鹽脅迫對酶活性的影響，從而恢復(fù)種子的萌發(fā)進(jìn)程。本研究結(jié)果揭示，萌發(fā)水稻種子AQPs 活性受抑下，α-淀粉酶及總淀粉酶的活性均顯著下降，淀粉含量則維持在較高的水平，胚根及胚芽的生長也都被明顯抑制，外源NO 則可逆轉(zhuǎn)這些抑制效應(yīng)。與AQPs 活性受抑類似，NO 合成受到抑制后，萌發(fā)水稻種子的總淀粉酶及α-淀粉酶的活性均減弱，由此導(dǎo)致淀粉降解進(jìn)程減慢、胚根及胚芽的生長受阻，這些因抑制NO合成而引發(fā)的抑制效應(yīng)同樣可以被外源NO 所逆轉(zhuǎn)。有研究證實(shí)，NO 合成抑制劑L-NAME 及ST顯著抑制萵苣及玉米種子中的α-淀粉酶活性及其幼苗的生長，而SNP 可緩解這種抑制效應(yīng)[42-43]。

綜上可知，在水稻種子萌發(fā)的早期，NO 通過介導(dǎo)AQPs 調(diào)節(jié)種子的吸水，從而誘導(dǎo)α-淀粉酶及總淀粉酶的活性，促進(jìn)淀粉的降解及胚根、胚芽的生長，提高種子的萌發(fā)進(jìn)程。