摘" 要：為了確定豬丹毒疫苗的效力，本研究采用常規(guī)方法傳代豬丹毒桿菌強(qiáng)毒株C43-8株及C43-6株，在傳代菌液形態(tài)、純粹及活菌計(jì)數(shù)等相關(guān)檢驗(yàn)合格的基礎(chǔ)上給16～18 g昆明小鼠（簡(jiǎn)稱KM小鼠）、BALB/c小鼠、ICR（institute cancer research）小鼠注射不同數(shù)量的活菌，根據(jù)小鼠的死亡情況確定豬丹毒桿菌強(qiáng)毒株對(duì)不同品種小鼠的最小致死量。結(jié)果顯示，豬丹毒強(qiáng)毒株C43-8株對(duì)KM小鼠、BALB/c小鼠、ICR小鼠的最小致死量（minimum lethal dose，MLD）分別為20、25、15 CFU；豬丹毒強(qiáng)毒株C43-6株對(duì)上述三種小鼠的MLD分別為15、20、10 CFU。

關(guān)鍵詞：豬丹毒疫苗；效力檢驗(yàn)；豬丹毒桿菌C43-8株；豬丹毒桿菌C43-6株；最小致死量；小鼠

中圖分類號(hào)：S855.1+2" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2024）03-0081-05

豬丹毒（swine erysipelas）又稱“皮膚鉆石病”，是由豬丹毒桿菌引起的一種熱性、急性人畜共患病[1]。該菌在自然界廣泛分布，可感染多種哺乳動(dòng)物、禽和魚[2]。豬感染后在臨床上主要表現(xiàn)為高熱、急性敗血癥、皮膚疹塊（亞急性）、慢性疣狀心內(nèi)膜炎及皮膚壞死與多發(fā)性非化膿性關(guān)節(jié)炎（慢性）[3-5]。在20世紀(jì)80年代，豬丹毒與豬瘟、豬肺疫并稱為中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的三大傳染病[6]。臨床上，豬丹毒桿菌常與豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬肺炎支原體等病原體混合感染，同時(shí)還會(huì)造成人和其他多種動(dòng)物感染[7]。

目前，對(duì)豬丹毒的防治主要依靠疫苗和抗生素。但抗生素濫用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)藥物產(chǎn)生耐受性，且藥物殘留也會(huì)影響肉品安全，因此使用抗生素防治豬丹毒的措施越來越不可行。接種豬丹毒疫苗被認(rèn)為是防控該病一種經(jīng)濟(jì)有效的手段[8]。

效力檢驗(yàn)是評(píng)價(jià)豬丹毒疫苗保護(hù)效果的關(guān)鍵參數(shù)。根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2020年版）三部第41頁(yè)和第92頁(yè)“豬丹毒滅活疫苗”和“豬丹毒活疫苗”用小鼠效力檢驗(yàn)的要求：小鼠免疫疫苗后，對(duì)免疫小鼠和對(duì)照小鼠分別用豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株混合菌液進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為1個(gè)最小致死量（minimum lethal dose，MLD）或者1 000個(gè)最小致死量。因此，確定豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株對(duì)不同品種小鼠的最小致死量對(duì)豬丹毒疫苗效力檢驗(yàn)成功與否至關(guān)重要。本試驗(yàn)對(duì)不同品種小鼠注射不同劑量的豬丹毒桿菌C43-8株、C43-6株，根據(jù)小鼠的死亡情況確定豬丹毒桿菌C43-8株、C43-6株分別對(duì)不同品種小鼠的最小致死量，從而為豬丹毒疫苗的效力檢驗(yàn)提供可靠的依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1 菌株來源及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

豬丹毒桿菌1型C43-8株及2型C43-6株均為強(qiáng)毒株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；16～18 g昆明小鼠（簡(jiǎn)稱“KM小鼠”）小鼠、BALB/c小鼠、ICR（institute cancer research）小鼠購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 試驗(yàn)試劑

馬丁肉湯、鮮血瓊脂斜面、10％血清馬丁瓊脂平板均購(gòu)自北京中海生物科技有限公司；革蘭染色液購(gòu)自安徽雷根生物技術(shù)有限公司。

1.3 豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株的傳代

將凍干菌種豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株分別用馬丁肉湯稀釋，然后用接種環(huán)接種于鮮血瓊脂斜面，36～37 ℃培養(yǎng)24 h；隨后挑取菌落劃線于10％血清馬丁瓊脂平板上，36～37 ℃培養(yǎng)24～36 h，挑選中等大小光滑菌落20個(gè)混合于少量馬丁肉湯中，再接種鮮血斜面2根，經(jīng)36～37 ℃培養(yǎng)24 h；挑選一根菌落生長(zhǎng)旺盛的血斜面，用少量馬丁肉湯沖洗后接種于100 mL的馬丁肉湯中，36～37 ℃培養(yǎng)24 h，收獲菌液分別為試驗(yàn)用豬丹毒桿菌1型C43-8株和2型C43-6株強(qiáng)毒株菌液。

1.4 豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株菌液的檢測(cè)

豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株菌液的形態(tài)、純粹檢驗(yàn)及活菌計(jì)數(shù)等相關(guān)檢測(cè)按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2020年版）附錄進(jìn)行[9]。

1.5 豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株菌液最小致死量測(cè)定

將豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株分別稀釋為：5、10、15、20、25 CFU/0.2 mL。將55只16～18 g KM小鼠隨機(jī)分為11組，每組5只，第1～5組分別皮下注射不同稀釋劑量的豬丹毒桿菌1型C43-8株，第6～10組分別皮下注射不同稀釋劑量的豬丹毒桿菌2型C43-6株，每只小鼠注射0.2 mL，第11組為空白對(duì)照組（注射0.2 mL PBS緩沖液），觀察10 d，記錄小鼠的死亡情況，以致死整組小鼠的最少菌的數(shù)量為該菌株的MLD。BALB/c小鼠、ICR小鼠的重量、數(shù)量、分組及攻毒情況均與KM小鼠的相同。具體試驗(yàn)分組及攻毒情況見表1。

2" 結(jié)果

2.1 豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株的傳代

豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株通過鮮血斜面→10％血清馬丁瓊脂→鮮血斜面→馬丁肉湯的傳代獲得豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株菌液各100 mL。具體菌種傳代過程見圖1。

2.2 豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株菌液的檢測(cè)

2.2.1 性狀

經(jīng)革蘭染色后鏡檢觀察，豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株均為革蘭陽(yáng)性纖細(xì)小桿菌。具體檢測(cè)結(jié)果見圖2和圖3。

2.2.2 純粹檢驗(yàn)

經(jīng)純粹檢驗(yàn)判定傳代豬丹毒桿菌1型C43-8株和2型C43-6株純粹。具體檢測(cè)結(jié)果見圖4。

2.2.3 活菌計(jì)數(shù)

菌液經(jīng)馬丁肉湯10倍系列稀釋后接種于10％血清馬丁瓊脂平板，0.1 mL/塊，37 ℃培養(yǎng)后判定菌液的活菌數(shù)，具體檢測(cè)結(jié)果見表2。

2.3 豬丹毒桿菌1型C43-8及2型C43-6菌液的最小致死量的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)果表明，豬丹毒桿菌C43-8株對(duì)不同品種小鼠的最小致死量為：KM小鼠為20 CFU，BALB/c小鼠為25 CFU，ICR小鼠為15 CFU；豬丹毒桿菌C43-6株對(duì)不同品種小鼠的最小致死量為：KM小鼠為15 CFU，BALB/c小鼠為20 CFU，ICR小鼠為10 CFU。具體試驗(yàn)小鼠的死亡情況見表3。對(duì)照組小鼠沒有死亡。

3" 分析討論

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2018年5月19日正式啟動(dòng)實(shí)施獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)。獸用細(xì)菌類疫苗將逐漸取代抗生素，成為細(xì)菌類疫病防控的主力。細(xì)菌類疫苗的質(zhì)量控制，是保證其發(fā)揮有效防控效果的關(guān)鍵[10]。

小鼠對(duì)豬丹毒桿菌的毒力及免疫原性的反應(yīng)與豬的反應(yīng)呈正相關(guān)。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上現(xiàn)有的豬丹毒疫苗產(chǎn)品均用小鼠來評(píng)價(jià)疫苗的安全性及效力，國(guó)外研究學(xué)者也是用小鼠來評(píng)價(jià)丹毒桿菌保護(hù)性抗原的免疫效果[11-13]。

根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2020年版）三部對(duì)豬丹毒疫苗的效力檢驗(yàn)要求：對(duì)照組注射1個(gè)MLD的豬丹毒桿菌強(qiáng)毒株小鼠3只中至少死亡2只，對(duì)照組注射1 000個(gè)MLD的豬丹毒桿菌強(qiáng)毒株小鼠3只全部死亡。但是，在實(shí)際檢測(cè)過程中，往往受小鼠品種、菌液混合均勻度、注射劑量等不確定因素的影響，造成對(duì)照小鼠的死亡情況不符合規(guī)定。因此，本試驗(yàn)通過對(duì)KM小鼠、BALB/c小鼠、ICR小鼠三種不同品種小鼠注射不同劑量豬丹毒桿菌強(qiáng)毒株，測(cè)得豬丹毒桿菌C43-8株對(duì)上述三種小鼠的MLD分別為20、25、15 CFU，豬丹毒桿菌C43-6株的MLD分別為15、20、10 CFU。本試驗(yàn)結(jié)果為豬丹毒疫苗效力檢驗(yàn)成功提供可靠的數(shù)據(jù)參考。

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*作者簡(jiǎn)介：張俊平（1978－ ），女，碩士，從事動(dòng)物生物制品研發(fā)；E-mail：zhangjunping5259@sina.com

*通信作者：李春華（1974－ ），女，博士，研究員，主要從事畜禽病毒分子生物學(xué)及生物制品研究；E-mail：orchid_lee@sina.com