姚夢瑋，李玉遷，徐慶勝，方小菡，魏洪，遲茜文，劉蕊

1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州省普通高校學(xué)校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3.貴州省人民醫(yī)院病理科，貴州 貴陽 550002；4.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院紅巖院區(qū)中心實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550003

2020年，女性乳腺癌已超過肺癌，成為最常見的癌癥，新發(fā)病例數(shù)達(dá)2 261 419例，占總體癌癥發(fā)病的11.7%［1］。其中三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）占乳腺癌的15% ~ 20%［2］，由于缺乏雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和表皮生長因子受體2（epidermal growth factor receptor 2，HER2）的表達(dá)，與其他乳腺癌相比，其惡性等級高、轉(zhuǎn)移和侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差［3］。研究報(bào)道，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等特性與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）進(jìn)程密切相關(guān)［4］。目前，TNBC 的主要治療手段是手術(shù)切除聯(lián)合化療［5］，但其高轉(zhuǎn)移性及耐藥性的發(fā)生使療效不佳。

溶瘤病毒療法是一類新興的抗腫瘤治療方法，其能利用腫瘤細(xì)胞中抑癌基因失活或缺陷的特點(diǎn)，選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞。麻疹病毒（measles virus，MV）為生物療法應(yīng)用廣泛的溶瘤病毒，MV-Edm、MeV-SCD 等麻疹株已被證實(shí)具有抑制乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、4T1 等細(xì)胞株增殖的作用［6-7］。其中麻疹減毒活疫苗Hu191（MV-Hu191）株制備的疫苗在我國廣泛應(yīng)用于預(yù)防MV 感染近50年［8］，是一種有效安全的生物制劑［9］。自2012 年開始，先后報(bào)道了MV-Hu191 對胃癌［10］、結(jié)腸癌［11］、腎母細(xì)胞癌［12］等細(xì)胞株具有抑制其增殖及遷移能力，但未見MV-Hu191 株治療乳腺癌的相關(guān)報(bào)道。本研究通過體內(nèi)外試驗(yàn)檢測MV-Hu191 對TNBC 4T1 細(xì)胞EMT、增殖及遷移的影響，為治療TNBC 提供一種新的生物治療思路。

1 材料與方法

1.1 病毒及細(xì)胞株 MV-Hu191 株和Vero 細(xì)胞由貴州省疾病預(yù)防控制中心惠贈；鼠TNBC 細(xì)胞株4T1由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床研究中心惠贈。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 30只SPF級BALB／c小鼠，雌性，5~6周齡，體質(zhì)量（18 ± 2）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)溫度為22 ~ 25 ℃，濕度為50% ~ 80%，晝夜交替12 h 飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)（2200011）。

1.3 主要試劑及儀器 胎牛血清和10×青霉素鏈霉素購自以色列BI公司；高糖DMEM和胰蛋白酶EDTA購自美國Gibco 公司；紫杉醇（純度>98%）購自上海麥克林生化科技有限公司；CCK-8購自美國APExBIO公司；HE 染色試劑盒、瓊脂糖、高效RIPA 組織／細(xì)胞裂解液、結(jié)晶紫和SDS-PAGE 凝膠超快速配置試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；4%多聚甲醛溶液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；單克隆Anti-Ecadherin Rabbit pAb 購自美國Bioworld 公司；單克隆Anti-GAPDH Mouse pAb 購自美國Abcam 公司；多克隆Anti-MMP-2 Rabbit pAb 購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；多克隆Anti-MMP-9 Rabbit pAb購自美國SAB公司；Anti-Rabbit IgG 二抗購自美國Proteintech 公司；超特敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自德國Millipore公司；免疫組化染色試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio Tek 公司；多功能凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒擴(kuò)增 用含10%胎牛血清、10×青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4T1和Vero細(xì)胞。按3.0 g／L CCID50MV-Hu191感染Vero 細(xì)胞，1 周后收集病毒，采用聚乙二醇法濃縮，離心后棄上清，用無血清DMEM 重懸沉淀，分裝后置-80 ℃冰箱保存。采用Reed-Muench 法計(jì)算病毒滴度（TCID50）。

1.5 MV-Hu191對4T1細(xì)胞增殖影響的檢測

1.5.1 CCK-8 試驗(yàn) 將對數(shù)生長期的4T1 細(xì)胞按1×104個(gè)／mL接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為MV-Hu191處理組（加入MOI分別為1、5、10的MVHu191）和對照組（加入等量培養(yǎng)液），分別培養(yǎng)24、48 和72 h；每孔加入10 μL CCK-8 檢測液，孵育2 h，在酶標(biāo)儀波長490 nm 處檢測吸光度值。每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，計(jì)算平均值。

1.5.2 克隆形成試驗(yàn) 將4T1 細(xì)胞懸液接種于6 孔板中，5×105個(gè)／（孔·1 mL），細(xì)胞貼壁后加入不同MOI（1、10）的MV-Hu191，并設(shè)對照組（加入等量培養(yǎng)液），孵育2 h；棄去培養(yǎng)液，迅速加入45~50 ℃的2%瓊脂糖-10%DMEM 混勻液，每孔3 mL，待凝固后倒置培養(yǎng)3 d；4%多聚甲醛固定2 h；1%結(jié)晶紫染色20 min，觀察克隆數(shù)。

1.6 MV-Hu191對4T1細(xì)胞遷移能力影響的檢測 采用細(xì)胞劃痕愈合試驗(yàn)。將4T1 細(xì)胞懸液接種于6 孔板中，5×105個(gè)／（孔·2 mL），細(xì)胞鋪滿孔底90%時(shí)，用槍頭垂直與細(xì)胞板底部劃線，PBS 沖洗脫落細(xì)胞，加入不同MOI（1、10）的MV-Hu191，并設(shè)對照組（加入等量培養(yǎng)液），分別于培養(yǎng)0、24、48 h 時(shí)在倒置顯微鏡下觀察并拍照，利用Image J 軟件進(jìn)行分析，并按下式計(jì)算遷移率。

1.7 MV-Hu191 對4T1 細(xì)胞EMT 蛋白表達(dá)水平影響的檢測 采用Western blot法。用MOI=10的MVHu191 處理4T1 細(xì)胞48 h，并設(shè)對照組（加入等量培養(yǎng)液），收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液混勻，在冰上裂解1 h；4 ℃，12 000×g離心40 min，取上清，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。取等量蛋白上樣，經(jīng)8%SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移至PVDE 膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；TBST 洗膜3次，加入一抗（MMP-9和MMP-2 均1∶2 000 稀釋、E-cadherin 1∶1 000 稀釋、GAPDH 1∶10 000稀釋），4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜3次，加入二抗（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，ECL顯色。使用ImageJ軟件計(jì)算灰度值，以目的基因與內(nèi)參基因灰度值的比值作為目的基因表達(dá)量。

1.8 動物分組及處理 取對數(shù)生長期的4T1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)／mL，用脫毛膏脫去小鼠腋下至第2 對乳腺皮膚上的毛發(fā)，消毒皮膚，1 mL 注射器刺入小鼠腹壁左側(cè)第2 對乳頭皮下，輕輕挑起皮膚，每只注射100 μL 細(xì)胞懸液制備腫瘤模型［13］。每隔2 d稱量模型小鼠體質(zhì)量并測量腫瘤長徑和寬徑，計(jì)算腫瘤體積（0.5×長徑×寬徑2）。將模型小鼠分為對照組（PBS）、MV-Hu191（1×106TCID50）組和紫杉醇組（15 mg／kg），每組10 只。當(dāng)4T1 荷瘤小鼠腫瘤體積達(dá)100~200 mm3時(shí)，每2 d瘤內(nèi)注射藥物100 μL，連續(xù)給藥5次。28 d后麻醉處死小鼠，取腫瘤組織稱重，顯微鏡下計(jì)數(shù)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。

1.9 小鼠腫瘤組織和肺組織病理特征觀察 將各組小鼠腫瘤組織和肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，包埋，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，按HE染色試劑盒步驟常規(guī)染色，顯微鏡下觀察，拍照。

1.10 小鼠腫瘤組織EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測 采用免疫組化法。各組小鼠腫瘤組織經(jīng)4%多聚甲醛固定12~24 h，包埋，石蠟切片，二甲苯脫蠟，EDTA溶液進(jìn)行抗原修復(fù)，3% H2O2去離子水室溫孵育20 min；PBS 沖洗3次，加入10%山羊血清，室溫封閉20 min；分別加入一抗（MMP-9、MMP-2、E-cadherin 均1∶200稀釋），4 ℃濕盒孵育過夜；PBS沖洗3次，加入生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育20 min；PBS 沖洗3 次，加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育20 min；PBS 沖洗3 次，DAB 顯色，顯微鏡下觀察拍照，使用Image J軟件進(jìn)行處理。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Graphpad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 病毒滴度 MV-Hu191 感染Vero 細(xì)胞擴(kuò)增后的病毒滴度約為1×106.75TCID50。

2.2 MV-Hu191對4T1細(xì)胞增殖的影響

2.2.1 CCK-8試驗(yàn) MOI=10的MV-Hu191感染4T1細(xì)胞后24、48、72 h，細(xì)胞活力均顯著低于對照組（F分別為5.204、1.732和2.811，P均為0.001）；MOI=1和5 的MV-Hu191 感染4T1 細(xì)胞后72 h，細(xì)胞活力均顯著低于對照組（F分別為12. 944 和4. 467，P分別為0.023和0.001）。見圖1。表明MV-Hu191具有抑制4T1細(xì)胞增殖的作用，且呈時(shí)間劑量依賴性。

圖1 感染MV-Hu191后4T1細(xì)胞的活力Fig.1 4T1 cell viability after infection with MV-Hu191

2.2.2 克隆形成試驗(yàn) MV-Hu191感染4T1細(xì)胞72 h后的細(xì)胞病變效應(yīng)也呈劑量依賴性，見圖2。

圖2 MV-Hu191感染4T1細(xì)胞的克隆數(shù)（×10）Fig.2 Number of 4T1 cell clones infected with MV-Hu191（×10）

2.3 MV-Hu191對4T1細(xì)胞遷移能力的影響 MOI=10的MV-Hu191感染4T1細(xì)胞后24 h，細(xì)胞遷移率顯著低于對照組（F=5.609，P=0.042）；MOI=1 和10的MV-Hu191感染4T1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞遷移率均顯著低于對照組（F分別為13.619 和13.535，P分別為0.006 和0.002）。見圖3 和圖4。表明MV-Hu191 具有抑制4T1細(xì)胞遷移的作用。

圖3 4T1細(xì)胞遷移損傷區(qū)域（×100）Fig.3 4T1 cell migration to injured area（×100）

圖4 細(xì)胞遷移面積分析Fig.4 Cell migration area analysis

2.4 MV-Hu191對4T1細(xì)胞EMT蛋白表達(dá)水平的影響MV-Hu191 感染4T1 細(xì)胞48 h 后，與對照組相比，Ecadherin蛋白的表達(dá)量顯著上調(diào)（F=7.001，P=0.032），MMP-2 和MMP-9 蛋白的表達(dá)量顯著下調(diào)（F分別為45.433和9.744，P分別為0.011和0.038），見圖5和圖6。表明MV-Hu191可抑制4T1細(xì)胞EMT的發(fā)生。

圖5 Western blot 分析MV-Hu191 感染4T1 細(xì)胞后EMT蛋白的表達(dá)Fig.5 Western blot analysis of EMT protein expression in 4T1 cells infected with MV-Hu191

圖6 MV-Hu191感染4T1細(xì)胞后EMT蛋白的表達(dá)Fig.6 EMT protein expression in 4T1 cells infected with MV-Hu191

2.5 荷瘤小鼠生存期及腫瘤體積的變化 對照組、紫杉醇組和MV-Hu191組小鼠中位生存期分別為24、35和34 d，與對照組相比，MV-Hu191 組顯著高于對照組（F=18.079，P=0.000），見圖7。與對照組相比，MV-Hu191 組6 ~ 30 d 腫瘤體積增長速度明顯放緩（F=8.430，P=0.016），見圖8。與對照組相比，MVHu191 組腫瘤質(zhì)量顯著低于對照組（F= 8.301，P=0.003），見圖9 和圖10。表明MV-Hu191 具有降低4T1荷瘤小鼠腫瘤增殖作用，小鼠生存時(shí)間高于對照組，與紫杉醇接近。

圖7 4T1荷瘤小鼠生存率Fig.7 Survival rate of 4T1 tumor-bearing mice

圖8 4T1荷瘤小鼠腫瘤體積變化Fig.8 Changes in tumor volume of 4T1 tumor-bearing mice

圖9 4T1荷瘤小鼠腫瘤展示圖Fig.9 Tumor display image of 4T1 tumor-bearing mice

圖10 4T1荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量Fig.10 Tumor weight in 4T1 tumor-bearing mice

2.6 荷瘤小鼠肺結(jié)節(jié)數(shù)量 對照組、紫杉醇組和MVHu191 組小鼠肺結(jié)節(jié)數(shù)量分別為（24.00 ± 3.664）、（12.60±2.073）和（13.00±2.280）個(gè)，MV-Hu191組顯著低于對照組（F=33.792，P=0.000），與紫杉醇組接近，見圖11。提示MV-Hu191可能具有抑制4T1荷瘤小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

圖11 4T1荷瘤小鼠肺結(jié)節(jié)數(shù)量Fig.11 Number of pulmonary nodules（pieces）in 4T1 tumorbearing mice

2.7 荷瘤小鼠腫瘤組織和肺組織病理特征

2.7.1 腫瘤組織 對照組細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞連接稀疏，可見長梭或不規(guī)則樣改變，伴有血管形成；MVHu191 組細(xì)胞間隙小，細(xì)胞連接緊密，多見橢圓形或圓形，無血管形成；紫杉醇組細(xì)胞間隙減小，形態(tài)由長梭型向圓形轉(zhuǎn)化，部分腫瘤細(xì)胞萎縮裂解，壞死。見圖12。

圖12 各組小鼠腫瘤組織病理變化（HE染色，×400）Fig.12 Pathological changes of tumor tissue of mice in various groups（HE staining，×400）

2.7.2 肺組織 對照組肺組織結(jié)構(gòu)基本消失，滿視野大面積腫瘤細(xì)胞；MV-Hu191 組肺泡、肺泡囊等肺組織結(jié)構(gòu)多數(shù)完整，少見肺泡輪廓斷裂，腫瘤細(xì)胞浸潤；紫杉醇組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡和肺間隔清晰可見。見圖13。

圖13 各組小鼠肺組織病理變化（HE染色，×400）Fig.13 Pathological changes in lung tissue of mice in various groups（HE staining，×400）

2.8 荷瘤小鼠腫瘤組織EMT相關(guān)蛋白的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果顯示，MMP-2、MMP-9、E-cadherin 蛋白的陽性著色常位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，見圖14。與對照組相比，MV-Hu191 組腫瘤組織MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)下降（F分別為6.705和9.047，P分別為0.028和0.023），E-cadherin 蛋白表達(dá)上升（F= 3.468，P=0.039），但低于紫杉醇組，見圖15。表明MV-Hu191能調(diào)節(jié)4T1 荷瘤小鼠腫瘤組織EMT 通路蛋白表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)MV-Hu191 具有抑制4T1 腫瘤細(xì)胞遷移的作用。

圖14 各組小鼠腫瘤組織的免疫組化染色結(jié)果（×400）Fig.14 Immunohistochemical staining display of tumor tissue of mice in various groups（×400）

圖15 各組小鼠免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)比例Fig.15 Percentage of immunohistochemistry positive cells of mice in various groups

3 討論

乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的常見腫瘤。迄今為止，其在女性惡性腫瘤中發(fā)病率居第一位，造成了極大的疾病負(fù)擔(dān)。TNBC 由于缺乏ER、PR、HER2 表達(dá)，無法接受內(nèi)分泌治療，目前通常采用手術(shù)為主，輔助化療和放療，但放化療具有嚴(yán)重的毒副作用。因此，亟需一種有效的治療手段以定向精確靶位治療。MV 可特異性侵襲腫瘤細(xì)胞并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答發(fā)揮抗腫瘤的特性［14-15］，使其成為乳腺癌治療的一種新型方法。本研究探討了MV-Hu191體內(nèi)外干預(yù)4T1細(xì)胞增殖及遷移的作用，結(jié)果表明，其具有抑制4T1細(xì)胞增殖及遷移能力的作用，進(jìn)而抑制4T1荷瘤小鼠腫瘤進(jìn)展及延長小鼠生存期。FOY等［16-17］發(fā)現(xiàn)，MVFHER 溶瘤肽嵌合體對MDA-MB-468細(xì)胞的抑制率明顯增加，并延緩人TNBC MDA-MB-468乳腺癌小鼠模型腫瘤體積增長，免疫組化結(jié)果顯示，與遷移相關(guān)的微血管密度顯著減少；JING 等［18-19］改造的重組尿激酶受體麻疹溶瘤病毒（MV-uPA）作用4T1荷瘤小鼠后，小鼠生存期為35 d，對照組為25 d，同時(shí)，MV-uPA 延遲了4T1 荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移進(jìn)展，下調(diào)了EMT 相關(guān)基因［Delta 樣配體-4（D-like ligand 4，DLL-4）、血管生成素2（angiopoietin 2，Ang 2）、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule，PECAM）和免疫球蛋白樣EGF樣域酪氨酸激酶-1（tyrosine kinase with immunoglobulin like and EGF like domain protein 1，Tie-1）等］。上述研究表明，麻疹溶瘤病毒具有抑制TNBC轉(zhuǎn)移的作用，但具體機(jī)制尚未闡明。據(jù)此，本研究通過對腫瘤組織EMT通路蛋白進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)MV抑制TNBC轉(zhuǎn)移可能與EMT通路蛋白表達(dá)有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，EMT的異常激活與TNBC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［20-21］，MMP-2、MMP-9和E-cadherin等基因作為EMT 標(biāo)志物，已被證實(shí)與TNBC 侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，且是溶瘤病毒抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的信號通路和靶點(diǎn)之一［22-23］。ZHAO等［24］發(fā)現(xiàn)，溶瘤腺病毒rAd.DCN可下調(diào)腫瘤組織中核心蛋白聚糖靶基因，進(jìn)而降低EMT轉(zhuǎn)化標(biāo)志物VEGF表達(dá)水平，抑制4T1乳腺癌模型小鼠腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移；ANG 等［25］報(bào)道，溶瘤腺病毒Ad5F11bSP株可上調(diào)MDA-MB-231 模型小鼠腫瘤組織E-cadherin 水平，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移；SHI 等［26］報(bào)道，溶瘤水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）重組基質(zhì)蛋白干預(yù)4T1 乳腺小鼠后，腫瘤組織MMP-9表達(dá)減少。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，MV-Hu191 顯著上調(diào)了腫瘤組織EMT 通路蛋白Ecadherin，下調(diào)了MMP-2 和MMP-9 表達(dá)，與其他溶瘤病毒抑制乳腺癌遷移EMT蛋白表達(dá)一致?？梢奙VHu191抑制TNBC轉(zhuǎn)移可能與EMT蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究通過體內(nèi)外試驗(yàn)探討了MVHu191對乳腺癌4T1細(xì)胞荷瘤小鼠的影響，結(jié)果顯示，MV-Hu191 可明顯抑制4T1 細(xì)胞增殖及遷移，顯著減小4T1 荷瘤小鼠的腫瘤質(zhì)量及轉(zhuǎn)移肺結(jié)節(jié)數(shù)量，顯著延長了小鼠生存周期，其可能的初步機(jī)制與通過調(diào)節(jié)EMT 通路蛋白表達(dá)相關(guān)。本研究為MV-Hu191 作為TNBC 潛在的抗癌制劑研究奠定了基礎(chǔ)。但MVHu191如何調(diào)控EMT 通路蛋白及其上游調(diào)控分子及下游效應(yīng)分子具體作用靶點(diǎn)尚需深入研究。