吳小紅，趙丹華，劉欣玉，楊立宏，李玉華，曹守春

中國食品藥品檢定研究院蟲媒病毒疫苗室，北京 102629

SARS-CoV-2疫苗的研發(fā)及應(yīng)急使用有效遏制了COVID-19疫情的擴(kuò)散及特殊人群危重癥病例的發(fā)生。mRNA 疫苗作為新技術(shù)平臺疫苗，免疫后可激活人體細(xì)胞及體液免疫。研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 的有效清除主要依賴于T 細(xì)胞免疫［1-4］，而中和抗體可中和SARS-CoV-2，從而阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)增殖，對防控SARS-CoV-2感染引起的疾病具有重要作用［5-6］，是公認(rèn)的保護(hù)性抗體。另外，抗體水平與SARS-CoV-2 感染者癥狀嚴(yán)重程度之間也具有一定相關(guān)性［2，5］。

中和抗體水平的檢測方法主要包括需采用活病毒的噬斑減少中和試驗（plaque reduction neutralization test，PRNT）、微量細(xì)胞病變中和試驗（micro-cytopathic effect neutralization test，MCPENT）及假病毒中和試驗（pseudo virus-based neutralization assay，PBNA）［7-8］。國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)陸續(xù)開發(fā)了針對SARS-CoV-2 S1 蛋白中受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）及N-末端域（N-terminal domain，NTD）單抗原表位或多抗原表位的酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）進(jìn)行抗體檢測，與中和抗體檢測結(jié)果相關(guān)性較好［9-12］。目前，國內(nèi)外雖然尚未建議在疫情防控中對大規(guī)模SARS-CoV-2 疫苗接種后人群開展抗體監(jiān)測［13-14］，但免疫后中和抗體水平仍是疫苗研發(fā)和臨床評價過程中的重要參考指標(biāo)。本研究通過ELISA、MCPENT及PBNA 3種方法對SARS-CoV-2 mRNA疫苗免疫前后的健康人血清進(jìn)行檢測，評價采用ELISA 及PBNA 法代替MCPENT 法用于疫苗免疫原性評價的可能性，為SARS-CoV-2疫苗的臨床研究提供安全、快捷、有效的檢測手段，以期加快變異株疫苗的研發(fā)，快速應(yīng)對不斷出現(xiàn)的變異毒株帶來的風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 血清 40 名健康人（18 ~ 59 歲）免疫前及免疫SARS-CoV-2 mRNA 原型株疫苗2劑（間隔28 d）后15及28 d 的血清，共120 份，均由樹蘭（杭州）醫(yī)院提供，56 ℃水浴滅活30 min，≤-20 ℃保存。本研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，文件號為：2020倫審（31）號。

1.2 病毒及細(xì)胞 SARS-CoV-2 臨床分離原型株（1×106CCID50／mL）由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供；SARS-CoV-2 原型株假病毒及Vero 細(xì)胞均由中國食品藥品檢定研究院艾滋病疫苗室提供。

1.3 主要試劑及儀器 DMEM、胎牛血清、胰酶、HEPES、青-鏈霉素均購自美國Gibco公司；SARS-CoV-2 RBD IgG抗體檢測試劑盒購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司；熒光素酶檢測試劑、Promega GloMax 96孔板及化學(xué)發(fā)光檢測儀（Glomax navigator）均購自美國Promega公司。

1.4 檢測方法

1.4.1 ELISA法 將120 份血清用樣品稀釋液（試劑盒自帶）經(jīng)1∶40 稀釋后再2 倍系列稀釋至1∶2 560（未至陽性臨界值可繼續(xù)進(jìn)行2倍稀釋），每份樣品設(shè)2 個復(fù)孔，按SARS-CoV-2 RBD IgG 抗體檢測試劑盒說明書操作，采用酶標(biāo)儀檢測A450／630。A450／630≥0.10判為陽性，以陽性血清最大稀釋倍數(shù)按下式計算IgG抗體滴度及幾何平均滴度（geometric mean titer，GMT），IgG抗體滴度≥40時判為陽性，<40判為陰性。

1.4.2 PBNA法 于96孔板中將120份血清用DMEM完全培養(yǎng)基（含10%FBS、1%雙抗、25 mmol／L Hepes的DMEM高糖培養(yǎng)基）3倍系列稀釋至1∶7 290（高滴度抗體血清可繼續(xù)進(jìn)行3 倍稀釋），每份樣品設(shè)2 個復(fù)孔，100 μL／孔，加入SARS-CoV-2 原型株假病毒，50 μL／孔，于37 ℃中和1 h；加入Vero 細(xì)胞（2 ×105個／mL），100 μL／孔，于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)22～28 h；同時設(shè)細(xì)胞對照（僅加入細(xì)胞）及病毒對照（僅加入細(xì)胞和病毒），均設(shè)6個復(fù)孔；棄上清，加入熒光素酶檢測試劑，100 μL／孔，室溫避光反應(yīng)2 min；反復(fù)吹吸6～8次，每孔吸出100 μL液體，加入對應(yīng)Promega GloMax 96 孔板中，置化學(xué)發(fā)光檢測儀讀取發(fā)光值，并按下式計算中和抑制率，采用Reed Muench法計算EC50，從而得到抗體滴度，并計算GMT。血清抗體滴度≥30判為陽性，<30判為陰性［15-16］。

1.4.3 MCPENT法 于96孔板中用DMEM完全培養(yǎng)基對血清進(jìn)行2倍系列稀釋（1∶4～1∶1 024，高效價血清樣本可先經(jīng)10倍預(yù)稀釋后，再進(jìn)行2倍系列稀釋），加入SARS-CoV-2 臨床分離原型株病毒液，50 μL／孔，于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中和1 h；加入Vero細(xì)胞（1.5×105個／mL），100 μL／孔，繼續(xù)培養(yǎng)5 d；同時設(shè)陰性血清對照（加入內(nèi)控陰性血清及病毒和細(xì)胞）、病毒對照（僅加入病毒及細(xì)胞）及細(xì)胞對照（僅加入細(xì)胞）。Karber法計算中和終點，能保護(hù)50%細(xì)胞不受100 CCID50病毒感染的血清最高稀釋度即為血清中和抗體滴度，并計算GMT?？贵w滴度≥4判為陽性，<4判為陰性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0軟件及GraphPadPrism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Kappa系數(shù)對3 種不同方法進(jìn)行一致性分析，以P<0.05表示不同方法之間有一致性，Kappa值在0.6～0.8之間表明一致性較高；在0.8～1.0之間表明一致性極高。3種方法檢測的樣本陽性率比較采用卡方檢驗，免疫后血清抗體滴度比較采用t檢驗，均以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。將3 種方法檢測的陽性血清抗體滴度經(jīng)對數(shù)（Log）轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)（r）及線性回歸分析，采用Origin 2021軟件繪制線性擬合圖。

2 結(jié)果

2.1 3種方法檢測結(jié)果的一致性 MCPENT、PBNA和ELISA 法檢測40 份免疫前血清均為陰性；檢測80 份疫苗免疫后血清，結(jié)果為陽性分別為71、65及75份，陽性率分別為88.8%（71／80）、81.2%（65／80）及93.8%（75／80），陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.390，P>0.05）。3 種方法檢測120 份血清的符合率均達(dá)90%以上，Kappa系數(shù)均>0.7，P均<0.01，見表1。表明3種方法一致性較強(qiáng)。

表1 3種方法檢測120份血清結(jié)果的一致性Tab.1 Consistency analysis of 120 serum samples detected by three methods

2.2 3種方法檢測免疫后血清抗體滴度的比較 MCPENT、PBNA 和ELISA 法檢測80 份免疫后血清的抗體滴度分別為6～2 048、35～79 347、55～42 168，GMT分別為110、282、1 393，MCPENT與PBNA、PBNA與ELISA法檢測抗體滴度結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為1.565、0.850，P分別為0.120、0.397），ELISA 與MCPENT法差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.921，P<0.001）。

2.3 3種方法檢測抗體滴度的相關(guān)性 PBNA與MCPENT、ELISA 與MCPENT、ELISA 與PBNA 法陽性血清抗體滴度檢測結(jié)果r分別為0.902、0.846 及0.825，P均<0.01，見圖1。表明3 種方法檢測抗體滴度結(jié)果具有良好的相關(guān)性。

圖1 3種方法檢測陽性血清抗體滴度的線性擬合圖Fig.1 Linear fitting diagram of antibody titers in positive serum detected by three methods

3 討論

對病毒感染的保護(hù)性研究數(shù)據(jù)是疫苗研發(fā)和有效性評價的關(guān)鍵［17-18］，疫苗免疫后抗體的陽轉(zhuǎn)率及抗體滴度可用于評價疫苗的免疫原性［19-20］，為疫苗上市審批提供數(shù)據(jù)支持。檢測SARS-CoV-2 中和抗體水平的PRNT 及MCPENT 法均涉及活病毒操作，僅能在生物安全防護(hù)三級實驗室（biological safety protection third-level laboratory，BSL3）中進(jìn)行，給疫苗臨床評價帶來了一定困難。PBNA法更快速、操作更簡便，與活病毒法具有良好的相關(guān)性，已廣泛應(yīng)用于SARS-CoV-2 疫苗的臨床研究評價［21-22］。由于SARSCoV-2變異株不斷出現(xiàn)，病毒抗原表位的變異也在不斷變化，迄今為止尚未建立標(biāo)準(zhǔn)的中和抗體試驗法及公認(rèn)的檢測用標(biāo)準(zhǔn)病毒株［23］。目前用于疫苗臨床評價及疫苗效力評價的各種試驗方法之間存在一定差異，需進(jìn)行科學(xué)的分析和評估。針對疫苗免疫后的抗體水平監(jiān)測應(yīng)開發(fā)更簡便、有效的檢測方法［24］。

本研究收集的免疫前血清采自經(jīng)嚴(yán)格篩選進(jìn)入臨床研究的健康人群血清，3種方法檢測SARS-CoV-2疫苗免疫前SARS-CoV-2 抗體均為陰性，排除血清本底等干擾因素，使免疫后血清檢測結(jié)果更可靠。本研究采用MCPENT、PBNA、ELISA 3 種不同方法檢測免疫后80 份血清，抗體陽性率分別為88.8%、81.2%及93.8%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）。3 種方法檢測120 份血清樣品的抗體符合率達(dá)90%以上，陽性抗體滴度結(jié)果進(jìn)行Log 轉(zhuǎn)換后比較，3 種方法之間具有良好的相關(guān)性，PBNA 與MCPENT、ELISA 與MCPENT、ELISA與PBNA法抗體滴度檢測結(jié)果r分別為0.902、0.846及0.825（P均<0.001）；抗體滴度檢測結(jié)果經(jīng)t檢驗，MCPENT 與PBNA、PBNA 與ELISA法差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05），ELISA與MCPENT法差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。TOLAN 等［25］利用Roche 的ELISA 試劑對美國Moderna 公司的SARSCoV-2 mRNA 疫苗mRNA-1273 和美國輝瑞公司的BNT162b2 疫苗進(jìn)行免疫后血清檢測，結(jié)果顯示，ELISA 與PBNA 的相關(guān)性良好，r均≥0.85，與本研究結(jié)果相符。蔣國潤等［26］建立的ELISA 與MCPENT 法檢測抗體滴度的r為0.494。因此，ELISA 法檢測試劑中對于中和表位的選擇必須具有良好的代表性，需與活病毒檢測具有良好的相關(guān)性方可用于疫苗評價或疫苗免疫后抗體監(jiān)測。

本研究采用的3 種方法均可檢測到疫苗免疫后不同滴度的抗體。PBNA、ELISA 法用于檢測SARSCoV-2 疫苗免疫后的抗體陽性率與MCPENT 法差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），抗體滴度結(jié)果與MCPENT法有較強(qiáng)的相關(guān)性（P均<0.001），可用于臨床研究中SARS-CoV-2 mRNA 疫苗的免疫原性評價及疫苗免疫后抗體監(jiān)測。