SBA-15固定化黑曲霉脂肪酶對柚皮苷的區(qū)域選擇性?；?/h1>
2024-01-02 01:02姜麗艷董洪舉杜映達
合成化學 2023年12期
姜麗艷, 董洪舉, 杜映達
(吉林大學 生命科學學院,吉林 長春 130012)
柚皮苷又名柚皮素-7-O-新橙皮糖苷,是一種重要的天然類黃酮,具有顯著的抗氧化和抗癌活性[1-5],例如,柚皮苷可以減輕紅細胞膜脂質(zhì)過氧化和輻射損傷[6-7],還能抑制人膀胱癌細胞和乳腺癌細胞的活力和增殖等[8-9]。另外,最新研究還發(fā)現(xiàn)柚皮苷能預防和治療帕金森綜合癥等神經(jīng)退行性疾病,對神經(jīng)系統(tǒng)具有較好的保護作用[10]。但由于柚皮苷的溶解性和穩(wěn)定性較差,嚴重限制了其在精細化工、食品和醫(yī)藥等行業(yè)的廣泛應用[11-12]。目前,對柚皮苷進行結(jié)構(gòu)修飾,改善其生物利用度,提高其生理活性或增加新的功能,成為新藥研制的有效途徑之一。但是由于黃酮結(jié)構(gòu)中羥基較多,容易形成副產(chǎn)物,影響其反應的產(chǎn)率和選擇性。因此,尋找低毒、少污染、高選擇性以及高效的柚皮苷結(jié)構(gòu)修飾方法顯得尤為重要。
據(jù)文獻報道,利用催化效率高、反應條件溫和及環(huán)境友好的生物催化方法對黃酮類化合物進行結(jié)構(gòu)修飾[13],以提高其溶解性,改善生物利用度,賦予其特殊的生物功能一直是酶催化領(lǐng)域的研究熱點[14-15]。 KONTOGIANNI等[11]研究了Novozyme 435催化柚皮苷與中碳鏈脂肪酸酯化反應,表明了該酶的酯化反應具有區(qū)域選擇性,并遵循了Michaelis-Menten動力學。MELLOU等[16]也采用不飽和脂肪酸對柚皮苷進行了酯化反應,發(fā)現(xiàn)合成的酯具有更好的抗血管生成和抗腫瘤性能。此外,HATTORI等[17]的研究顯示,柚皮苷烷基酯具有較強的抗炎作用。然而酶的低穩(wěn)定性、難以回收和重復利用等缺點阻礙了柚皮苷的工業(yè)化生產(chǎn)。因此,把酶固定于載體上的固定化酶,不僅能夠克服游離酶的缺點,而且具有良好的穩(wěn)定性、易分離回收且能夠重復使用,同時酶的固定化也是酶催化研究的必要手段。
介孔材料SBA-15具有高度有序的孔道結(jié)構(gòu)、較大的孔徑以及表面富含活性羥基等一系列優(yōu)勢,在脂肪酶固定化的應用方面受到越來越廣泛的關(guān)注。為了加快柚皮苷的醫(yī)藥轉(zhuǎn)化進程,本研究聚焦領(lǐng)域熱點,采用介孔材料SBA-15將黑曲霉脂肪酶進行固定化處理,并用于柚皮苷的區(qū)域選擇性?；磻?圖1)。同時,考察了反應溶劑、?；w、水活度及反應溫度對柚皮苷?；磻挠绊?。在最佳的催化條件下,酶活最高(153±5 μmol·h-1·g-1),酶轉(zhuǎn)化率可達92.00%±2.43%,且該酶對柚皮苷的C-6′位置具有區(qū)域選擇性(>99%)。
圖1 固定化ANL催化柚皮苷的區(qū)域選擇性?；磻狥igure 1 Regioselective acylation of naringin catalyzed by immobilized ANL
1 實驗部分
1.1 儀器與試劑
ZJQ254型紫外檢測儀;BSA224S-CW型電子天平;Aqualab4 TE/TEV型水活度測定儀;AC500型核磁共振波譜儀;SKY-100C/100B型恒溫搖床;Agilent 1100型高效液相色譜儀;RE-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;AB5800型質(zhì)譜儀;Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀。
脂肪酶(Aspergillusnigerlipse, ANL)購自科創(chuàng)生物科技公司;SBA-15由吉林大學生命科學學院吳卓夫博士提供;柚皮苷購自Sigma公司。其余所用試劑均為分析級試劑,購自四平化學試劑有限公司。
1.2 固定化黑曲霉脂肪酶
介孔材料SBA-15是一種新型的酶固定化載體,具有高比表面積、均一的大孔徑分布和良好的水熱穩(wěn)定性,且孔內(nèi)表面的羥基對酶分子有較強的吸附能力,因此適合作為酶的固定化載體。用磷酸緩沖溶液將ANL預先配置為10 mg/mL, 60 mL的酶液,再與2 g孔徑為7.57 nm的SBA-15在燒瓶中混合,在pH=7.0、 30 ℃條件下機械攪拌24 h(8000 rpm, 5 min)。收集沉淀物,并采用磷酸緩沖溶液(3×60 mL)和相同的離心條件洗滌沉淀物,晾干過夜,得到固定化ANL。采用Bradford蛋白測定法測定固定化效率,測得SBA-15對ANL酶的吸附量為182 mg/g[18]。
1.3 酶促反應
柚皮苷的酶促乙?；磻w系為:柚皮苷0.20 mmol,?；w4.00 mmol,有機溶劑20 mL,混合在密封瓶中,0.4 nm分子篩干燥過夜。在混合物中加入適量的水,測定水活度。通過加入550 mg的固定化ANL開始反應。以不加酶的反應體系為空白試驗。反應結(jié)束時,將酶過濾即終止反應并將溶劑旋轉(zhuǎn)蒸干,0.22 μm微孔濾膜過濾。反應進程通過HPLC檢測。所有的實驗重復3次。值得注意地是,為了保持不同的水活度,每次水的加量不同,且此處的水不能定量。
1.4 水活度的測定
所有的反應試劑在133 Pa真空條件下預干燥12 h,在反應混合物中加入適量水維持一定的水活度。實驗中水活度通過水活度測定儀進行實時測量。
1.5 分析與結(jié)構(gòu)鑒定
該反應由高效液相色譜儀在330 nm波長下進行監(jiān)測。采用色譜柱(4.6 mm×250.0 mm×5.0 μm)進行分析。流動相為梯度甲醇水溶液(表1),流速為1.0 mL/min,柱溫為30 ℃,進樣量為10 μL,柚皮苷和其乙?；a(chǎn)物的保留時間分別為8.88 min和10.49 min。
表1 梯度洗脫程序Table 1 Details of the gradient programme
利用核磁共振波譜儀測1H和13C譜圖,內(nèi)標為四甲基硅烷,溶劑為氘代-DMSO,對柚皮苷衍生物進行結(jié)構(gòu)分析鑒定。實驗數(shù)據(jù)分析表明,柚皮苷非水相乙?；磻难苌餅?′-乙?；制ぼ?1H NMRδ: 12.06(d, 1H), 9.64(s, 1H), 7.33(d, 2H), 6.81(s, 2H), 6.12(d, 1H), 6.07(d, 1H), 5.55～5.41(m, 3H), 5.18(dd, 1H), 5.10(d, 1H), 4.74(d, 2H), 4.27(d, 1H), 4.04(dd, 1H), 3.76～3.67(m, 3H), 3.49(d, 2H), 3.36(s, 3H), 3.23～3.15(m, 2H), 2.72(dd, 1H), 1.92(s, 3H), 1.24(s, 3H);13C NMRδ: 18.5, 42.6, 63.7, 68.8, 70.4, 70.8, 70.9, 72.3, 74.1, 77.4, 79.3, 95.7, 96.8, 97.7, 101.0, 103.8, 115.6(2C), 128.9, 129.0, 129.1, 158.3, 163.3, 165.0, 170.6, 197.8。
2 結(jié)果與討論
2.1 ANL的固定化分析
傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析是利用骨架振動吸收譜帶的強度與吸收峰的位置來反應化合物的結(jié)構(gòu),根據(jù)振動峰所在的峰值位置來鑒定介孔材料骨架原子的類型以及基團變化等結(jié)構(gòu)信息。本實驗取適量的SBA-15、 ANL和固定化ANL樣品,采用溴化鉀壓片法,掃描范圍為400 cm-1～2000 cm-1。圖2為負載ANL前后的SBA-15樣品FT-IR譜圖。如圖2所示,在804 cm-1出現(xiàn)強烈的Si—O—Si對稱伸縮振動峰,1546 cm-1處的吸收峰可能是吸附水或是硅羥基的伸縮振動引起的吸收峰。通過比較SBA-15、游離的ANL和固定化ANL的FT-IR譜圖可以發(fā)現(xiàn),ANL吸附SBA-15后,吸收峰強度明顯下降,表明SBA-15表面的硅羥基與酶分子表面的氨基通過氫鍵進行吸附,ANL成功地負載于SBA-15上。
ν/cm-1
2.2 酰基供體對柚皮苷區(qū)域選擇性?；姆治?/h3>
?；w對柚皮苷?；挠绊?如表2所示。由表2可見,對所選用的?；w,固定化ANL對柚皮苷C-6′位點均表現(xiàn)出較好的區(qū)域選擇性(>99%),以乙酸乙烯酯為?；w時酶活最高(153±5 μmol·h-1·g-1)。但長鏈酰基供體在空間上阻礙了反應,降低了酶活,該現(xiàn)象與JIANG[19]和WANG等[20]的發(fā)現(xiàn)是一致的。因此,以下實驗均選用乙酸乙烯酯作為柚皮苷非水相酶促乙?；磻淖罴氧；w。
表2 ?；w對柚皮苷區(qū)域選擇性酰基化的影響*Table 2 Effect of acyl donor on the regioselective acylation of naringin
2.3 反應介質(zhì)對柚皮苷區(qū)域選擇性?；姆治?/h3>
有機溶劑作為反應介質(zhì)對非水相酶催化有著重要的影響,這不僅是由于有機溶劑決定了反應物在其中的溶解度及擴散限制,而且在一定程度上有機溶劑也會影響脂肪酶的催化活性。大量研究表明,有機溶劑對脂肪酶催化活性及選擇性的影響主要與有機溶劑的極性有關(guān)[21-22]。溶劑疏水性參數(shù)logP值,即分配系數(shù)的對數(shù),為某一溶劑在正辛醇與水相中的分配比例。
本實驗選擇了7種不同極性的有機溶劑來探究反應介質(zhì)對柚皮苷乙?；磻挠绊?。由表3的結(jié)果可知,固定化ANL在反應介質(zhì)為丙酮時催化柚皮苷的乙?；磻钚宰罡?153±5 μmol·h-1·g-1)。而固定化ANL在極性較強的二甲基亞砜中,幾乎不發(fā)生柚皮苷的酶促反應,可能是由于強極性的有機溶劑具有很強的親水性,使它們具有很強的剝奪酶表面必需水的能力,酶表面的必需水可以保持酶分子構(gòu)象的靈活性,而這種構(gòu)象的靈活性對于酶的催化活性是至關(guān)重要的。環(huán)己烷的極性過弱,導致底物不易進入酶分子的必須水層,從而影響酶的催化活性,由此可見,只有當反應溶劑的logP值在適宜的范圍內(nèi),ANL才能呈現(xiàn)最高的酶活。
表3 反應介質(zhì)對柚皮苷區(qū)域選擇性?；挠绊?Table 3 Effect of reaction medium on the regioselective acylation of naringin
2.4 水活度對柚皮苷區(qū)域選擇性?；姆治?/h3>
非水相酶催化反應體系中需要1個最適合的含水量,用以維持酶分子完整的空間構(gòu)象結(jié)構(gòu)。水活度(aw)即反應體系中水的蒸氣壓與純水的蒸氣壓之比,用以表示酶分子結(jié)合水量的多少[23]。實驗進一步研究了aw對柚皮苷區(qū)域選擇性?；挠绊?反應條件為:丙酮20 mL,柚皮苷0.2 mmol,乙酸乙烯酯4 mmol,固定化ANL550 mg,反應溫度為40 ℃,aw的實驗范圍為0.05～1.00,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,當aw的值為0.60時,固定化ANL催化柚皮苷的酶活達到峰值(153±5 μmol·h-1·g-1),而進一步提高或降低水活度會明顯降低酶活。aw過低時酶的催化活性差,可能是由于在非水相酶催化的反應中,需要一定的必需水來使酶維持適當?shù)臉?gòu)象以保持其催化活性,而過低的水活度會使固定化ANL處在過于“剛化”的構(gòu)象,抑制了酶與柚皮苷及乙酸乙烯酯“誘導契合”的過程,所以酶活較低。當aw的值大于0.60時,可能會由于水活度的增加導致酶分子的聚合,限制底物到達酶的活性部位;或在過高的水活度下,固定化ANL會展現(xiàn)出過度“柔性”的構(gòu)象,而酶可能過于靈活而無法保持其合適的構(gòu)象,導致酶活降低[24-25]。因此,本實驗選擇aw=0.60作為固定化ANL催化柚皮苷乙?；磻淖钸m水活度。
水活度圖3 水活度對柚皮苷區(qū)域選擇性?；挠绊慒igure 3 Effect of water activity on the the regioselective acylation of naringin
2.5 溫度對柚皮苷區(qū)域選擇性?；姆治?/h3>
溫度也是影響酶性能的重要因素[26],因此本文在丙酮為20 mL,柚皮苷為0.2 mmol,乙酸乙烯酯為4 mmol,固定化ANL為550 mg,aw=0.60的條件下,研究了溫度對柚皮苷區(qū)域選擇性?；挠绊?結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,固定化ANL酶活在40 ℃時最高(153±5 μmol·h-1·g-1),而隨著反應溫度的進一步增加,酶催化活性則有明顯降低。催化溫度低于40 ℃時,隨著反應溫度的升高,一方面反應體系內(nèi)的底物和酶分子運動速度加快,增加了酶和底物分子碰撞機率,有助于形成“酶-底物”復合物,從而提高了反應速率;另一方面,隨著溫度的增加,固定化ANL會產(chǎn)生波動來緩解反應的空間斥力,在高溫下這種波動也可能會導致反應速度的增加[19, 27-28]。然而,當溫度大于40 ℃時,溫度進一步增加可能會破壞脂肪酶分子的構(gòu)象,因為高溫可能會引起非共價鍵的破壞,從而導致酶活的顯著降低[29]。因此,本文選擇40 ℃作為固定化ANL酶催化柚皮苷乙?；磻淖钸m反應溫度。
溫度/℃圖4 溫度對柚皮苷區(qū)域選擇性?；磻挠绊慒igure 4 Effect of temperature on the regioselective acylation of naringin
2.6 反應的時間過程
為了檢測在丙酮為20 mL,柚皮苷為0.2 mmol,乙酸乙烯酯為4 mmol,固定化ANL為550 mg,aw=0.60,反應溫度為40 ℃的最優(yōu)催化條件下,柚皮苷非水相酶促乙酰化反應的時間進程,在催化反應的過程中間隔取樣,進行反應產(chǎn)物實時分析。柚皮苷非水相酶促乙?；磻臅r間進程如圖5所示。從圖5可以看出,在最優(yōu)催化條件下,在起始反應時間為0～4 h內(nèi),柚皮苷乙?；苌锏暮铣伤俣群芸?隨著催化反應時間的延長,柚皮苷乙?；苌锛眲≡黾?在反應時間為12～24 h內(nèi),柚皮苷乙酰化衍生物呈緩慢增加的趨勢。在催化反應延長至32 h時,柚皮苷乙酰化衍生物的轉(zhuǎn)化率達到最大92.00%±2.43%。值得注意地是,整個反應過程中只檢測到1種柚皮苷乙酰化衍生物。由此可見,固定化ANL催化柚皮苷乙?；磻哂懈叨鹊奈恢眠x擇特異性。
時間/h圖5 柚皮苷的區(qū)域選擇性?；磻M程Figure 5 Time course of the regioselective acylation of naringin
2.7 固定化ANL的重復利用性分析
固定化酶的重復利用可以在工業(yè)生產(chǎn)中節(jié)約成本。本實驗于最優(yōu)反應條件下,在每個周期反應結(jié)束后離心回收固定化ANL(10000 rpm, 5 min, 4 ℃),經(jīng)洗滌后,20 ℃條件下晾干。然后在接下來的反應中反復應用回收酶?；厥彰傅幕钚耘c第1個周期的酶活(100%)進行對比。由表4所示結(jié)果表明,在重復利用5次以后,固定化酶的殘留活力仍可保持最初酶活力的91.40%,表明固定化ANL有一定的操作穩(wěn)定性。但由于物理吸附的作用力較弱,經(jīng)過多次的反應、抽濾和洗滌后,一部分酶分子從孔道中脫落,因而酶活力有所下降。
表4 固定化ANL的可重復性Table 4 Reusability of the immobilized ANL
酶的固定化一直是酶工程領(lǐng)域的研究熱點。本研究采用SBA-15固定化ANL實現(xiàn)了柚皮苷的區(qū)域選擇性?；磻?。研究表明:固定化ANL催化柚皮苷的特異性乙?；磻荃；w、反應溶劑、水活度和反應溫度的影響。固定化ANL酶促柚皮苷的非水相乙?；磻淖罴压に嚄l件為:反應溶劑為丙酮(20 mL),?；w為乙酸乙烯酯(4 mmol),水活度為0.60,反應溫度為40 ℃。在此最佳反應條件下,固定化ANL的最高酶活為153±5 μmol·h-1·g-1,最大轉(zhuǎn)化率為92.00%±2.43%,且固定化ANL對柚皮苷的C-6′位置具有區(qū)域選擇性(>99%)?？梢?固定化ANL在柚皮苷非水相酶促乙?；磻斜憩F(xiàn)了高催化活性、高區(qū)域選擇性及較好的穩(wěn)定性和重復使用性的特點。
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介孔材料SBA-15具有高度有序的孔道結(jié)構(gòu)、較大的孔徑以及表面富含活性羥基等一系列優(yōu)勢,在脂肪酶固定化的應用方面受到越來越廣泛的關(guān)注。為了加快柚皮苷的醫(yī)藥轉(zhuǎn)化進程,本研究聚焦領(lǐng)域熱點,采用介孔材料SBA-15將黑曲霉脂肪酶進行固定化處理,并用于柚皮苷的區(qū)域選擇性?；磻?圖1)。同時,考察了反應溶劑、?；w、水活度及反應溫度對柚皮苷?；磻挠绊?。在最佳的催化條件下,酶活最高(153±5 μmol·h-1·g-1),酶轉(zhuǎn)化率可達92.00%±2.43%,且該酶對柚皮苷的C-6′位置具有區(qū)域選擇性(>99%)。
圖1 固定化ANL催化柚皮苷的區(qū)域選擇性?；磻狥igure 1 Regioselective acylation of naringin catalyzed by immobilized ANL
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1.2 固定化黑曲霉脂肪酶
介孔材料SBA-15是一種新型的酶固定化載體,具有高比表面積、均一的大孔徑分布和良好的水熱穩(wěn)定性,且孔內(nèi)表面的羥基對酶分子有較強的吸附能力,因此適合作為酶的固定化載體。用磷酸緩沖溶液將ANL預先配置為10 mg/mL, 60 mL的酶液,再與2 g孔徑為7.57 nm的SBA-15在燒瓶中混合,在pH=7.0、 30 ℃條件下機械攪拌24 h(8000 rpm, 5 min)。收集沉淀物,并采用磷酸緩沖溶液(3×60 mL)和相同的離心條件洗滌沉淀物,晾干過夜,得到固定化ANL。采用Bradford蛋白測定法測定固定化效率,測得SBA-15對ANL酶的吸附量為182 mg/g[18]。
1.3 酶促反應
柚皮苷的酶促乙?；磻w系為:柚皮苷0.20 mmol,?；w4.00 mmol,有機溶劑20 mL,混合在密封瓶中,0.4 nm分子篩干燥過夜。在混合物中加入適量的水,測定水活度。通過加入550 mg的固定化ANL開始反應。以不加酶的反應體系為空白試驗。反應結(jié)束時,將酶過濾即終止反應并將溶劑旋轉(zhuǎn)蒸干,0.22 μm微孔濾膜過濾。反應進程通過HPLC檢測。所有的實驗重復3次。值得注意地是,為了保持不同的水活度,每次水的加量不同,且此處的水不能定量。
1.4 水活度的測定
所有的反應試劑在133 Pa真空條件下預干燥12 h,在反應混合物中加入適量水維持一定的水活度。實驗中水活度通過水活度測定儀進行實時測量。
1.5 分析與結(jié)構(gòu)鑒定
該反應由高效液相色譜儀在330 nm波長下進行監(jiān)測。采用色譜柱(4.6 mm×250.0 mm×5.0 μm)進行分析。流動相為梯度甲醇水溶液(表1),流速為1.0 mL/min,柱溫為30 ℃,進樣量為10 μL,柚皮苷和其乙?；a(chǎn)物的保留時間分別為8.88 min和10.49 min。
表1 梯度洗脫程序Table 1 Details of the gradient programme
利用核磁共振波譜儀測1H和13C譜圖,內(nèi)標為四甲基硅烷,溶劑為氘代-DMSO,對柚皮苷衍生物進行結(jié)構(gòu)分析鑒定。實驗數(shù)據(jù)分析表明,柚皮苷非水相乙?；磻难苌餅?′-乙?；制ぼ?1H NMRδ: 12.06(d, 1H), 9.64(s, 1H), 7.33(d, 2H), 6.81(s, 2H), 6.12(d, 1H), 6.07(d, 1H), 5.55～5.41(m, 3H), 5.18(dd, 1H), 5.10(d, 1H), 4.74(d, 2H), 4.27(d, 1H), 4.04(dd, 1H), 3.76～3.67(m, 3H), 3.49(d, 2H), 3.36(s, 3H), 3.23～3.15(m, 2H), 2.72(dd, 1H), 1.92(s, 3H), 1.24(s, 3H);13C NMRδ: 18.5, 42.6, 63.7, 68.8, 70.4, 70.8, 70.9, 72.3, 74.1, 77.4, 79.3, 95.7, 96.8, 97.7, 101.0, 103.8, 115.6(2C), 128.9, 129.0, 129.1, 158.3, 163.3, 165.0, 170.6, 197.8。
2 結(jié)果與討論
2.1 ANL的固定化分析
傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析是利用骨架振動吸收譜帶的強度與吸收峰的位置來反應化合物的結(jié)構(gòu),根據(jù)振動峰所在的峰值位置來鑒定介孔材料骨架原子的類型以及基團變化等結(jié)構(gòu)信息。本實驗取適量的SBA-15、 ANL和固定化ANL樣品,采用溴化鉀壓片法,掃描范圍為400 cm-1～2000 cm-1。圖2為負載ANL前后的SBA-15樣品FT-IR譜圖。如圖2所示,在804 cm-1出現(xiàn)強烈的Si—O—Si對稱伸縮振動峰,1546 cm-1處的吸收峰可能是吸附水或是硅羥基的伸縮振動引起的吸收峰。通過比較SBA-15、游離的ANL和固定化ANL的FT-IR譜圖可以發(fā)現(xiàn),ANL吸附SBA-15后,吸收峰強度明顯下降,表明SBA-15表面的硅羥基與酶分子表面的氨基通過氫鍵進行吸附,ANL成功地負載于SBA-15上。
ν/cm-1
2.2 酰基供體對柚皮苷區(qū)域選擇性?；姆治?/h3>
?；w對柚皮苷?；挠绊?如表2所示。由表2可見,對所選用的?；w,固定化ANL對柚皮苷C-6′位點均表現(xiàn)出較好的區(qū)域選擇性(>99%),以乙酸乙烯酯為?；w時酶活最高(153±5 μmol·h-1·g-1)。但長鏈酰基供體在空間上阻礙了反應,降低了酶活,該現(xiàn)象與JIANG[19]和WANG等[20]的發(fā)現(xiàn)是一致的。因此,以下實驗均選用乙酸乙烯酯作為柚皮苷非水相酶促乙?；磻淖罴氧；w。
表2 ?；w對柚皮苷區(qū)域選擇性酰基化的影響*Table 2 Effect of acyl donor on the regioselective acylation of naringin
2.3 反應介質(zhì)對柚皮苷區(qū)域選擇性?；姆治?/h3>
有機溶劑作為反應介質(zhì)對非水相酶催化有著重要的影響,這不僅是由于有機溶劑決定了反應物在其中的溶解度及擴散限制,而且在一定程度上有機溶劑也會影響脂肪酶的催化活性。大量研究表明,有機溶劑對脂肪酶催化活性及選擇性的影響主要與有機溶劑的極性有關(guān)[21-22]。溶劑疏水性參數(shù)logP值,即分配系數(shù)的對數(shù),為某一溶劑在正辛醇與水相中的分配比例。
本實驗選擇了7種不同極性的有機溶劑來探究反應介質(zhì)對柚皮苷乙?；磻挠绊?。由表3的結(jié)果可知,固定化ANL在反應介質(zhì)為丙酮時催化柚皮苷的乙?；磻钚宰罡?153±5 μmol·h-1·g-1)。而固定化ANL在極性較強的二甲基亞砜中,幾乎不發(fā)生柚皮苷的酶促反應,可能是由于強極性的有機溶劑具有很強的親水性,使它們具有很強的剝奪酶表面必需水的能力,酶表面的必需水可以保持酶分子構(gòu)象的靈活性,而這種構(gòu)象的靈活性對于酶的催化活性是至關(guān)重要的。環(huán)己烷的極性過弱,導致底物不易進入酶分子的必須水層,從而影響酶的催化活性,由此可見,只有當反應溶劑的logP值在適宜的范圍內(nèi),ANL才能呈現(xiàn)最高的酶活。
表3 反應介質(zhì)對柚皮苷區(qū)域選擇性?；挠绊?Table 3 Effect of reaction medium on the regioselective acylation of naringin
2.4 水活度對柚皮苷區(qū)域選擇性?；姆治?/h3>
非水相酶催化反應體系中需要1個最適合的含水量,用以維持酶分子完整的空間構(gòu)象結(jié)構(gòu)。水活度(aw)即反應體系中水的蒸氣壓與純水的蒸氣壓之比,用以表示酶分子結(jié)合水量的多少[23]。實驗進一步研究了aw對柚皮苷區(qū)域選擇性?；挠绊?反應條件為:丙酮20 mL,柚皮苷0.2 mmol,乙酸乙烯酯4 mmol,固定化ANL550 mg,反應溫度為40 ℃,aw的實驗范圍為0.05～1.00,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,當aw的值為0.60時,固定化ANL催化柚皮苷的酶活達到峰值(153±5 μmol·h-1·g-1),而進一步提高或降低水活度會明顯降低酶活。aw過低時酶的催化活性差,可能是由于在非水相酶催化的反應中,需要一定的必需水來使酶維持適當?shù)臉?gòu)象以保持其催化活性,而過低的水活度會使固定化ANL處在過于“剛化”的構(gòu)象,抑制了酶與柚皮苷及乙酸乙烯酯“誘導契合”的過程,所以酶活較低。當aw的值大于0.60時,可能會由于水活度的增加導致酶分子的聚合,限制底物到達酶的活性部位;或在過高的水活度下,固定化ANL會展現(xiàn)出過度“柔性”的構(gòu)象,而酶可能過于靈活而無法保持其合適的構(gòu)象,導致酶活降低[24-25]。因此,本實驗選擇aw=0.60作為固定化ANL催化柚皮苷乙?；磻淖钸m水活度。
水活度圖3 水活度對柚皮苷區(qū)域選擇性?；挠绊慒igure 3 Effect of water activity on the the regioselective acylation of naringin
2.5 溫度對柚皮苷區(qū)域選擇性?；姆治?/h3>
溫度也是影響酶性能的重要因素[26],因此本文在丙酮為20 mL,柚皮苷為0.2 mmol,乙酸乙烯酯為4 mmol,固定化ANL為550 mg,aw=0.60的條件下,研究了溫度對柚皮苷區(qū)域選擇性?；挠绊?結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,固定化ANL酶活在40 ℃時最高(153±5 μmol·h-1·g-1),而隨著反應溫度的進一步增加,酶催化活性則有明顯降低。催化溫度低于40 ℃時,隨著反應溫度的升高,一方面反應體系內(nèi)的底物和酶分子運動速度加快,增加了酶和底物分子碰撞機率,有助于形成“酶-底物”復合物,從而提高了反應速率;另一方面,隨著溫度的增加,固定化ANL會產(chǎn)生波動來緩解反應的空間斥力,在高溫下這種波動也可能會導致反應速度的增加[19, 27-28]。然而,當溫度大于40 ℃時,溫度進一步增加可能會破壞脂肪酶分子的構(gòu)象,因為高溫可能會引起非共價鍵的破壞,從而導致酶活的顯著降低[29]。因此,本文選擇40 ℃作為固定化ANL酶催化柚皮苷乙?；磻淖钸m反應溫度。
溫度/℃圖4 溫度對柚皮苷區(qū)域選擇性?；磻挠绊慒igure 4 Effect of temperature on the regioselective acylation of naringin
2.6 反應的時間過程
為了檢測在丙酮為20 mL,柚皮苷為0.2 mmol,乙酸乙烯酯為4 mmol,固定化ANL為550 mg,aw=0.60,反應溫度為40 ℃的最優(yōu)催化條件下,柚皮苷非水相酶促乙酰化反應的時間進程,在催化反應的過程中間隔取樣,進行反應產(chǎn)物實時分析。柚皮苷非水相酶促乙?；磻臅r間進程如圖5所示。從圖5可以看出,在最優(yōu)催化條件下,在起始反應時間為0～4 h內(nèi),柚皮苷乙?；苌锏暮铣伤俣群芸?隨著催化反應時間的延長,柚皮苷乙?；苌锛眲≡黾?在反應時間為12～24 h內(nèi),柚皮苷乙酰化衍生物呈緩慢增加的趨勢。在催化反應延長至32 h時,柚皮苷乙酰化衍生物的轉(zhuǎn)化率達到最大92.00%±2.43%。值得注意地是,整個反應過程中只檢測到1種柚皮苷乙酰化衍生物。由此可見,固定化ANL催化柚皮苷乙?；磻哂懈叨鹊奈恢眠x擇特異性。
時間/h圖5 柚皮苷的區(qū)域選擇性?；磻M程Figure 5 Time course of the regioselective acylation of naringin
2.7 固定化ANL的重復利用性分析
固定化酶的重復利用可以在工業(yè)生產(chǎn)中節(jié)約成本。本實驗于最優(yōu)反應條件下,在每個周期反應結(jié)束后離心回收固定化ANL(10000 rpm, 5 min, 4 ℃),經(jīng)洗滌后,20 ℃條件下晾干。然后在接下來的反應中反復應用回收酶?；厥彰傅幕钚耘c第1個周期的酶活(100%)進行對比。由表4所示結(jié)果表明,在重復利用5次以后,固定化酶的殘留活力仍可保持最初酶活力的91.40%,表明固定化ANL有一定的操作穩(wěn)定性。但由于物理吸附的作用力較弱,經(jīng)過多次的反應、抽濾和洗滌后,一部分酶分子從孔道中脫落,因而酶活力有所下降。
表4 固定化ANL的可重復性Table 4 Reusability of the immobilized ANL
酶的固定化一直是酶工程領(lǐng)域的研究熱點。本研究采用SBA-15固定化ANL實現(xiàn)了柚皮苷的區(qū)域選擇性?；磻?。研究表明:固定化ANL催化柚皮苷的特異性乙?；磻荃；w、反應溶劑、水活度和反應溫度的影響。固定化ANL酶促柚皮苷的非水相乙?；磻淖罴压に嚄l件為:反應溶劑為丙酮(20 mL),?；w為乙酸乙烯酯(4 mmol),水活度為0.60,反應溫度為40 ℃。在此最佳反應條件下,固定化ANL的最高酶活為153±5 μmol·h-1·g-1,最大轉(zhuǎn)化率為92.00%±2.43%,且固定化ANL對柚皮苷的C-6′位置具有區(qū)域選擇性(>99%)?？梢?固定化ANL在柚皮苷非水相酶促乙?；磻斜憩F(xiàn)了高催化活性、高區(qū)域選擇性及較好的穩(wěn)定性和重復使用性的特點。
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