樊榮輝 陳藝荃 鐘淮欽 葉秀仙

摘要要：【目的】為金線蓮（Anoectochilus roxburghii）從DNA分子水平上探索葉色突變體的遺傳差異?！痉椒ā坎捎肊ST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)金線蓮及其2個(gè)葉色突變體進(jìn)行分子鑒定?！窘Y(jié)果】20對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出78條譜帶，其中3對(duì)引物（JXL-6、JXL-14和JXL-16）能穩(wěn)定擴(kuò)增出差異條帶，多態(tài)性條帶9條，多態(tài)性比率11.54％?！窘Y(jié)論】獲得的2個(gè)葉色突變體為金線蓮?fù)蛔凅w，葉色突變體與親本在DNA分子水平差異較小。

關(guān)鍵詞：金線蓮；自然突變；分子標(biāo)記鑒定；SSR

中圖分類號(hào)：S567.239 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：2095-5774（2023）04-0281-05

Identification of Molecular ID of Leaf Color Mutants in Anoectochilus roxburghii

by EST-SSR Molecular Markers

Fan Ronghui1，Chen Yiquan2，Zhong Huaiqin1*，Ye Xiuxian1*

（1Institute of Crop Sciences，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Science/Fujian Engineering Research Center for Characteristic Floriculture，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350013，China；

2 Institute of Agricultural Engineering Technology ，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Science，F(xiàn)uzhou ，F(xiàn)ujian 350003，China）

Abstract：【Objective】 This study aimed to explore genetic differences of leaf color mutants of Anoectochilus roxburghii at the DNA level. 【Method】 Molecular identification of Anoectochilus roxburghii and its two leaf color mutants was conducted by EST-SSR molecular markers. 【Result】 The results showed that 20 pairs of SSR primers produced 78 bands，3 pairs of primers （JXL-6，JXL-14 and JXL-16） could stably amplify differential bands. Nine bands were polymorphic produced in 20 pairs of SSR primers and polymorphism ratio was 11.54%. 【Conclusion】 Two leaf color mutants were identified as mutants of Anoectochilus roxburghii. However，there were small differences between mutants and parents at DNA molecular level.

Key word： Anoectochilus roxburghii；Natural mutation；Molecular marker identification；SSR

突變體，與傳統(tǒng)雜交后代相比，具有變異性狀多樣化、能穩(wěn)定遺傳品種現(xiàn)有優(yōu)良性狀、選育簡便快捷等優(yōu)勢(shì)，在育種中占有非常重要的地位。因此，突變是豐富種質(zhì)庫的重要途徑，也是新品種選育的有效途徑。

因環(huán)境因素引起的飾變產(chǎn)生的表觀遺傳同樣會(huì)影響本種的表型，為明晰所獲得的突變材料是否為DNA遺傳變異引起，除了進(jìn)行表型穩(wěn)定性觀測(cè)外，還有必要進(jìn)行遺傳鑒定。DNA分子標(biāo)記技術(shù)是以基因組核苷酸的多態(tài)性為基礎(chǔ)，在分子水平上直接反映遺傳變異的標(biāo)記，具有準(zhǔn)確度高、不受環(huán)境影響且能早期快速鑒定等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于作物分子輔助育種、遺傳多樣性分析和品種鑒定等方面［1-4］。目前常用的DNA標(biāo)記技術(shù)有SRAP、RAPD、ISSR、RFLP、AFLP和SSR等［5-8］。SSR是一類由幾個(gè)核苷酸（一般為1～6個(gè)）為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。根據(jù)來源不同，SSR分為基因組SSR和植物表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（ expressed sequence tags SSR，EST-SSR）。EST- SSR標(biāo)記是基于表達(dá)序列標(biāo)簽開發(fā)微衛(wèi)星的一種新型分子標(biāo)記，因此除了具有基因組SSR的共顯性遺傳、多態(tài)性強(qiáng)、分布隨機(jī)等優(yōu)點(diǎn)外，還具有通用性和保守性更強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)［9］。EST- SSR已廣泛用于南瓜（Cucurbita moschata）［10］、鐵皮石斛（Dendrobium officinale）［11］等多種作物的品種鑒定和遺傳多樣性分析。

金線蓮（Anoectochilus roxburghii），又名金線蘭、金線草等，為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，主要分布在福建、浙江、云南和臺(tái)灣等地區(qū)［12］。具清熱解毒、消炎止痛等功效，是中國傳統(tǒng)的珍貴藥材［13］。金線蓮以組培快繁作為主要繁殖方式，在組培快繁過程中較易產(chǎn)生自然突變，本團(tuán)隊(duì)在組培過程中獲得2個(gè)金線蓮葉色突變體，具有一定的觀賞價(jià)值。本研究采用SSR技術(shù)對(duì)2個(gè)葉色突變體進(jìn)行鑒定，以確定遺傳變異的影響因素，并從分子水平上對(duì)金線蓮新品種選育提供科學(xué)依據(jù)和參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

金線蓮母株（J-1）在組培快繁過程中自然突變一株中間金黃色葉色突變體（J-2），中間金黃色葉色突變體（J-2）在組培快繁過程中又自然突變出全金黃色葉色突變體（J-3）（圖1）。3個(gè)樣品在組培瓶中培養(yǎng)3個(gè)月，取葉片，液氮速凍，-80℃保存。

1.2基因組DNA提取

金線蓮DNA的提取采用CTAB法，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度，分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，樣品濃度調(diào)至50 ng/μL，備用。

1.3 SSR 鑒定

使用20對(duì)SSR引物對(duì)金線蓮3個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，引物名稱分別為JXL-1至JXL-20。所用引物為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中篩選的SSR引物，轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)已上傳NCBI（NCBI SRA accession PRJNA594793）。PCR反應(yīng)體系（25 μL）： 10 × PCR buffer 2.5 μL，2.5 M dNTP 2 μL，Taq DNA 聚合酶0.15 μL，10 mM上游引物1 μL，10mM下游引物1 μL，50 ng/μL DNA 1 μL，ddH2O

17.35 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s、51 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，適合的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步在全自動(dòng)核酸蛋白分析儀（ LabChip GX Touch 24，美國 PerkinElmer 公司） 上檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

采用20對(duì)SSR引物對(duì)金線蓮母株及2個(gè)葉色突變體基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出78條譜帶，有3對(duì)引物（JXL-6、JXL-14和JXL-16）擴(kuò)增出明亮、清晰、穩(wěn)定且有差異的條帶，用于葉色突變體的鑒定分析，其多態(tài)性條帶數(shù)9條，多態(tài)性比率11.54％（表1，圖2）。

結(jié)果顯示，中間金黃色葉色突變體（J-2）與金線蓮母株（J-1）的擴(kuò)增條帶相似度很高，只有引物JXL-6和JXL-14能穩(wěn)定擴(kuò)增出差異條帶，并且多態(tài)性條帶數(shù)少，表明兩者在 DNA 分子水平存在較小程度的差異，遺傳背景高度相似，也進(jìn)一步表明中間金黃色葉色突變體（J-2）可能為金線蓮母株（J-1）的自然突變體。全金黃色葉色突變體（J-3）是從中間金黃色葉色突變體（J-2）中再次突變而來，分子標(biāo)記擴(kuò)增條帶表明，二者相似度較高，全金黃色葉色突變體（J-3）與金線蓮母株（J-2）相似度稍降低，引物JXL-6、JXL-14和JXL-16均能穩(wěn)定擴(kuò)增出差異條帶，且多態(tài)性條帶數(shù)目稍多，在 DNA 分子水平上也存在較大差異。聚類分析表明，中間金黃色葉色突變體（J-2）和金線蓮母株（J-1）親緣關(guān)系最近，聚為一類，全金黃色葉色突變體（J-3）遺傳距離稍遠(yuǎn)。

3討論

目前，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已成為鑒定作物親本與后代遺傳差異的一種快速、有效和準(zhǔn)確的方法。SSR分子標(biāo)記具有重復(fù)性、通用性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，在后代鑒定中具有很大優(yōu)勢(shì)，已在多種植物中廣泛應(yīng)用［14，15］。

李小孟等（2016）利用SSR引物SS15和TAA27將芽變的真龍柚從沙田柚中鑒別出來，初步確定真龍柚是由沙田柚遺傳物質(zhì)改變產(chǎn)生的［16］。馮濤等（2017）應(yīng)用SSR分子標(biāo)記對(duì)小白桃及其早熟芽變品種津柳早紅基因組DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，找到了UDP96-008、CPPCT 022、BPPCT 028、 UDP98-411、UDP96-99 等5個(gè)多態(tài)性標(biāo)記［17］。胡冬梅等（2021）利用SSR技術(shù)成功鑒定了溫州蜜柑的芽變材料及其親本［18］。本研究采用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)金線蓮母株及2個(gè)葉色突變體進(jìn)行分析，結(jié)果表明，中間金黃色葉色突變體與金線蓮母株在DNA分子水平上差異很小，遺傳背景和親緣關(guān)系更近，可能為金線蓮母株的突變體。全金黃色葉色突變體與中間金黃色葉色突變體遺傳距離更近，而與金線蓮母株相比，遺傳距離較遠(yuǎn)，可能由于全金黃色葉色突變體是從黃綠相間的中間金黃色突變體中再次突變而來，這與其性狀表現(xiàn)高度一致。本研究利用全自動(dòng)核酸蛋白分析儀進(jìn)行分析，與傳統(tǒng)的聚丙烯酰氨凝膠電泳法相比，具有譜帶大小準(zhǔn)確，靈敏度高和用量小等優(yōu)點(diǎn)，能更加準(zhǔn)確顯示遺傳差異性。

余周源對(duì)小麥39個(gè)突變體進(jìn)行聚類分析，性狀相近突變體聚在同一簇下，性狀不相近突變體遺傳距離稍遠(yuǎn)［19］。本研究對(duì)金線蓮母株及2個(gè)葉色突變體進(jìn)行聚類分析，中間金黃色葉色突變體和金線蓮母株親緣關(guān)系最近，全金黃色葉色突變體（J-3）遺傳距離稍遠(yuǎn)。此外，本研究為后續(xù)相關(guān)基因的挖掘，揭示葉色突變機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：馮新）