劉貝寧 李劉敏 陳發(fā)興

摘要要：【目的】利用RAPD分子標(biāo)記對(duì)觀賞春石斛的遺傳多樣性進(jìn)行分析?！痉椒ā恳?0份觀賞春石斛種質(zhì)資源為供試材料，采用100條RAPD隨機(jī)引物進(jìn)行篩選?！窘Y(jié)果】從篩選出來的15條具有良好多態(tài)性的引物中擴(kuò)增得到125個(gè)DNA條帶，其中80個(gè)條帶表現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)性位點(diǎn)比率為63.89%。聚類分析結(jié)果顯示，在相似系數(shù)為0.37時(shí)10份樣本分為兩大類，在相似系數(shù)0.41時(shí)可進(jìn)一步分為兩個(gè)亞類群?！窘Y(jié)論】利用RAPD分子標(biāo)記可以鑒別觀賞春石斛種質(zhì)資源。

關(guān)鍵詞：春石斛；種質(zhì)資源；RAPD標(biāo)記；多態(tài)性

中圖分類號(hào)：S682.31 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：2095-5774（2023）04-0257-08

Genetic Diversity Analysis of Ornamental Spring Dendrobium Based

on RAPD Molecular Markers

Liu Beining1， Li Liumin2， Chen Faxing2*

（1 International College，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China;

2 College of Horticulture，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China）

Abstract：【Objective】 The genetic diversity of Dendrobium was analyzed using RAPD molecular markers. 【Method】 Using 10 ornamental spring Dendrobium germplasm resources as test materials， 100 RAPD random primers were used for screening. 【Result】125 DNA bands were amplified from 15 primers with good polymorphism， of which 80 bands showed polymorphism， and the ratio of polymorphic sites was 63.89%. The results of cluster analysis showed that 10 samples can be divided into two groups when the similarity is 0.37， and further divided into two groups when the similarity coefficient is 0.41. This study can provide theoretical basis for the breeding of ornamental Dendrobium. 【Conclusion】 RAPD molecular markers can accurately identify ornamental spring Dendrobium germplasm resources.

Key Words：Spring Dendrobium；Germplasm resources；RAPD marker；Polymorphism

石斛屬（Dendrobium）為蘭科（Orchidaceae）第二大屬植物，全球范圍內(nèi)有1400余種［1］。中國(guó)石斛屬植物有100余種［2］，其中13種為我國(guó)特有種，包括鐵皮石斛（Dendrobium officinale）和霍山石斛（Dendrobium huoshanense）［3］。石斛屬植物包括藥用石斛和觀賞石斛，藥用石斛在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久，最早記載于東漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》，其在糖尿病、心血管疾病、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等疾病的治療上應(yīng)用潛力巨大［4］；觀賞石斛有著豐富獨(dú)特的花型、花色及圖案，以及別具一格的花香，受到消費(fèi)者的青睞。近些年來，石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展主要依賴于野生石斛種質(zhì)資源，石斛新品種的選育較少，且多集中在藥用石斛 ［5］。觀賞春石斛多作為盆栽供室內(nèi)觀賞，在春節(jié)前作為年宵花上市，因其形態(tài)雍容華貴，具有高雅尊貴的氣質(zhì)，被人們稱為“成功之花”。

分子標(biāo)記在植物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用于品種鑒定、遺傳關(guān)系鑒定、遺傳多樣性檢測(cè)、遺傳圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域［6］。當(dāng)前已有許多模式植物完成全基因組測(cè)序，為分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)［7］。目前石斛屬的分子標(biāo)記研究集中在原生種、秋石斛栽培種及藥用價(jià)值較高的石斛，而尚未見到觀賞春石斛相關(guān)的研究報(bào)道。本研究通過RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)10份供試觀賞春石斛進(jìn)行聚類分析，以期進(jìn)一步評(píng)價(jià)觀賞春石斛種間的遺傳多樣性，為觀賞春石斛種質(zhì)資源的準(zhǔn)確鑒別提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為10份觀賞春石斛種質(zhì)（表1、圖1），由泉州市泉豐生物科技有限公司提供。

參照《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南 石斛屬》［8］，對(duì)供試觀賞春石斛表觀性狀進(jìn)行觀測(cè)描述，結(jié)果見表2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 觀賞春石斛葉片DNA提取

選取觀賞春石斛新鮮葉片，采用翌圣生物科技（上海）股份有限公司植物DNA試劑盒提取基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA的提取質(zhì)量進(jìn)行觀察，檢測(cè)基因組條帶有無及完整性。使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度、OD260/OD280值，選取OD260/OD280值在1.8～2.0的樣品進(jìn)行后續(xù)RAPD-PCR擴(kuò)增。

1.2.2 觀賞春石斛PCR體系優(yōu)化

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定PCR體系為15 μL的體系，其中：模板DNA 3 μL，RAPD引物3 μL，PCRmix酶7 μL，ddH2O 2 μL。選擇模板DNA濃度、引物濃度、退火溫度3個(gè)條件進(jìn)行單因素梯度優(yōu)化，各因素水平如表3。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸3 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72℃延伸6 min。采用1×TAE配制1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，電泳條件為120 V，90 mA，25 min左右，時(shí)間根據(jù)溴酚藍(lán)指示劑的位置進(jìn)行控制。

1.3 觀賞春石斛遺傳多樣性分析

本研究使用的RAPD 隨機(jī)引物 100 條由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。對(duì)RAPD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將清晰可重復(fù)的條帶記為“1”，將同一位置上的弱帶、不重復(fù)或沒有出現(xiàn)的條帶記為“0”。建立“1”、“0”數(shù)據(jù)矩陣，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增出的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)，計(jì)算各個(gè)引物的多態(tài)性比率。采用Ntsys 2.10e進(jìn)行聚類分析［8］。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 觀賞春石斛基因組DNA提取與分析

所有DNA電泳結(jié)果如圖2所示。電泳結(jié)果顯示，DNA條帶明亮、無雜帶和彌散情況，表明得到的DNA完整，沒有或較少降解，可在后續(xù)用作RAPD標(biāo)記的模板。

超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定10份觀賞春石斛的DNA濃度及質(zhì)量結(jié)果見表4，由于不同品種石斛之間多糖含量的差異，所提取的石斛基因組DNA濃度差距較大，在42.032～170.406 ng/μL不等，多集中在60～100 ng/μL。OD260 /OD280均在1.8～2.0，進(jìn)一步表明提取得到的基因組DNA沒有或較少降解，純度較高，可用作RAPD標(biāo)記的模板。

2.2 觀賞春石斛RAPD-PCR體系優(yōu)化

RAPD-PCR體系中模板DNA濃度優(yōu)化結(jié)果見圖3，當(dāng)DNA濃度為12 ng/μL時(shí)，條帶相對(duì)更加明亮、清晰，數(shù)量最多，效果最好。

對(duì)引物濃度的優(yōu)化結(jié)果見圖4，引物濃度為9 μmol/L時(shí)擴(kuò)增得到的條帶數(shù)最多、效果最清晰。因此，RAPD-PCR體系的引物濃度選用9 μmol/L。

對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果見圖5，退火為38.3℃時(shí)擴(kuò)增得到的條帶數(shù)最多、條帶最為清晰明亮。因此，RAPD-PCR體系的退火溫度選用38.3℃。

綜上分析，觀賞春石斛RAPD的最佳反應(yīng)體系為15 μL的體系包括：9 μmol/L的引物3 μL，

12 ng/μL的模板DNA 3 μL，PCRmix酶7 μL，ddH2O 2 μL。

2.3 觀賞春石斛引物多態(tài)性分析

先選取表觀差異較大的‘潑墨皇后和‘黃金巴比倫對(duì)100條隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，得到20條在這兩種石斛中均能擴(kuò)增得到三條及以上條帶數(shù)的引物（圖6）。進(jìn)一步篩選得到15個(gè)具有良好多態(tài)性的引物，從篩選出來的15個(gè)具有良好多態(tài)性的引物中擴(kuò)增得到125條DNA條帶，每個(gè)引物擴(kuò)增所得的條帶數(shù)量在6到11之間（見表5）。其中，80條DNA條帶表現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)性位點(diǎn)比率為63.89%。

2.4 觀賞春石斛聚類分析

根據(jù)10份觀賞春石斛的形態(tài)學(xué)特征對(duì)其進(jìn)行分類。其中，除‘甜蜜之月和‘紅火鳥外其他石斛唇瓣均有眼結(jié)構(gòu)；‘拿坡里、潑墨皇后、‘中華夢(mèng)和‘櫻花美人的萼片及花瓣圖案模式均為鑲邊；潑墨皇后和中華夢(mèng)之間的性狀相似程度最高；黃金巴比倫與紅火鳥的花均較小，且花瓣為窄橢圓形，唇瓣圖案模式均有網(wǎng)狀，與其他8份種質(zhì)均差別明顯。

使用NTsys 2.10e對(duì)0，1矩陣進(jìn)行分析，利用非加權(quán)平均法（UPGMA）得到10份觀賞春石斛的聚類分析圖（圖7），在相似性系數(shù)為0.37時(shí)可以將10份種質(zhì)分為兩大類：第Ⅰ類包括黃金巴比倫和紅火鳥，這兩份種質(zhì)花直徑均較小，花瓣形狀相同，唇瓣圖案均具有網(wǎng)狀模式，其余石斛種質(zhì)中沒有相同花瓣形狀及唇瓣圖案；此兩份種質(zhì)的表觀性狀相似程度高，且與其他8份石斛種質(zhì)有著明顯區(qū)別，唇瓣圖案具有網(wǎng)狀模式，花直徑也較小，也是兩者獨(dú)有的表觀性狀特征。

第Ⅱ類在相似性系數(shù)為0.41時(shí)又可分為兩個(gè)亞類群（第Ⅰ亞類和第Ⅱ亞類），第Ⅰ亞類包括‘變異國(guó)王、櫻花美人、‘紅星，第Ⅱ亞類包括拿坡里、甜蜜之月、潑墨皇后、中華夢(mèng)和‘紅小町。潑墨皇后與中華夢(mèng)相似度最高，這兩份石斛屬于觀賞春石斛中的潑墨石斛，其花朵的顏色類型和顏色數(shù)量十分相似、花瓣與萼片圖案模式、唇瓣眼類型與唇瓣圖案模式均存在高度相似。變異國(guó)王和紅星在表觀性狀上也有著部分相似，唇瓣眼類型及圖案模式相同，且與其余供試石斛種質(zhì)差別明顯。因此，RAPD標(biāo)記顯示供試觀賞春石斛種質(zhì)資源間具有豐富的遺傳多樣性，且可以使用RAPD分子標(biāo)記對(duì)觀賞春石斛進(jìn)行初步分類。

3 ?討論與小結(jié)

張楊等［9］采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)金釵石斛、鐵皮石斛和齒瓣石斛等三種石斛進(jìn)行研究，從分子水平揭示這三種石斛屬植物的遺傳背景。朱勝男等［10］采用RAPD技術(shù)對(duì)31種石斛屬植物的遺傳多樣性進(jìn)行分析，證明RAPD標(biāo)記技術(shù)可以用于石斛屬植物的物種鑒定和遺傳多樣性研究。

本研究10份供試石斛種質(zhì)均屬于觀賞春石斛，經(jīng)過多代雜交獲得，親緣關(guān)系較為復(fù)雜。崔學(xué)強(qiáng)等［11］通過SNP標(biāo)記的開發(fā)將60份供試石斛種質(zhì)資源分成三個(gè)類群，包括本試驗(yàn)的9份種質(zhì)，其中中華夢(mèng)和潑墨皇后等2份種質(zhì)被分入Ⅱ類群，拿坡里、變異國(guó)王、紅小町、櫻花美人、紅星、黃金巴比倫和紅火鳥等7份種質(zhì)被分為Ⅲ類群。本研究結(jié)果表明中華夢(mèng)和潑墨皇后品種間相似系數(shù)最高、親緣關(guān)系較近，兩者在表觀性狀上也有著高度相似。黃金巴比倫和紅火鳥單獨(dú)分為一類，這與崔學(xué)強(qiáng)等［11］的研究結(jié)果相符，且黃金巴比倫和紅火鳥的花型、花瓣、唇瓣、萼片形狀相似，同時(shí)與本研究中其他8份種質(zhì)均有較大差距，黃金巴比倫和紅火鳥的唇瓣圖案模式具有網(wǎng)狀，也是其他8份觀賞春石斛不具備的特征。

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（責(zé)任編輯：鐘海豐）