張文晨 劉元值 孫文靜 成憲武 趙光賢

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科,吉林 延吉 133000)

研究表明,年齡與血管老化、血管再生減弱、骨髓(BM)中內(nèi)皮祖細胞減少、血管內(nèi)皮細胞凋亡和增殖之間的不平衡,細胞外微環(huán)境的變化(如生長因子、炎性細胞因子、氧化應(yīng)激等)有關(guān)〔1～5〕。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-A是關(guān)鍵的促血管生成因子之一,在大多數(shù)生理和病理衰老條件下其表達水平會降低〔6～10〕。在人體中, VEGF-A基因的mRNA被剪接形成不同的異構(gòu)體mRNA〔5,10～14〕。研究表明,抗VEGF-A165b、失活Wnt5a/strp5調(diào)節(jié)系統(tǒng)可以解決代謝紊亂所致的小鼠血管再生能力下降問題〔15〕。目前人們已經(jīng)做了許多嘗試,以激活血管再生能力,防止細胞死亡或促進細胞增殖〔3,4,16～18〕。盡管這些嘗試已經(jīng)取得了進展,但目前其在臨床上的運用仍很局限〔19,20〕。而且,在老年動物(如小鼠)和人類中,對于慢性缺血條件下血管生成減少的分子和細胞機制仍是未知的。通過本研究可以進一步揭示衰老及缺血對血管生成能力影響的細胞機制。本研究探討B(tài)M源性CD11b+巨噬細胞分泌的VEGF-A165b在老年小鼠缺血組織中抗新血管形成的作用機制。

1 材料和方法

1.1動物 所有動物使用程序經(jīng)名古屋大學(xué)醫(yī)學(xué)研究生院動物護理和使用委員會批準。選用8周齡和>72周齡的C57BL/6J雄性小鼠(Chukaukagakushizai,日本),均提供標(biāo)準飲食和自來水。

1.2材料 小鼠抗CD45單克隆抗體(35-Z6,sc-1178),兔抗Flt-1多克隆抗體(C-17,sc-316),抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多克隆抗體(C-1,sc-7269),Toll樣受體2多克隆抗體(TLR2sc-10739)和山羊3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體(sc-20357)購自Santa Cruz Biotechnology(圣克羅伊)。VEGFR2 多克隆抗體(ab38473)、Galectin-3 單克隆抗體(ab76245)和Wnt5a多克隆抗體(ab72583)購自Abcam(英國)。 兔抗Flk-1多克隆抗體(#2472)、Mac-3(M3/84)單克隆抗體購自Cell signaling Technology(丹弗斯公司)。鼠抗鼠Mac-3(M3/84)單克隆抗體、SC35單克隆抗體(aSC35)、FITC結(jié)合鼠抗鼠CD31(MEC13.3) 單克隆抗體和R-PE結(jié)合鼠抗鼠c-Kit(CD117,2B8) 單克隆抗體購自BD Pharmingen(加利福尼亞州圣地亞哥)。VEGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自R&D Systems(德國慕尼黑)。內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EBM)-2和內(nèi)皮生長培養(yǎng)基(EGM)-2購自Lonza(馬里蘭州沃克斯維爾)。RPMI1640購自Life technologies Corporation(美國紐約),人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)購自Applications(加州圣地亞哥)。β-Gal染色和cOmplete Mini蛋白酶抑制劑混合物購自Roche Diagnostics GmbH(德國曼海姆)。 RNeasy Micro Kit和SYBRTMGreen Master Mix購自于GIAGEN(德國希爾登),硝酸纖維素轉(zhuǎn)移膜購自Amersham Bioscience(新澤西州皮斯卡塔韋),生長因子降低膠基質(zhì)購自BD Bioscience(馬里蘭州貝德福德),Diff-Quik染色液購自International Regents Corporation(日本東京)。Cell Titer 96AO檢測試劑盒購自Promega(麥迪遜市), CD11b和CD117微珠試劑盒及MACS分離柱購自Miltenyli Biotec(德國)。

1.3后肢缺血模型建立和血流分析 制備8周齡小鼠(對照組)和>72周齡小鼠(觀察組)后肢缺血模型戊巴比妥鈉麻醉(腹膜內(nèi)50 mg/kg)后,對兩組行左后肢左靜脈和股動脈切除術(shù)〔7〕。使用血流成像儀(LSBFI,OMEGAZONE,OZ-1,OmEGA WAVE,Inc.,東京,日本)評估血流恢復(fù)情況。在術(shù)前和術(shù)后第0、4、7、14天評估左、右腿和腳的血流情況。使用不同顏色表示每條腿的血流量。腿部血流的定量分析表示為缺血性與非缺血性血流灌注比值,以消除由于環(huán)境溫度和光照而導(dǎo)致的數(shù)據(jù)變化〔21〕。

1.4免疫組織化學(xué)分析 在術(shù)后第4天,對兩組缺血和非缺血后肢肌肉組織進行免疫組化分析,使用針對巨噬細胞的抗體Mac-3(1∶50)染色。 在每只小鼠的4個切片中隨機選取5個顯微鏡視野,計算巨噬細胞數(shù)量,并表示為每高倍視野(×200)Mac-3細胞數(shù)量。在每只小鼠的內(nèi)收肌4個不同橫截面隨機選取4個顯微鏡視野,計算毛細血管和肌纖維數(shù)量,并表示為每根肌纖維的毛細血管數(shù)(×200)〔22〕。

1.5基因表達測定 從裂解物(CD11b+巨噬細胞及c-Kit+細胞)及肌肉組織中分離總RNA,并使用RNeasy Micro Kits進行反轉(zhuǎn)錄。將cDNA用于實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)分析〔4〕。將每個目標(biāo)RNA水平標(biāo)準化為各自的GAPDH mRNA水平。每個樣品重復(fù)3次。

1.6Western印跡 將30 min內(nèi)從肌肉樣本中提取的蛋白質(zhì)與低溫裂解緩沖液〔150 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)、pH 7.4、0.25%十二烷基硫酸鈉(SDS),1%Triton X-100〕混勻。補充蛋白酶抑制劑混合物(1片/10 ml),1 mmol/L苯甲基磺酰氟和1 mmol/L原釩酸鈉。在還原條件下,將40 μg蛋白質(zhì)樣品,上樣至SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳,然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素轉(zhuǎn)移膜上,用靶向的第一抗和相關(guān)的第二抗進行檢測。使用ImageJ軟件對條帶進行密度分析。

1.7免疫熒光 將BM源生的c-Kit陽性細胞(2×43個細胞/ml)黏附到具有變性膠原的蓋玻片上,將細胞在含4%胎牛血清(FBS)的EGM-2中培養(yǎng)24 h。用4%的甲酰甲醛固定后,用含1%甘油的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,每次3次。用0.1%牛血清白蛋白(BSA)/PBS封閉細胞,然后使用免疫熒光進行確定〔22〕。

1.8ELISA 用市售試劑盒測定血漿和細胞條件培養(yǎng)基中的VEGF-A水平〔4〕。

1.9BM衍生的內(nèi)皮祖細胞(EPC)和巨噬細胞的分離和培養(yǎng) 從對照組和觀察組中收集BM來源細胞,分別使用MACS分離柱與CD117磁珠或CD11b磁珠分離c-Kit+EPC樣細胞和CD11b+巨噬細胞〔23,24〕。

1.10細胞培養(yǎng) 在95%的空氣和5%的CO2的潮濕環(huán)境中,添加4%FBS和EGM-2培養(yǎng)5～8代(年輕)和18～20代(老年)的HUVECs細胞〔4〕。β-半乳糖苷酶染色評估HUVECs衰老表型。

1.11微管生成測定 將HUVECs在24孔板中以2×104細胞/孔的濃度在含有20 ng/ml VEGF-A的EBM-2的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)24 h,以誘導(dǎo)微管形成。對于特殊實驗,將HUVECs在24孔板中以每孔2×104個細胞的濃度,分別在含有VEGF-A(VEGF-A組)、對照組年輕小鼠(Y)組織中CD11b+細胞(YCD11b+CM組)、觀察組年老小鼠(A)組織中CD11b+細胞(ACD11b+CM組)、VEGF-A+YCD11b+CM(VEGF-A+YCD11b+CM組)、VEGF-A+ACD11b+CM(VEGF-A+ACD11b+CM組)或YCD11b+CM+ACD11b+CM(YCD11b+CM+ACD11b+CM組)的EBM-2(兩種培養(yǎng)基中VEGF-A為20 ng/ml,兩種培養(yǎng)基均為90 μg/ml)中培養(yǎng)24 h,然后進行長度計算。使用BZ-Ⅱ analuzer,Exe1.42軟件對小管發(fā)生進行量化,以計算每板口的6個區(qū)域中的芽的數(shù)量和長度〔22〕。兩名觀察者以盲法評估毛細血管密度及內(nèi)皮芽的長度和數(shù)量。

1.12細胞遷移、侵襲和增殖測定 在Transwell的24孔原始織培養(yǎng)板上進行細胞遷移和侵襲〔7〕。使用Diff-Quik染色溶液對遷移并侵入膜外側(cè)的細胞進行染色,并在高倍鏡(×200)下對每個樣本選定的5～7個視野中進行計算。使用非放射性細胞增殖檢測試劑盒(Cell Titer 96AO Assay)試劑盒進行細胞增殖測定〔22〕。在存在或不存在VEGF-A的情況下,將細胞接種在明膠包被的96孔板上,在100 μl EBM-2/0.3% BSA中以5 ×103個細胞接種,或在指定濃度的4種細胞培養(yǎng)基中接種48 h〔Yc-Kit+CM或YCD11b+CM和Ac-Kit+CM或ACD11b+CM在無血清EBM-2(前者)或RPMI1640培養(yǎng)基(后者)中缺氧培養(yǎng)36 h(c-Kit+細胞)或48 h(CD11b+細胞)。收集培養(yǎng)基,用100 K和10 K AmiconUltra Contractors分離含有約20 kD蛋白質(zhì)的特殊原始分,并將其蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)至1.5 mg/ml用于細胞實驗〕。直接向培養(yǎng)基中加入20 μl吩嗪異氟甲酸酯和四唑紫化合物的混合物,孵育1～2 h,然后在492 nm處測定吸光度。將各原始樣本一式三份測吸光度,并取其平均值。為了探究VEGF-A165b的來源,將兩組BM源性CD11b+細胞或c-Kit+細胞接種于EBM-2中,在正常氧含量或缺氧條件下(6孔板放入缺氧室)培養(yǎng)36 h,然后進行實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)檢測BM源性CD11b+細胞和c-Kit+細胞中VEGF-A165b mRNA的表達水平。將5×103HUVECs分別在添加加熱或未加熱的Yc-Kit+CM、Ac-Kit+CM、YCD11b+CM或ACD11b+CM(每個20 μl/100 μl EBM-2)的EBM-2中培養(yǎng)48 h,然后進行細胞增殖檢測(MTS實驗)。

1.13統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,Scheffe多重比較事后檢驗;采用雙向重復(fù)測量方差分析和Bonferroni事后檢驗進行血流數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析;計量資料兩組間采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1衰老在缺血時損害血管生成 LSBFI分析顯示,對照組術(shù)后第14天與第4天缺血/非缺血血流比率有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),表明血流恢復(fù)。而觀察組術(shù)后第4天與第14天相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),表明血流未恢復(fù)。與對照組相比,觀察組缺血/非缺血血流比率的恢復(fù)持續(xù)受到損害。術(shù)后第14天定量免疫染色顯示,觀察組非缺血肌肉和缺血肌肉中毛細血管密度〔(1.01±0.14)、0.61±0.10)個/mm2〕明顯低于對照組〔(1.34±0.20)、(1.47±0.10)個/mm2;t=3.272、14.943,P=0.009、<0.001〕,表明衰老損害了血管再生能力。見表1、圖1、圖2。

2.2衰老對VAGF-A165b 及下游信號傳導(dǎo)通路蛋白的影響 與對照組相比,觀察組缺血肌肉組織中VEGF-A、Galetin-3及TLPR2蛋白水平顯著增加,磷酸化VEGF受體(p-VEGFR)2和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)水平明顯降低(P<0.05)。觀察組缺血肌肉中VAGF-A165b mRNA明顯高于對照組。見圖3、表2、表3。提示VAGF-A165b過度表達可能是導(dǎo)致VEGFR2/Akt失活的原因,這對于老年動物缺血誘導(dǎo)的血運重建能力下降至關(guān)重要。

2.3衰老對Wnt5a/11和SC35表達的影響 與對照組相比,觀察組缺血肌肉中Wnt5a、SC35蛋白表達明顯增高(P<0.05)。觀察組缺血肌肉中Wnt5a、Wnt11 mRNA水平明顯增加(P<0.05)。見表3。表明在老齡動物中,非典型Wnt5a/11-SC35軸的改變可能誘導(dǎo)了VAGF-A165b過度表達。

表1 兩組術(shù)后不同時間點缺血/非缺血血流比率

圖1 兩組血流恢復(fù)狀態(tài)

圖2 兩組股內(nèi)收肌組織毛細血管密度(免疫組化染色,×200)

圖3 兩組術(shù)后第4天靶蛋白水平比較

表2 非缺血組織及缺血組織中VEGF-A、p-VEGFR2、p-Akt、SC35、Wnt5a、Galectin-3和TLPR2蛋白表達水平

表3 非缺血組織及缺血組織中VEGF-A165b、Wnt家族和VEGF-A164a mRNA表達

2.4骨髓來源的巨噬細胞通過誘導(dǎo)VAGF-A165b對老齡小鼠缺氧反應(yīng)表現(xiàn)出抗血管生成作用 如表4所示,未加熱的對照組c-Kit+細胞(Yc-Kit+CM)和觀察組c-Kit+細胞(Ac-Kit+CM)具有相似的刺激效果。與未加熱的ACD11b+CM培養(yǎng)基相比,未加熱的YCD11b+CM培養(yǎng)基明顯刺激HUVECs增殖(P<0.05)。將HUVECs接種在添加了VEGF-A、YCD11b+CM+VEGF-A、ACD11b+CM+VEGF-A的培養(yǎng)基中測定吸光度(OD)值,結(jié)果顯示添加了YCD11b+CM+VEGF-A培養(yǎng)基的OD值(291.67±12.58)與只添加VEGF-A(252.33±7.51)相比,YCD11b+CM增強VEGF-A誘導(dǎo)的細胞增殖(P<0.05)。見圖4。YCD11b+CM+VEGF-A與ACD11b+CM+VEGF-A培養(yǎng)基相比,ACD11b+CM培養(yǎng)基明顯抑制了這種作用(P<0.05)。將HUVECs接種在兩種條件培養(yǎng)基,分別向CD11b+條件培養(yǎng)基及c-Kit+條件培養(yǎng)基中添加YCD11b+CM后測定小管生成長度,結(jié)果顯示添加YCD11b+CM的兩種條件培養(yǎng)基中CD11b+條件培養(yǎng)基HUVECs小管生成長度〔(6 220.67±241.00)μm〕較c-Kit+條件培養(yǎng)基(1 783.33±152.73)μm〕明顯更長(P<0.01)。如表5所示,相比對照組,觀察組BM源性CD11b+巨噬細胞在缺氧應(yīng)激條件下VEGF-A165b mRNA水平明顯增加(P<0.05)。然而,缺氧應(yīng)激對VEGF-A165b mRNA的影響既不是Yc-Kit+CM,也不是Ac-Kit+CM。綜上,BM源性CD11b+巨噬細胞可能是老年小鼠VAGF-A165b表達的一個重要來源。

表4 兩組HUVECs增殖(OD值)試驗

圖4 各組HUVECs小管生成實驗(×200)

表5 兩組CD11b+細胞和c-Kit+細胞中VEGF-A165b mRNA的表達水平

2.5衰老損害祖細胞的內(nèi)在功能 術(shù)前,觀察組血漿sFlt1水平較對照組明顯降低(P<0.05);術(shù)后第4、7、14天,相比對照組,觀察組血漿sFlt1水平明顯增高(P<0.05),表明衰老可產(chǎn)生抗血管生成狀態(tài)。相比對照組,觀察組缺血肌肉浸潤的巨噬細胞和白細胞數(shù)量顯著增加。觀察組缺血組織中CD45+、Mac3+細胞數(shù)量明顯增多(P<0.05)。觀察組缺血組織中巨噬細胞衍生的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-2凝膠溶解活性水平明顯升高(P<0.05)。相比對照組,觀察組外周血中c-Kit+/CD31+細胞祖細胞的數(shù)量明顯減少(P<0.05)。血管重建受損可能與骨髓源性巨噬細胞固有功能下降密切相關(guān)。細胞表達c-Kit+和CD31+EPC表面標(biāo)志物。結(jié)果表明老化顯著損害VEGF-A誘導(dǎo)的c-Kit+遷移和侵襲及增殖。見圖5、圖6、表6、表7、圖7。

圖5 兩組巨噬細胞及白細胞浸潤(免疫組化染色,×200)

圖6 在EGM-2培養(yǎng)4 d的BM源性c-Kit+細胞中表達c-Kit+和CD31+的原始細胞表面標(biāo)志物(DAPI染色,×200)

表6 兩組血漿sFlt1水平、Mac3+和CD45+細胞數(shù)量

表7 兩組MPP-9和MMP-2的凝膠溶解活性及兩組c-Kit+/CD31+細胞數(shù)量、遷移、侵襲和增殖

圖7 兩組c-Kit+細胞的遷移、侵襲(Diff-Quik染色,×200)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn),缺血性應(yīng)激促進了觀察組小鼠肌肉組織中的炎性作用及Wnt5a/11和SC35和VEGF-A165b表達,并降低VEGFR2/Akt信號通路對缺氧應(yīng)激反應(yīng)。在體外,缺氧刺激觀察組小鼠BM源性CD11b+巨噬細胞及VEGF-A165b表達,從而降低成熟內(nèi)皮細胞和BM來源的巨噬細胞細胞功能;這可能導(dǎo)致老年動物血管重建受損。其潛在機制可能為衰老通過Toll受體2使巨噬細胞活化并分泌VEGF-A165b,其刺激Wnt5a/11-SC35表達增加從而損害了內(nèi)皮細胞和內(nèi)皮祖細胞的功能最終影響了血管新生。表明VEGF-A165b可能是老年小鼠缺血誘導(dǎo)新生血管形成的關(guān)鍵抗血管生成調(diào)節(jié)劑。

有研究表明,在病理條件下,炎癥反應(yīng)會加速衰老〔7〕。本研究與先前的研究一致〔4,7,25,26〕,心血管危險因素(如衰老)促進動物和人類的內(nèi)皮祖細胞功能和數(shù)量下降〔7,16〕。 固有功能和血管祖細胞數(shù)量的下降可以成為老年缺血性新生血管損害的解釋機制。值得注意的是,缺氧對BM來源的c-Kit+細胞中VEGF-A165b亞型表達沒有影響。是否有其他病理因素影響其表達,并通過自身及其他細胞產(chǎn)生抗血管生成作用尚需進一步研究。

本研究存在一定局限性。首先,不能通過VEGF-A亞型抗體(尤其是抗VEGF-A165b抗體)來區(qū)分增加的VEGF-A成分。其次,對VEGF-A165b的基因研究并不能直接證明其在新生血管形成中的作用。