房志科 黃海陽 溫玉平 何景兒 董明國,

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)東莞醫(yī)院內(nèi)四科,廣東 東莞 523000;2東莞市中醫(yī)藥研究所)

慢性萎縮性胃炎臨床病變主要有胃黏膜表面受損后引發(fā)腺體萎縮、黏膜肌層異常增厚等,同時還會伴隨腸上皮不典型增生病理改變的出現(xiàn)〔1,2〕。據(jù)臨床研究顯示,Shh信號通路表達異常與慢性萎縮性胃炎的發(fā)生、發(fā)展聯(lián)系密切,其對特異性基因表達的調(diào)控可以影響細胞的分化、遷移與增殖〔3,4〕。另有研究證實,山藥提取物中的有效多糖對體液免疫、細胞免疫有重要作用,且對胃腸動力學(xué)有較大影響〔5〕。因此,本文以Shh信號通路為研究切入點,研究山藥提取物對慢性萎縮性胃炎老齡大鼠發(fā)病進程作用機制,以期為慢性萎縮性胃炎的治療提供臨床治療靶點。

1 材料與方法

1.1研究動物 選取12月齡的雄性SD老齡大鼠50只,均購于甘肅中醫(yī)院動物實驗中心,實驗動物質(zhì)量許可證:SCXK(甘)2020-001。于正式實驗前1 w購入,購入后將所有老齡大鼠在實驗室分籠飼養(yǎng),允許其自由進食、飲水,食物為國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料,實驗室濕度40%～60%、溫度23 ℃左右,采用自然采光,室內(nèi)及相關(guān)用具每周用紫外燈消毒滅菌。

1.2主要試劑與儀器 胃蛋白酶測試盒、大鼠胃泌素試劑盒(上海一研生物科技有限公司,EG12679);1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(百靈威科技有限公司,OR301388);甲酸溶液(北京索萊寶科技有限公司,G2101);1%戊巴比妥鈉溶液(上海聯(lián)邁生物工程有限公司,AR0030);10%水合氯醛(北海陽光藥業(yè)有限公司,101120);染色試劑盒(大連美侖生物科技有限公司,00451285);新鮮山藥(南城阿穎金山藥食品有限責(zé)任公司);抗體:山羊抗小鼠一抗、山羊抗兔二抗(康為世紀(jì);SE131、CW0103S)。Shh兔抗多克隆抗體(ProteinTech,20697-1-AP)。EG1160 組織病理包埋儀(德國Leica公司);ECLIPSE Ti-S 電子顯微鏡(日本Nikon公司);激光多普勒血流計(美國健康醫(yī)療儀器國際公司);OSE-Y30/Y40組織勻漿器(天根生化);UV-1700紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);Bio Tek酶標(biāo)儀(谷歌生物有限公司);RM 2135組織病理切片機(德國Leica公司)

1.3分組及模型構(gòu)建 依照隨機數(shù)表法將50只老齡大鼠隨機分為5組:空白對照組(A組)、慢性萎縮性胃炎模型組(B組)、低劑量山藥提取物組(C組)、中劑量山藥提取物組(D組)、高劑量山藥提取物組(E組)。造模:第2周給予B組、C組、D組120 μg/ml 1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍溶液作為其飲用水,同時用45%乙醇空腹灌胃,2次/w,2 ml/次,雷尼替丁0.03 g/(kg·d)進行灌胃,禁食1次/w,每次24 h,重復(fù)上述方法造模12 w,造模完成后,隨機抽取模型大鼠,行胃組織病理學(xué)檢測,提示胃組織黏膜萎縮時表示建模成功。

1.4給藥 14 w時,給予B、C、D組山藥提取物灌胃治療,各組灌胃濃度依次為0.25、0.50、0.75 g/ml,劑量為10 ml/kg。B、C、D組每只每日都需進行灌胃,連續(xù)灌胃5 w。A組不做處理,B組灌胃等體積生理鹽水。選取外皮無損傷、橫切面為雪白色、長短粗細相同的新鮮山藥為原料,將山藥洗干凈、去皮后切成大小均等小塊,用打漿機將其打成漿,將其均等分為3份勻漿,一份勻漿加2倍體積雙蒸水作為低劑量(濃度0.25 g/ml)山藥提取物,一份勻漿加1倍體積雙蒸水作為中劑量(濃度0.5 g/ml)山藥提取物,一份勻漿加1/3倍體積雙蒸水作為高劑量(濃度0.75 g/ml)山藥提取物,將配制好的山藥提取物均勻攪拌。

1.5樣本采集 實驗周期結(jié)束,各組禁食24 h,按照40 mg/kg的比例將1%戊巴比妥鈉溶液注射大鼠腹腔進行麻醉,靜待,麻醉成功后,腹腔靜脈取血5 ml,分離血清,保存于-20 ℃冰箱中待測。處死大鼠,取大鼠胃組織用甲酸溶液固定,用常規(guī)石蠟包埋,切片,蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.6病理組織學(xué)觀察 將各組組織切片進行HE染色,置于光學(xué)顯微鏡下觀察胃黏膜變化情況,觀察不同組別胃組織病理學(xué)特征。

1.7胃分泌功能及微循環(huán)胃血流量 在實驗第20周,將大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉后放置成仰位姿勢,墊高其頭部,高于胃部位置,在幽門0.3 cm處結(jié)扎,6 h后剪開結(jié)扎處收集胃液10 ml,以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min,將離心成功的上清液放置于2.0 ml EP管按試劑盒說明書測定胃蛋白酶活性,用酸度、pH試紙測定胃酸值及pH值。沿左肋骨被毛0.3～0.5 cm處剪開皮膚、肌肉層,將胃小彎處系膜剪短,使其充分暴露胃體,用激光多普勒血流計針式探頭在胃左動脈食管支3～4間測定胃體部微循環(huán)血流,此程中需要用生理鹽水紗布保持胃體濕潤,在幽門部、胃體部交界處測定胃微循環(huán)血流量值,此過程需要注意要避開靜脈、大動脈。

1.8血清一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA) 將凍存于-20 ℃的大鼠血清取出,在室溫中解凍,采用酶聯(lián)免疫法檢測各組血清中NO、SOD、GSH-Px、MDA含量,操作步驟嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒說明書進行。向酶標(biāo)板3個孔中(照孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、加樣孔)中依次加入100 μl蒸餾水、血清樣本及預(yù)稀釋(1/40)的質(zhì)控品,在室溫26 ℃環(huán)境中孵育1 h,重復(fù)洗滌3次,最后將100 μl酶結(jié)合物加入反應(yīng)孔中,終止反應(yīng),當(dāng)450 nm波長時,完成讀數(shù)。

1.9Shh通路蛋白表達 采用Western印跡法檢測胃組織Shh、蛋白質(zhì)調(diào)控基因(Ptch)1、平滑受體蛋白(Smo)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白(Gli)1、Gli2、Gli3蛋白表達。取40 mg胃組織切片,用Western印跡法提取組織總蛋白,調(diào)整蛋白質(zhì)濃度,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、膜轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,加入對應(yīng)一抗,于4 ℃條件下孵育過夜,Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)漂洗40 min,漂洗3次,再加入經(jīng)辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗繼續(xù)孵育1 h,依照電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒說明書對蛋白條帶進行顯影、定影,記錄、分析各組蛋白條帶成像。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進行分析,多組間比較采用方差齊性檢驗,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1病理組織學(xué)觀察 A組可見胃黏膜細胞及腺體結(jié)構(gòu)完整、大小、形狀一致且排列整齊,肌層連續(xù)性好,無炎性細胞浸潤,屬于正常胃組織表觀。B組可明顯看出胃黏膜層、腺體細胞被破壞,腺管不完整、細胞核大小、形狀不一,同時有上皮內(nèi)瘤變、腸上皮化現(xiàn)象的出現(xiàn),存在漿細胞、淋巴細胞浸潤。C、D、E組胃黏膜厚度較B組呈依次遞增狀態(tài),其中,C、D組還伴隨纖維組織增生,胃黏膜肌層雖然增厚,但細胞排列仍然不規(guī)則,細胞核大小、形狀較B組有一定改觀,D組改觀情況更顯著。E組胃黏膜細胞排列較為整齊,細胞核大小、形狀較為均勻,無明顯炎性細胞浸潤,腺管結(jié)構(gòu)較為完整。見圖1。

2.2胃分泌功能的比較 如表1所示,與A組相比,B組胃液分泌量、胃液酸度、胃蛋白酶活性明顯降低(P<0.05);與B組相比,C、D、E組胃液分泌量、胃液酸度、胃蛋白酶活性明顯升高,且E組升高水平明顯優(yōu)于C、D組(P<0.05)。

2.3微循環(huán)胃血流量的比較 如表1所示,與A組相比,B組胃體部血流量、幽門部血流量、胃血流量明顯減少(P<0.05);與B組相比,C、D、E組胃體部血流量、幽門部血流量、胃血流量明顯增加,且E組增加水平明顯優(yōu)于C、D組(P<0.05)。

圖1 各組胃組織病理(HE染色,×100)

表1 各組胃分泌功能及微循環(huán)胃血流量的比較

2.4胃組織Shh、Ptch1、Smo、Gli1、Gli2、Gli3蛋白表達 如表2、表3、圖2所示,與A組相比,B組Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白表達明顯降低,Gli2、Gli3蛋白表達明顯升高(P<0.05);與B組相比,C、D、E組Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白表達明顯升高,Gli2、Gli3蛋白表達明顯降低,且E組Shh、Ptch1、Smo、Gli1、Gli2、Gli3變化幅度明顯優(yōu)于C、D組(P<0.05)。

2.5血清NO、SOD、GSH-Px、MDA表達比較 如表3所示,與A組相比,B組NO、MDA表達明顯升高,SOD、GSH-Px表達明顯降低(P<0.05);與B組相比,C、D、E組NO、MDA表達明顯降低,SOD、GSH-Px表達明顯升高,且E組NO、SOD、GSH-Px變化幅度明顯優(yōu)于C、D組(P<0.05)。

表2 各組Gli1、Gli2、Gli3蛋白相對表達

表3 各組血清NO、SOD、GSH-Px、MDA及Shh、Ptch1、Smo蛋白表達比較

圖2 Western印跡檢測各組Shh途徑相關(guān)蛋白表達

3 討 論

慢性萎縮性胃炎是最常見的消化系統(tǒng)疾病,該疾病會讓胃黏膜表面處于長期受損狀態(tài),同時伴隨黏膜腺體的萎縮、消失〔6,7〕。隨著慢性萎縮性胃炎病情的加重,會伴發(fā)胃腸道不典型增生及炎性反應(yīng)〔8〕。既往研究顯示,慢性萎縮性胃炎致病因素多變,迄今為止明確的致病病因主要有遺傳、免疫、長期接觸重金屬等〔9〕。目前,有關(guān)慢性萎縮性胃炎的治療較為單一,且藥物作用靶點較少。山藥有多種生物活性,屬性溫和,長期使用有延緩衰老、補胃脾虧損等功效。有資料顯示,山藥提取物有下調(diào)血清胃泌素表達、上調(diào)血清表皮生長因子及胃黏膜堿性成纖維細胞生長因子受體的作用〔10,11〕。另有報道證實,山藥提取物在動物實驗中有改善胃部水腫、充血的作用,有利于促進胃黏膜的恢復(fù)〔12〕。而胃黏膜上皮細胞Shh信號通路對慢性萎縮性胃炎的發(fā)生、進展起著十分重要的作用〔13〕。

由于慢性萎縮性胃炎多種致病因素直接、間接的破壞胃黏膜上皮細胞,所以胃黏膜腺體萎縮是其主要病變特征〔14〕。本研究病理學(xué)觀察也證實了這點。臨床研究表明,胃黏膜層各種腺體分泌出的胃液、胃酸、胃蛋白對胃腸組織有十分顯著的保護作用〔15〕。本研究說明,山藥提取物可以促進胃蛋白活性的增加及胃液的分泌,利于胃黏膜修復(fù),且患病機體與山野提取物存在劑量依賴關(guān)系,且山藥提取物可以有效改善胃微循環(huán)血流量,提升胃黏膜防御功能。NO屬于多種生物學(xué)活性自由基氣體分子,讓細胞脂質(zhì)氧化反應(yīng)加劇〔16〕。MDA是胃組織損傷后的氧化應(yīng)激標(biāo)志物,SOD和GSH-Px屬于重要抗氧化酶〔17,18〕。本研究結(jié)果提示,山藥提取物有消炎、保護生物膜的功效。

以往研究發(fā)現(xiàn),Shh信號通路是調(diào)控胃組織生物活性的重要通路之一,其中的Shh直接作用間質(zhì)細胞,Shh在胃上皮中產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,與Ptch1產(chǎn)生跨膜受體結(jié)合,然后讓Ptch1對G蛋白受體Smo發(fā)揮抑制作用〔19,20〕。另外,Smo活化后會在微管運輸中將Shh信號傳遞出去,促進復(fù)合物的解離。此時,Gli蛋白轉(zhuǎn)錄激活因子會由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核,在靶基因表達中不斷結(jié)合。Gli2、Gli3經(jīng)過蛋白酶加工后會在入核后抑制Shh靶基因表達。Gli1則是Shh的重要轉(zhuǎn)錄激活因子,當(dāng)胃黏膜萎縮時,Shh被抑制,Gli2、Gli3上調(diào),Ptch1、Smo、Gli1則會下調(diào)〔21,22〕。本研究結(jié)果可推測,經(jīng)過山藥提取物治療后,Shh信號通路被激活,促進了Shh下游信號通路的表達,使其配體也被激活,Ptch1、Smo、Gli1的上調(diào)、Gli2、Gli3的下調(diào)讓胃黏膜低酸環(huán)境被改變,改善胃組織運化,有效調(diào)節(jié)了胃酸、氧化應(yīng)激物、消化酶的分泌。所以山藥提取物會通過Shh通路對慢性萎縮性胃炎有靶點治療的作用,但Shh各信號點之間的交互作用機制還需研究。