趙麗君 樊耀華 徐文華

(深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 1中西醫(yī)結(jié)合創(chuàng)新研究中心,廣東 深圳 518104;2治未病中心)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病常見并發(fā)癥之一,我國DN發(fā)病率約為12%,其中大部分糖尿病患者最終進(jìn)展為慢性腎衰竭,患者5年生存率低于50%〔1,2〕。目前DN的發(fā)病機(jī)制尚未闡明,西醫(yī)治療具有較大毒副作用,中醫(yī)藥具有毒副作用小且作用效果好的優(yōu)點(diǎn),研究表明,天然植物的提取物,例如:黃酮、多糖等成分,具有抗炎、抗氧化等作用,并可用于治療DN〔3,4〕。覆盆子酮屬于中藥覆盆子的主要成分,其具有抗氧化、降血糖等作用,研究表明覆盆子酮可能通過影響胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)而達(dá)到降糖目的〔5〕。但覆盆子酮與DN的相關(guān)研究相對較少,探究其治療DN的分子機(jī)制具有重要意義。環(huán)狀RNA(circRNA)具有組織特異性、穩(wěn)定性與高度保守性,研究表明circ_0068087在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá),干擾circ_0068087表達(dá)可減輕ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔6〕。但circ_0068087是否可作為DN的潛在治療靶點(diǎn)仍不清楚。本研究探討覆盆子酮對高糖(HG)誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞(HK)-2損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 HK-2購自美國ATCC;覆盆子酮購自武漢華翔科潔生物技術(shù)有限公司;凋亡檢測試劑盒、DMEM培養(yǎng)基、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8試劑購自上海碧云天生物;si-NC、si-circ_0068087、pcDNA、pcDNA-circ_0068087購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;Trizol試劑、Lipofectamine2000購自美國Invitrogen。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 HK-2在添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)箱條件:37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2。HK-2細(xì)胞生長至對數(shù)期時,接種到6孔板(1×105個/孔),在含濃度30 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)48 h〔7〕,記為HG組。加入含有濃度為5.5 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)48 h,記為NG組。分別加入濃度為0.1、1.0、10 nmol/L覆盆子酮〔8〕與30 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)48 h,分別為HG+覆盆子酮低劑量組、HG+覆盆子酮中劑量組、HG+覆盆子酮高劑量組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-NC、si-circ_0068087分別轉(zhuǎn)染至HK-2,用含30 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h,分別記為HG+si-NC組、HG+si-circ_0068087組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA、pcDNA-circ_0068087分別轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞,用含80 ng/L覆盆子酮與30 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h,分別記為HG+覆盆子酮+pcDNA組、HG+覆盆子酮+pcDNA-circ_0068087組。

1.3CCK-8實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染或處理后,收獲HK-2并重新播種到96孔板(2×103個/孔)。培養(yǎng)48 h后,加入10 μl CCK-8溶液,孵育2 h。最后,用酶標(biāo)儀在450 nm處測量光密度(OD)并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率〔(對照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%〕。

1.4流式細(xì)胞術(shù)測量細(xì)胞凋亡率 轉(zhuǎn)染或處理后,收集HK-2并用預(yù)冷PBS洗滌。用1倍結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞后,按照凋亡試劑盒的說明,用脂聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)和碘化丙啶溶液在黑暗中染色15 min。采用流式細(xì)胞儀分析,CellQuest軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.5試劑盒測量SOD的活性與MDA的水平 反復(fù)凍融法裂解各組HK-2,離心后取上清,根據(jù)SOD和MDA測定試劑盒的說明,分別測定上清中SOD活性與MDA水平。

1.6實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測circ_0068087表達(dá)水平 用Trizol試劑提取HK-2的總RNA,用PrimeScript RT reagent Kit合成cDNA。采用SYBR綠色試劑和特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀用來檢測circ_0068087相對表達(dá)量。circ_0068087正向引物5′-CAGTGGCTTTATGAAATGTTGTG-3′,反向5′-CTAGGTGGCCCCTCAGTGTA-3′。GAPDH正向引物5′-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3′,反向5′-GGCCAGGGGTGCTAAGCAGT-3′。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、差分析。

2 結(jié) 果

2.1覆盆子酮減輕HG誘導(dǎo)的HK-2損傷 與NG組比較,HG組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與HG組比較,HG+覆盆子酮低劑量組、HG+覆盆子酮中劑量組、HG+覆盆子酮高劑量組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05),且呈劑量依賴性,見圖1、表1。

2.2覆盆子酮抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2氧化應(yīng)激 與NG組比較,HG組SOD活性明顯下降,MDA水平明顯升高(P<0.05);與HG組比較,HG+覆盆子酮低、中、高劑量組SOD活性明顯增加,MDA水平明顯下降(P<0.05),呈劑量依賴性,見表1。

2.3覆盆子酮抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2中circ_0068087表達(dá) 與NG組比較,HG組circ_0068087表達(dá)明顯增高(P<0.05);與HG組比較,HG+覆盆子酮低、中、高劑量組,circ_0068087表達(dá)以劑量依賴的方式明顯下降(P<0.05),見表1。

圖1 覆盆子酮抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡

表1 各組HK-2損傷、氧化應(yīng)激、circ_0068087表達(dá)

2.4下調(diào)circ_0068087對高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷、氧化應(yīng)激的影響 與HG+si-NC組比較,HG+si-circ_0068087組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率明顯降低,SOD活性明顯升高,MDA水平明顯降低(P<0.05),見表2、圖2。

2.5circ_0068087對覆盆子酮處理的高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷、氧化應(yīng)激的影響 與HG+覆盆子酮+pcDNA組比較,HG+覆盆子酮+pcDNA-circ_0068087組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率明顯升高,SOD活性明顯降低,MDA水平明顯升高(P<0.05),見圖3、表3。

表2 下調(diào)circ_0068087對高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷、氧化應(yīng)激的影響

圖2 下調(diào)circ_0068087抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡

圖3 circ_0068087可逆轉(zhuǎn)覆盆子酮對高糖誘導(dǎo)的 HK-2凋亡的抑制作用

表3 circ_0068087對覆盆子酮處理的高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷、氧化應(yīng)激的影響

3 討 論

體內(nèi)高糖水平持續(xù)升高可引起炎癥、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等從而造成腎小管上皮細(xì)胞損傷,中醫(yī)藥可通過抑制炎癥、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等從而減緩DN發(fā)展進(jìn)程〔9〕。但其可能作用靶點(diǎn)尚未完全闡明。circRNA在DN中表達(dá)異常,并可通過調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)而間接調(diào)控其靶基因表達(dá)從而促進(jìn)或抑制DN的發(fā)展進(jìn)程〔10,11〕。

覆盆子酮可減輕丙烯酰胺誘導(dǎo)的肝組織損傷〔12〕。覆盆子酮可通過抑制心肌細(xì)胞凋亡從而減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷〔13〕。本研究結(jié)果顯示,高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞后,增殖抑制率和凋亡率增加,與既往報(bào)道結(jié)果相似〔14〕,提示細(xì)胞損傷模型成功建立。隨著覆盆子酮濃度的升高,高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率降低,提示在高糖處理下覆盆子酮可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。本研究與既往報(bào)道結(jié)果相似〔15〕;本研究結(jié)果提示,覆盆子酮可通過提高HG誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞抗氧化功能來改善氧化損傷。

circ_0068087在HG誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),抑制circ_0068087表達(dá)可通過抑制炎癥反應(yīng)改善細(xì)胞損傷〔16〕。本研究提示,覆盆子酮可能通過抑制circ_0068087表達(dá)而減緩DN發(fā)展進(jìn)程。同時本研究進(jìn)一步提示,覆盆子酮可通過下調(diào)circ_0068087表達(dá)而達(dá)到治療DN的目的。