王緒臻 王曉華 李曉燕 黃雯靜

(濟(jì)南市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎病風(fēng)濕科,山東 濟(jì)南 271100)

糖尿病腎病是糖尿病并發(fā)癥之一,腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等均可造成腎小管上皮細(xì)胞損傷〔1,2〕。中藥具有毒副作用小與藥效良好等特點(diǎn),并可減緩糖尿病腎病的發(fā)展進(jìn)程〔3,4〕。葛根屬于豆科植物野葛干燥根部,研究表明葛根異黃酮可減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷〔5〕。但葛根異黃酮與糖尿病腎病相關(guān)研究報(bào)道相對(duì)較少。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)在多種疾病發(fā)生及發(fā)展中可發(fā)揮重要調(diào)控作用,研究表明,LncRNA TTTY15在缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)〔6〕。但TTTY15在糖尿病腎病中的作用尚未可知。本研究旨在探討葛根異黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 葛根購(gòu)自亳州市億弘堂藥業(yè)有限公司;人腎小管上皮細(xì)胞HK-2購(gòu)自上海通派生物;噻唑藍(lán)(MTT)試劑與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物;si-NC、si-TTTY15、pcDNA、pcDNA-TTTY15購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-10檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物。

1.2葛根異黃酮提取〔7〕稱取葛根15 g,加入70%、95%乙醇75 ml,加熱回流3次,2 h/次,收集濾液后減壓蒸餾,回收乙醇,濃縮至干,葛根異黃酮濃度為69.6 mg/g,加入二甲基亞砜(DMSO)溶解后稀釋,濃度分別為50、100、200 μg/ml。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 HK-2細(xì)胞接種于6孔板(1×104個(gè)/孔)后加入含有濃度為30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h〔8〕,記為HG組。NG組用含5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基處理。分別加入含有不同濃度(50、100、200 μg/ml)葛根異黃酮與含有濃度為30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為HG+葛根異黃酮L組、HG+葛根異黃酮M組、HG+葛根異黃酮H組。將si-NC、si-TTTY15分別轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞,用含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為HG+si-NC組、HG+si-TTTY15組。將pcDNA、pcDNA-TTTY15分別轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞,再用含200 μg/ml葛根異黃酮與30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為HG+葛根異黃酮+pcDNA組、HG+葛根異黃酮+pcDNA-TTTY15組。

1.4MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 96孔板中接種各組細(xì)胞(1×103/孔),每孔加入MTT溶液20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)基,加入150 μl DMSO,避光振蕩孵育5 min,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值(A490 nm)并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率〔(對(duì)照組A-實(shí)驗(yàn)組A)/(對(duì)照組A-空白組A)×100%〕。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌各組HK-2細(xì)胞,加入500 μl結(jié)合緩沖液,凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6利用試劑盒檢測(cè)SOD活性與MDA水平 裂解各組HK-2細(xì)胞,取細(xì)胞裂解液,檢測(cè)SOD活性、MDA水平。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-10水平 取各組HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液,按照試劑盒說明檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-10水平。

1.8qRT-PCR檢測(cè)TTTY15表達(dá)水平 采用Trizol試劑分別提取各組HK-2細(xì)胞總RNA,RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,應(yīng)用熒光定量PCR儀檢測(cè)TTTY15表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1葛根異黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷的影響 與NG組比較,HG組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與HG組比較,HG+葛根異黃酮L組、HG+葛根異黃酮M組、HG+葛根異黃酮H組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05),且呈劑量依賴性,見圖1、表1。

2.2葛根異黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2中TTTY15表達(dá)的影響 與NG組比較,HG組TTTY15表達(dá)顯著升高(P<0.05);與HG組比較,HG+葛根異黃酮L組、HG+葛根異黃酮M組、HG+葛根異黃酮H組TTTY15表達(dá)顯著降低(P<0.05),且呈劑量依賴性,見表1。

圖1 葛根異黃酮抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡

2.3葛根異黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2氧化應(yīng)激的影響 與NG組比較,HG組MDA、TNF-α、IL-1β的水平顯著升高,SOD活性和IL-10水平顯著降低(P<0.05);與HG組比較,HG+葛根異黃酮L組、HG+葛根異黃酮M組、HG+葛根異黃酮H組MDA、TNF-α、IL-1β水平顯著降低,SOD活性和IL-10水平顯著升高(P<0.05),且呈劑量依賴性,見表1。

表1 葛根異黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷、TTTY15表達(dá)及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4沉默TTTY15對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷氧化應(yīng)激的影響 與HG+si-NC組比較,HG+si-TTTY15組細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率及MDA、TNF-α、IL-1β水平顯著降低(P<0.05),SOD活性和IL-10水平顯著升高(P<0.05),見表2、圖2。

表2 沉默TTTY15對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷氧化應(yīng)激的影響

圖2 沉默TTTY15抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡

2.5過表達(dá)TTTY15對(duì)葛根異黃酮處理的高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷的影響 與HG+葛根異黃酮+pcDNA組比較,HG+葛根異黃酮+pcDNA-TTTY15組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率顯著升高(P<0.05),見圖3、表3。

2.6過表達(dá)TTTY15對(duì)葛根異黃酮處理的高糖誘導(dǎo)的HK-2氧化應(yīng)激的影響 與HG+葛根異黃酮+pcDNA組比較,HG+葛根異黃酮+pcDNA-TTTY15組MDA、TNF-α、IL-1β水平顯著升高(P<0.05),SOD活性和IL-10水平顯著降低(P<0.05),見表3。

圖3 過表達(dá)TTTY15可減弱葛根異黃酮對(duì) 高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡的作用

表3 過表達(dá)TTTY15可減弱葛根異黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷及氧化應(yīng)激的作用

3 討 論

中藥及其活性成分具有抗炎、抗氧化等作用,并可減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷〔9〕。LncRNA可充當(dāng)miRNA競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA分子參與糖尿病腎病發(fā)生及發(fā)展過程〔10,11〕。葛根異黃酮可抑制氧化應(yīng)激而保護(hù)糖尿病小鼠〔12〕。葛根異黃酮可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖而抗軟骨退變〔13〕。葛根可通過抑制炎癥及氧化應(yīng)激從而減輕結(jié)腸炎損傷〔14〕。本研究發(fā)現(xiàn),葛根異黃酮可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激,與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似〔15〕。本研究還提示,葛根異黃酮可抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)從而減輕細(xì)胞損傷,與相關(guān)報(bào)道結(jié)果相似〔16〕。TTTY15在缺血/再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中呈高表達(dá),敲低其表達(dá)可減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷〔17〕。TTTY15高表達(dá)可促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔18〕。敲低TTTY15表達(dá)可減輕心肌缺血再灌注損傷〔19〕。本研究提示,葛根異黃酮可能通過抑制TTTY15表達(dá)而減緩糖尿病腎病的發(fā)展進(jìn)程。

綜上,葛根異黃酮可通過抑制TTTY15表達(dá)而促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷,TTTY15可為糖尿病治療藥物的研發(fā)提供新方向,還可為揭示葛根異黃酮治療糖尿病腎病的作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但葛根異黃酮治療糖尿病腎病的潛在作用機(jī)制及其是否可用作臨床用藥均尚需探究。