楊凌霞 王偉 劉萍 向丹

(荊門市中醫(yī)醫(yī)院消化內(nèi)科,湖北 荊門 448000)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是免疫系統(tǒng)失調(diào)的慢性腸道炎癥,在世界范圍內(nèi)具有很高的患病率〔1,2〕。UC臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉和血便,其腸道炎癥局限于結(jié)腸黏膜〔3〕。炎癥細(xì)胞參與UC發(fā)生時(shí)的腸黏膜破裂和潰瘍,可加快UC的發(fā)生和發(fā)展〔2〕。目前臨床對(duì)于UC的治療主要采用水楊酸類藥物、免疫抑制等藥物,柳氮磺胺吡啶(SAPA)及5-氨基水楊酸等藥物是UC治療的首選藥物,但伴隨嚴(yán)重的副作用,如腹痛、腹瀉等〔2,4〕。故尋找新的藥物治療UC至關(guān)重要。吳茱萸堿是一種從吳茱萸中分離出來(lái)的喹諾酮類生物堿,具有抗炎、抗腫瘤的生物活性,目前已被用于治療肥胖、炎癥和心血管疾病〔5〕。此外,研究表明吳茱萸堿通過(guò)調(diào)節(jié)核因子(NF)-κB、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(NLRP)3炎癥體,對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠具有潛在的保護(hù)作用〔6〕。研究普遍認(rèn)為,UC使成熟樹(shù)突細(xì)胞活化和敏感性增加,表達(dá)豐富的Toll樣受體(TLR),從而利用病原體的模式識(shí)別信號(hào)激活NF-κB等多種轉(zhuǎn)錄因子,從而觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)等更多促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生〔1〕。NF-κB是一種促炎轉(zhuǎn)錄因子,一旦激活,會(huì)觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),抑制NF-κB信號(hào)通路可以有效減輕葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的UC小鼠病情〔7〕,而高遷移率族蛋白(HMG)B1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路是重要的炎癥相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活可減輕炎癥反應(yīng),起到保護(hù)肝臟的作用,HMGB1被認(rèn)為是治療炎癥反應(yīng)和感染的潛在靶點(diǎn)〔8〕。但是吳茱萸堿通過(guò)HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路在UC中的作用尚不清楚。本研究制備UC大鼠模型,以HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路為切入點(diǎn),觀察吳茱萸堿治療對(duì)UC大鼠的影響,以探究吳茱萸堿的藥理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 8 w清潔級(jí)健康雌性大鼠60只,體質(zhì)量(250±20)g,購(gòu)自廣州銳格生物科技有限公司,許可證號(hào)SCXK(粵)2021-0059。動(dòng)物均按照動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則嚴(yán)格喂養(yǎng),溫度為(22±1)℃,濕度為60%。

1.2主要藥物及試劑 SAPA購(gòu)自江蘇遠(yuǎn)恒藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)H20056668;三硝基苯磺酸(TNBS)購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司,批號(hào)T97750;水合氯醛購(gòu)自青島宇龍海藻有限公司,批號(hào)H37022673;吳茱萸堿購(gòu)自源葉生物,批號(hào)B21315;蘇木素染液、伊紅染液購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,批號(hào)YYJK-923、230251;丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購(gòu)自南京建成,批號(hào)A001-1、A003-1-1;IL-6、IL-10、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(批號(hào)ab178013、ab255729、ab208348)及HMGB1、IL-6、IL-10、TNF-α、TLR-4、NF-κB p65、β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(批號(hào)ab18256、ab233706、ab133575、ab183218、ab22048、ab207297、ab254514、ab6721、ab6728)購(gòu)自美國(guó)Abcam;NF-κB p-p65購(gòu)自萬(wàn)類生物,批號(hào)ser536;Trizol試劑盒購(gòu)至賽默飛,批號(hào)12183555;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Genecopoeia公司,批號(hào)C0210B;尼康SMZ745光學(xué)顯微鏡購(gòu)于上海普赫生物科技有限公司。

1.3UC大鼠模型的制備 采用TNBS/乙醇混合法建立大鼠UC模型〔9〕:大鼠先禁食24 h,然后給予5% 6 ml/kg水合氯醛腹腔注射麻醉,將灌胃針從大鼠肛門處輕插至8 cm結(jié)腸處,并注入TNBS緩沖液(0.25 ml乙醇+100 mg/kg TNBS),隨后大鼠倒置5 min。正常組采取同樣方法灌腸等量0.9%生理鹽水。造模4 d后,隨機(jī)處死2只大鼠,分離結(jié)腸組織,肉眼觀察結(jié)腸組織出現(xiàn)充血、水腫、潰瘍等,表示該批次大鼠建模成功。

1.4動(dòng)物分組與給藥 將建模成功的50只大鼠隨機(jī)分為5組,每組10只,分別為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及吳茱萸堿低、中、高劑量組,取同期未建模大鼠10只為正常組。陽(yáng)性對(duì)照組灌胃0.6 g/kg SAPA,吳茱萸堿低、中、高劑量組分別灌胃給予等量的10、15、20 mg/kg吳茱萸堿溶劑,正常組、模型組給予灌胃等量生理鹽水,每天1次,連續(xù)1 w。

1.5各組大鼠一般情況的評(píng)價(jià) 在末次給藥后,對(duì)大鼠精神狀態(tài)、飲食、體質(zhì)量、運(yùn)動(dòng)及糞便性狀等生理活動(dòng)進(jìn)行觀察。

1.6各組結(jié)腸黏膜的形態(tài)學(xué)觀察 生理活動(dòng)觀察后,脫頸處死大鼠,獲取結(jié)腸組織,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗糞便,測(cè)量各組大鼠腸長(zhǎng)和腸重。一部分用于組織形態(tài)的觀察,一部分保存于-80 ℃。肉眼觀察結(jié)腸黏膜是否出現(xiàn)充血、水腫、潰瘍等情況,并對(duì)結(jié)腸黏膜損傷情況進(jìn)行評(píng)定〔9〕:0分:結(jié)腸無(wú)損傷;1分:結(jié)腸表面未發(fā)生糜爛,但出現(xiàn)輕度充血、水腫;2分:結(jié)腸黏膜未發(fā)生潰瘍,但出現(xiàn)輕、中度的充血、水腫、糜爛;3分:結(jié)腸黏膜表面潰瘍,出現(xiàn)壞死、高度充血、水腫,腸壁表面增厚;4分:潰瘍面積增大或全部腸壁均出現(xiàn)壞死。

1.7各組結(jié)腸組織病理學(xué)形態(tài)觀察 用4%多聚甲醛固定新鮮的結(jié)腸組織,常規(guī)石蠟包埋、切片(4 μmol/L)、脫蠟、蘇木素-伊紅(HE)染色、封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)形態(tài)。

1.8各組結(jié)腸組織中MDA、SOD含量測(cè)定 取各組大鼠結(jié)腸組織,用細(xì)胞裂解液裂解,勻漿后10 000 r/min離心10 min取上清,將各組上清樣本嚴(yán)格按照劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)MDA、SOD的含量。

1.9各組結(jié)腸組織中炎癥因子的水平測(cè)定 取各組大鼠結(jié)腸組織,加入適量生理鹽水,研磨后收集上清,按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒對(duì)結(jié)腸組織勻漿液中IL-6、IL-10、TNF-α水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.10各組結(jié)腸組織中IL-6、IL-10、TNF-α、HMGB1、NF-κB、TLR-4蛋白表達(dá)水平測(cè)定 各組大鼠結(jié)腸組織經(jīng)蛋白裂解液裂解后,冰浴40 min,4 ℃、12 000 r/min離心40 min,取上清,嚴(yán)格按照二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白含量。取20 μg蛋白樣品,電泳,轉(zhuǎn)膜,放入37 ℃封閉液中1 h,PBS清洗,加入一抗(IL-6、IL-10、TNF-α、HMGB1、TLR-4、β-actin、NF-κB p65、NF-κB p-p65抗體)分別稀釋到一定的比例,孵育、輕搖過(guò)夜,PBS清洗,加入二抗HRP羊抗鼠、羊抗兔,稀釋一定的比例,孵育,室溫輕搖1 h,PBS洗膜后采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)感光顯像觀察結(jié)果各組蛋白表達(dá)情況。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組一般情況的比較 與正常組相比,模型組大鼠有精神倦怠、嗜睡、飲食減少、大便黏膩、肛周污穢和體質(zhì)量減輕等明顯特征;與模型組相比,陽(yáng)性對(duì)照組精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)、飲食正常、大便成形、體質(zhì)量增加,吳茱萸堿各劑量組隨著劑量升高,精神狀態(tài)、飲食、大便、體質(zhì)量逐漸改善;與陽(yáng)性對(duì)照組相比,吳茱萸堿低劑量組精神狀態(tài)差、飲食偏少、體質(zhì)量偏輕,吳茱萸堿高劑量組以上指標(biāo)差異大。見(jiàn)表1。

2.2各組結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化情況 與正常組相比,模型組結(jié)腸黏膜出現(xiàn)明顯的充血、水腫、糜爛情況,腸長(zhǎng)明顯縮短、腸重顯著增加,腸黏膜損傷評(píng)分顯著升高(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性對(duì)照組和吳茱萸堿各劑量組腸黏膜充血、水腫、糜爛情況明顯減輕,腸長(zhǎng)明顯增長(zhǎng),腸重顯著減輕,腸黏膜損傷評(píng)分顯著降低(P<0.05);與陽(yáng)性對(duì)照組相比,吳茱萸堿低、中劑量組結(jié)腸黏膜充血、糜爛、水腫情況加重,腸長(zhǎng)顯著縮短,腸重顯著增加,腸黏膜損傷評(píng)分顯著升高(P<0.05),吳茱萸堿高劑量組結(jié)腸黏膜充血、水腫、糜爛情況無(wú)明顯變化,腸長(zhǎng)、腸重、結(jié)腸組織損傷評(píng)分無(wú)顯著性差異(P>0.05);吳茱萸堿各劑量組隨著劑量的升高,黏膜充血、糜爛、水腫情況逐漸改善,腸長(zhǎng)逐漸增長(zhǎng),腸重逐漸減輕,腸黏膜損傷評(píng)分逐漸降低,兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3各組結(jié)腸組織的病理學(xué)形態(tài)變化 與正常組比較,模型組結(jié)腸遭到嚴(yán)重破壞,腸黏膜組織出現(xiàn)潰瘍,杯狀細(xì)胞數(shù)量減少,有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比,陽(yáng)性對(duì)照組和吳茱萸堿各劑量組結(jié)腸組織的損傷明顯減輕,杯狀細(xì)胞數(shù)量增加,出現(xiàn)少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較,吳茱萸堿低、中劑量組杯狀細(xì)胞數(shù)量減少,有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),吳茱萸堿高劑量組結(jié)腸組織病理變化無(wú)明顯差異;吳茱萸堿各劑量組隨著劑量的升高,結(jié)腸組織的損傷逐漸減輕。見(jiàn)圖1。

表1 各組腸長(zhǎng)、腸重及結(jié)腸組織損傷評(píng)分及結(jié)腸組織炎癥因子比較

圖1 各組結(jié)腸組織(HE染色,×200)

2.4吳茱萸堿對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織MDA、SOD含量的影響 與正常組比較,模型組結(jié)腸組織中MDA含量顯著升高,SOD含量顯著降低(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性對(duì)照組、吳茱萸堿各劑量組結(jié)腸組織中MDA含量顯著降低,SOD含量升高(P<0.05);與陽(yáng)性對(duì)照組比較,吳茱萸堿低、中劑量組結(jié)腸組織中MDA含量升高,SOD含量降低(P<0.05),吳茱萸堿高劑量組結(jié)腸組織中以上指標(biāo)無(wú)顯著性差異(P>0.05);隨著吳茱萸堿劑量升高,結(jié)腸組織中MOD含量逐漸下降,SOD含量逐漸增高,兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.5吳茱萸堿對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織中炎癥因子的影響 與正常組相比,模型組結(jié)腸組織中IL-6、TNF-α含量顯著升高,IL-10含量顯著降低(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性對(duì)照組、吳茱萸堿各劑量組結(jié)腸組織中IL-6、TNF-α的含量顯著降低,IL-10含量顯著升高(P<0.05);與陽(yáng)性對(duì)照組比較,吳茱萸堿低、中劑量組結(jié)腸組織中IL-6、TNF-α的含量顯著升高,IL-10含量顯著降低(P<0.05),吳茱萸堿高劑量組IL-6、IL-10、TNF-α含量無(wú)顯著性差異(P>0.05);隨著吳茱萸堿劑量的升高,結(jié)腸組織中IL-6、TNF-α的含量逐漸下降,IL-10的含量逐漸升高,兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.6吳茱萸堿對(duì)結(jié)腸組織中IL-6、IL-10、TNF-α、HMGB1、NF-κB、TLR-4蛋白表達(dá)水平的影響 與正常組相比,模型組結(jié)腸組織中IL-6、TNF-α、HMGB1、TLR-4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白水平顯著升高,IL-10的蛋白水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性對(duì)照組、吳茱萸堿各劑量組結(jié)腸組織中IL-6、TNF-α、HMGB1、TLR-4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白水平顯著降低,IL-10的蛋白水平升高(P<0.05);與陽(yáng)性對(duì)照組相比,吳茱萸堿低、中劑量組結(jié)腸組織中L-6、TNF-α、HMGB1、TLR-4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白水平顯著升高,IL-10的蛋白水平顯著降低(P<0.05),吳茱萸堿高劑量組大鼠結(jié)腸組織中各蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P>0.05);隨著吳茱萸堿劑量的升高,結(jié)腸組織中L-6、TNF-α、HMGB1、TLR-4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白水平逐漸下降,IL-10蛋白水平逐漸升高,兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖2。

表2 各組結(jié)腸組織MDA、SOD含量及炎癥因子比較

表3 吳茱萸堿對(duì)結(jié)腸組織中IL-6、IL-10、TNF-α、HMGB1、NF-κB、TLR-4蛋白表達(dá)水平的影響

1～6:正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿中劑量組、吳茱萸堿高劑量組圖2 吳茱萸堿對(duì)大鼠結(jié)腸組織中IL-6、IL-10、TNF-α、 HMGB1、NF-κB、TLR-4蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

UC是一種病因不明,主要以腹痛、腹瀉、黏液膿血便等為癥狀的慢性腸道非特異性疾病〔10〕,UC發(fā)病主要是從直腸開(kāi)始,延伸至結(jié)腸,具有反復(fù)和腸黏膜炎癥的特征,若治療不當(dāng),會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的腸道損傷,增加住院、手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)〔1〕。TNBS是半抗原物質(zhì),進(jìn)入機(jī)體可造成結(jié)腸炎癥反應(yīng)〔11〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TNBS乙醇混合法制備UC模型,且建模成功。

吳茱萸堿是一種藥用植物,可應(yīng)用在多種疾病的治療中。Wang等〔5〕首次描述吳茱萸堿可用于調(diào)節(jié)嗜酸乳桿菌,以增加結(jié)腸炎腸道中醋酸鹽的產(chǎn)生,從而預(yù)防或治療UC。吳茱萸堿可調(diào)控NF-κB、NLRP3炎癥小體,對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎有潛在的保護(hù)作用,并可能有助于預(yù)防和治療UC〔6〕。楊哲等〔12〕發(fā)現(xiàn),吳茱萸堿能有效減輕由葡聚糖硫酸鈉所造成的結(jié)腸組織損傷,通過(guò)減輕炎癥、氧化應(yīng)激來(lái)治療UC。本研究結(jié)果表明,吳茱萸堿可緩解UC的癥狀,且具有很好的療效。

HMGB1是一種高度保守的核蛋白,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞分布廣泛。細(xì)胞外HMGB1可與TLR-2、TLR-4、TLR-9結(jié)合,促發(fā)TNF-α和IL等炎癥信號(hào),從而激活炎癥反應(yīng)〔13〕。TLR是一種被廣泛研究的跨膜蛋白受體,在炎癥、免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用〔14〕。TLR-4/NF-κB信號(hào)通路是經(jīng)典的炎癥介導(dǎo)通路,抑制其激活可減輕炎癥對(duì)心、肝、肺等重要器官損傷,起到保護(hù)作用〔14,15〕。細(xì)胞外的HMGB1與TLR-4結(jié)合,可激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65,并介導(dǎo)炎癥因子TNF-α和IL的釋放〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制HMGB1/TLR-4/NF-κB信號(hào)通路,可減輕炎癥反應(yīng),從而對(duì)機(jī)體起到的保護(hù)作用〔7〕。本研究結(jié)果表明,氧化應(yīng)激和HMGB1/TLR-4/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與UC發(fā)病過(guò)程;吳茱萸堿可抑制HMGB1/TLR-4/NF-κB信號(hào)通路激活,降低炎癥及氧化應(yīng)激水平,可通過(guò)抗氧化、抗炎作用改善UC大鼠腸黏膜病理形態(tài),減輕病情。

綜上,吳茱萸堿通過(guò)抑制HMGB1/TLR-4/NF-κB信號(hào)通路,降低腸黏膜中MDA含量,增加SOD含量來(lái)抑制氧化應(yīng)激,降低炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá),促進(jìn)IL-10的表達(dá),抑制腸黏膜的炎癥反應(yīng)。吳茱萸堿能通過(guò)其抗氧化、抗炎作用緩解潰瘍性腸炎的發(fā)生。本研究可為探討吳茱萸堿預(yù)防或治療UC的機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。