張 紅,田秋豐,王志強(qiáng),黃宇翔,鄒 躍,呂明哲,楊昊天,馬志剛,霍明東,董佳強(qiáng),楊 坤,魏念冬,苗 艷,鐘 鵬,陳志峰

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院,黑龍江 齊齊哈爾 161005)

星狀病毒(Astrovirus,AstV)為單股正鏈無(wú)囊膜結(jié)構(gòu)的RNA病毒。目前,星狀病毒科(Astroviridae)可分為2個(gè)屬,即哺乳動(dòng)物星狀病毒屬和禽星狀病毒屬。哺乳動(dòng)物星狀病毒屬感染的宿主包括人類和一些哺乳動(dòng)物,禽星狀病毒屬感染的宿主包括雞、火雞、鴨、鵝和其他鳥(niǎo)類[1]。AstV具有高度的遺傳多樣性和基因重組潛力,因此存在跨物種傳播的可能性[2,3]。鵝感染星狀病毒后主要引起雛鵝心臟、肝臟和腎臟尿酸鹽沉積,導(dǎo)致痛風(fēng)、跛行、生產(chǎn)性能下降甚至死亡[4,5]。該病的發(fā)病地域非常廣泛,給養(yǎng)鵝業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6,7]。本試驗(yàn)以黑龍江省齊齊哈爾市某鵝場(chǎng)內(nèi)發(fā)生雛鵝痛風(fēng)的病死雛鵝為研究對(duì)象,進(jìn)行病原分離、病毒株傳代培養(yǎng)、PCR擴(kuò)增、基因序列分析和動(dòng)物回歸試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果可為鵝星狀病毒(Goose astrovirus,GoAstV)的進(jìn)一步深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 2019年5月,黑龍江省齊齊哈爾市某鵝場(chǎng)養(yǎng)殖10 000只雛鵝,于5日齡開(kāi)始發(fā)病,13日齡死亡雛鵝數(shù)量達(dá)到2 000只,低溫送檢10只具有痛風(fēng)癥狀的病死雛鵝,無(wú)菌采集病死雛鵝的脾臟、肝臟和腎臟,放入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 12胚齡健康鵝胚和1日齡健康雛鵝,均購(gòu)自齊齊哈爾山海養(yǎng)殖專業(yè)合作社,經(jīng)檢測(cè),GoAstV、小鵝瘟病毒(Goose parvovirus,GPV)、鵝副黏病毒(Goose paramyxoviru,GPMV)、禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)和坦布蘇病毒(Tembusu virus,TMUV)抗原均為陰性。

1.1.3 主要試劑 病毒DNA/RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒,均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix PrimeSTAR HS、pMDTM19-T載體、PCR產(chǎn)物快速連接試劑盒和DNA Marker(DL2 000),均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;DH5α感受態(tài)細(xì)胞,購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要儀器 基因擴(kuò)增儀(T30,杭州朗基科學(xué)儀器有限公司);微型高速離心機(jī)(MiniSpan Plus,杭州奧盛儀器有限公司);干式恒溫器(MK-20,杭州奧盛儀器有限公司);恒溫水槽(DK-8D,上海一恒科學(xué)儀器有限公司);全自動(dòng)多功能孵化機(jī)(D247,德州富民孵化設(shè)備研制中心);電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH-4000Ⅱ型,天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 將采集的肝臟、脾臟和腎臟組織病料放入研缽中,按組織重量與生理鹽水1∶5加入0.9%生理鹽水,一邊加入生理鹽水一邊充分研磨,制備懸液,反復(fù)凍融3次,8 000 r/min離心10 min,取上清于干凈的EP管中。用0.22 μm濾器對(duì)上清液進(jìn)行過(guò)濾除菌,并經(jīng)尿囊膜接種于12日齡鵝胚,接種劑量為0.3 mL/枚,共接種6枚。置38 ℃孵育,每日觀察鵝胚死亡情況,棄去24 h內(nèi)死亡鵝胚,收集168 h內(nèi)死亡鵝胚的尿囊液和胚體。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中已發(fā)表GoAstV毒株HLJ01全基因序列(登錄號(hào)為MN175321),使用Oligo7.0和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)引物,引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物信息Table 1 PCR primer details

1.2.3 PCR擴(kuò)增 將收集到的死亡鵝胚尿囊液,按照病毒DNA/RNA抽提試劑盒說(shuō)明書操作,抽提尿囊液的總DNA/RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用抽提的DNA或反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,分別進(jìn)行GoAstV、GPV、GPMV、TMUV和FAdV的PCR檢測(cè)。GoAstV反應(yīng)體系(50 μL):2×Master Mix 25 μL,上、下游引物各1 μL,模板2 μL,超純水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,53 ℃(GoAstVORF2-1)、55 ℃(GoAstVORF2-2)和57 ℃(GoAstVORF2-3)退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。GPV、GPMV、TMUV和FADV的PCR檢測(cè)方法參照參考文獻(xiàn)[8-10],PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 PCR產(chǎn)物序列測(cè)定和分析 PCR產(chǎn)物膠回收后連接pMD19TM-T載體,送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序所得結(jié)果拼接,將所得序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast同源性比對(duì),與GenBank已發(fā)布的其他不同種屬星狀病毒進(jìn)行同源性分析,運(yùn)用MEGA 7.0軟件和鄰接法(Neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將30只1日齡健康雛鵝隨機(jī)分成2個(gè)組,試驗(yàn)組20只,對(duì)照組10只,隔離飼養(yǎng)。試驗(yàn)組皮下接種純化后毒株的F3代尿囊液,1.0 mL/只,對(duì)照組接種相同劑量的無(wú)菌生理鹽水。每日觀察并記錄2個(gè)組雛鵝的發(fā)病和死亡情況。對(duì)接種后發(fā)病死亡的雛鵝進(jìn)行及時(shí)剖檢,觀察各組織臟器和關(guān)節(jié)等處的病理變化。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離 將疑似感染GoAstV病鵝的組織研磨濾液接種鵝胚,其在鵝胚上可以穩(wěn)定傳代,連傳3代,鵝胚集中在72～168 h死亡,死亡率約達(dá)90%,死亡鵝胚尿囊膜增厚并有尿酸鹽沉積,胚體嚴(yán)重充血、水腫、呈潮紅色(圖1)。

圖1 死亡鵝胚的胚體變化Fig.1 Embryo body changes in dead goose embryosA:胚體充血、水腫、呈潮紅色; B:尿囊膜增厚A:Embryonic congestion, edema and appearing bright-red; B:Thickening of the allantoic membrane

2.2 PCR擴(kuò)增 結(jié)果顯示,僅GoAstV為陽(yáng)性,GPV、GPMV、TMUV和FAdV均為陰性。分離毒株在約600、700和800 bp處出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的目的條帶(圖2),表明分離病毒為GoAstV,命名為Goose Astrovirus/Heilongjiang/QS1/2022株(簡(jiǎn)稱QS1株)。

圖2 分離毒株的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of the isolated strainsM:DL-2 000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～3:鵝星狀病毒; 4:小鵝瘟病毒; 5:鵝副黏病毒; 6:坦布蘇病毒;7:禽腺病毒; 8:陰性對(duì)照M:DL-2 000 DNA Marker; 1-3:GoAstV; 4:GPV; 5:GPMV;6:TMUV; 7:FAdV; 8:Negative control

2.3 PCR產(chǎn)物序列測(cè)定和分析 將分離毒株QS1的基因序列測(cè)序結(jié)果與GenBank上已發(fā)表的其他星狀病毒的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較,結(jié)果顯示,分離毒株QS1與近年來(lái)報(bào)道引起痛風(fēng)的新型GoAstV毒株HNSQ-6、HNKF-1、HNNY0620和XT1的核苷酸同源性較高,達(dá)99.58%～99.72%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖3所示,分離毒株QS1與同源性較高的GoAstV毒株HNSQ-6、HNKF-1、HNNY0620和XT1在同一分支上;與其他GoAstV毒株FLX、AHDY和SCCD處于同一進(jìn)化分支中不同的進(jìn)化亞分支;與鴨源星狀病毒遺傳距離較遠(yuǎn)。由此可見(jiàn),導(dǎo)致該鵝場(chǎng)出現(xiàn)鵝痛風(fēng)的星狀病毒為GoAstV 2型。

圖3 分離毒株QS1與其他星狀病毒的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic evolutionary tree of isolated QS1 strain and other AstV strains▲:本試驗(yàn)分離毒株QS1▲:QS1 strain isolated in this study

2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 試驗(yàn)組雛鵝接種分離毒株F3代尿囊液48 h后出現(xiàn)臨床癥狀,表現(xiàn)為精神沉郁,食欲不振,呆立;72 h后開(kāi)始出現(xiàn)死亡,死亡率為70%,發(fā)病率為100%。病死雛鵝及時(shí)剖檢可見(jiàn)心臟、肝臟表面有大量尿酸鹽沉積;腎臟明顯腫大,表面偶有尿酸鹽沉積,輸尿管變粗,內(nèi)有大量白色石灰樣沉淀物;膽囊腫大,顏色變淺,內(nèi)有白色石灰樣結(jié)晶顆粒;剖開(kāi)腕關(guān)節(jié)可見(jiàn)白色石灰樣沉積物(圖4)。試驗(yàn)組未死亡雛鵝比對(duì)照組雛鵝明顯消瘦。對(duì)照組雛鵝未見(jiàn)明顯臨床癥狀,無(wú)死亡。

圖4 病死雛鵝剖檢觀察Fig.4 Autopsy observation of dead goslingsA:腕關(guān)節(jié)處有石灰樣尿酸鹽沉積; B:整個(gè)心臟、部分肝臟表面有石灰樣尿酸鹽沉積; C:腎臟腫脹,輸尿管變粗,內(nèi)有大量石灰樣尿酸鹽沉積; D:膽囊腫大,內(nèi)有石灰樣結(jié)晶顆粒A: Lime-like urate deposits at the wrist joint; B: Lime-like urate deposits on the entire surface of the heart and part of the liver; C: Swollen kidneys, dilated ureters with abundant lime-like urate deposits; D: Enlarged gallbladder with lime-like crystalline particles inside

3 討論

禽星狀病毒已被證明在家禽中與腹瀉、生長(zhǎng)抑制、腎炎和腸炎有關(guān)[11]。自2016年以來(lái),我國(guó)各地均有報(bào)道以雛鵝發(fā)生痛風(fēng)為特征的病例[12,13],鵝感染AstV后主要引起雛鵝心臟、肝臟和腎臟尿酸鹽沉積,導(dǎo)致痛風(fēng)、跛行、生產(chǎn)性能下降,給養(yǎng)鵝業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

本試驗(yàn)分離鑒定的QS1株經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示,分離毒株QS1屬于禽星狀病毒的1個(gè)新毒株,與近年來(lái)報(bào)道引起痛風(fēng)的新型GoAstV的核苷酸同源性最高。致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示,QS1感染雛鵝后發(fā)病率為100%,死亡率為70%,屬于強(qiáng)毒株。而Zhang等[14]從具有痛風(fēng)癥狀的雛鵝中分離鑒定出1種新型GoAstV,致病性試驗(yàn)表明,所有感染的雛鵝在感染后2周內(nèi)均存活。這與本致病性試驗(yàn)結(jié)果截然不同,可能與感染途徑、劑量和年齡存在差異有關(guān)。

有報(bào)道顯示,感染GoAstV死亡雛鵝的腎小管內(nèi)存在蛋白物質(zhì),表明GoAstV可以導(dǎo)致腎組織上皮細(xì)胞通透性增強(qiáng),腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生變性、壞死,導(dǎo)致雛鵝腎臟功能損傷[15-17]。本試驗(yàn)剖檢試驗(yàn)組雛鵝時(shí),可見(jiàn)輸尿管內(nèi)有大量的尿酸鹽沉積。嚴(yán)重的尿酸沉積可能會(huì)阻塞腎小管,造成腎組織損傷,從而減少尿酸排泄,使血液中尿酸含量增加[18,19]。尿酸通過(guò)血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至身體的各個(gè)器官,因此,心臟、肝臟和腎臟等血液灌注量大的器官,痛風(fēng)病變更為明顯。本試驗(yàn)結(jié)果與Zhang等[20]和Yin等[21]報(bào)道的結(jié)果基本一致,由此可見(jiàn),GoAstV感染引起的雛鵝腎臟損傷可能是導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的主要原因。

AstV全基因組均包含3個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open reading frame,ORF),分別為ORF1a、ORF1b和ORF2。ORF1a和ORF1b基因編碼非結(jié)構(gòu)蛋白;ORF2基因編碼衣殼蛋白的前體結(jié)構(gòu)蛋白,在蛋白水解成熟、病毒傳染性、病毒與宿主抗體和補(bǔ)體相互作用及病毒入侵宿主細(xì)胞中發(fā)揮重要作用[22,23]。本試驗(yàn)為將ORF2基因成功擴(kuò)增,根據(jù)基因序列共設(shè)計(jì)3對(duì)引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了分離毒株QS1的3段ORF2基因序列,為下一步表達(dá)相關(guān)蛋白和后續(xù)試驗(yàn)提供參考。

經(jīng)GoAstV感染的雛鵝除痛風(fēng)表現(xiàn)外,還會(huì)出現(xiàn)食欲不振或廢絕,從而嚴(yán)重抑制生長(zhǎng)[24,25],即使發(fā)病后未死亡雛鵝,其飼料轉(zhuǎn)化率也會(huì)嚴(yán)重下降,造成生長(zhǎng)緩慢,給鵝產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[26]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),低溫、高濕、通風(fēng)條件差和飼養(yǎng)管理不到位是導(dǎo)致雛鵝發(fā)病率和死亡率高的主要原因,此外,飼料中的高蛋白水平是否會(huì)促進(jìn)痛風(fēng)的發(fā)生還需要進(jìn)一步研究。目前,針對(duì)新型GoAstV引起的雛鵝痛風(fēng)尚無(wú)有效的治療措施,預(yù)防GoAstV也無(wú)商品化疫苗,因此預(yù)防GoAstV感染,應(yīng)規(guī)范飼養(yǎng)管理、減少鵝應(yīng)激和加強(qiáng)對(duì)鵝舍的消毒。對(duì)于發(fā)病的場(chǎng)區(qū)要嚴(yán)格消毒、嚴(yán)格隔離和嚴(yán)禁帶毒鵝的流通擴(kuò)散。加快滅活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗的研制,通過(guò)對(duì)鵝群免疫接種,獲得免疫力和保護(hù)力是預(yù)防本病的有效手段。

本試驗(yàn)從黑龍江省齊齊哈爾市某鵝場(chǎng)采集具有痛風(fēng)癥狀雛鵝的病變組織,通過(guò)鵝胚分離、PCR擴(kuò)增、基因序列分析和動(dòng)物回歸試驗(yàn)證實(shí)鵝痛風(fēng)病的致病原為GoAstV,命名為QS1株。遺傳進(jìn)化分析表明,該病毒分離株與近年來(lái)新型GoAstV分離株同源性較高,可引起雛鵝死亡,死亡率可達(dá)70%。本試驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)GoAstV疫苗和診斷試劑的研制提供了原材料。