鄒 宏,羅 干,李 玲,夏應(yīng)菊,徐 璐,趙俊杰,張乾義

(1. 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,國(guó)家/WOAH豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室,北京 海淀 100081 ;2. 重慶市萬(wàn)州區(qū)畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心,重慶 萬(wàn)州 404100)

隨著豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)C株疫苗株的發(fā)現(xiàn)[1],通過(guò)科學(xué)的生物安全防控措施和疫苗接種策略,豬瘟(Classical swine fever,CSF)在大多數(shù)國(guó)家已被成功消滅,但在一些養(yǎng)豬體量大的國(guó)家,如印度和越南等,豬瘟仍難以消滅,且還存在著慢性豬瘟和非典型豬瘟的流行,導(dǎo)致豬瘟的流行趨勢(shì)更加復(fù)雜多樣[2]。CSFV基因組長(zhǎng)度約為 12.3 kb,包含1個(gè)開(kāi)放閱讀框和2個(gè)非編碼區(qū)(Untranslated region,UTR),翻譯成1種多聚蛋白[3],該多聚蛋白在病毒和宿主細(xì)胞酶的作用下形成4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、Erns、E1和E2)和8種非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B),這些蛋白在CSFV的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、致病作用和免疫逃避中發(fā)揮重要作用[4]。其中,非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B被證實(shí)參與CSFV生命周期內(nèi)病毒的復(fù)制、翻譯、致病作用和免疫逃避,但其具體機(jī)理尚不清楚[5]。

在黃病毒科(Flaviviridae)人獸共患傳染病病原體中,登革熱病毒(Dengue virus,DV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)等的NS4B蛋白已被大量研究報(bào)道[6]。通過(guò)對(duì)黃病毒科NS4B蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和核酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),CSFV的NS4B蛋白和牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的同源性最高,研究發(fā)現(xiàn)CSFV和BVDV有相似的血清抗原,存在60%以上的同源性[7]。但關(guān)于CSFV和BVDV NS4B蛋白的相關(guān)研究報(bào)道較少,因此只能依賴其他黃病毒科NS4B蛋白的研究資料推導(dǎo)CSFV NS4B蛋白可能存在的相關(guān)作用機(jī)理,如其與DExD-box 解旋酶 39B(DExD-box helicase 39B,DDX39B)、核糖體蛋白L15(Ribosomal protein L15,RPL15)和核糖體蛋白S3(Ribosomal protein S3,RPS3)等蛋白的相互作用[8]。本文對(duì)CSFV NS4B蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其與宿主其他蛋白的相互作用方面進(jìn)行概述,以期為CSFV致病機(jī)理研究和感染防控提供參考。

1 CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B的結(jié)構(gòu)和功能

通過(guò)對(duì)黃病毒科瘟病毒屬NS4B蛋白的對(duì)比發(fā)現(xiàn),CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B與BVDV相似性最高,也是一種疏水性膜蛋白[9],分子質(zhì)量大小約為38 kDa,由NS3蛋白切割而來(lái)[10]。預(yù)測(cè)NS4B蛋白包含4個(gè)由跨膜區(qū)域隔開(kāi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域,兩側(cè)是位于細(xì)胞質(zhì)中的 N 端和 C 端區(qū)域,C 端區(qū)域包含2個(gè)螺旋結(jié)構(gòu),N端區(qū)域包含2個(gè)保守的親性螺旋,在NS4B蛋白被切割時(shí)可以變成跨膜結(jié)構(gòu)域[11],且N端結(jié)構(gòu)域在CSFV RNA復(fù)制和致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。

Thompson等[13]在HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)保守的核苷酸結(jié)合基序,該基序能水解三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)、三磷酸鳥(niǎo)苷(Guanosine triphosphate,GTP)和二磷酸鳥(niǎo)苷(Guanosine diphosphate,GDP),還具有核苷三磷酸(Nucleoside triphosphate,NTP)激酶活性,對(duì)HCV的體外復(fù)制、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成至關(guān)重要,且該基序在瘟病毒屬中也同樣存在。在CSFV中,該基序包含Walker A和Walker B兩個(gè)基序,位于NS4B蛋白C末端氨基酸殘基第209～216位和第335～342位[5]。Walker A基序由富含G的磷酸鹽結(jié)合環(huán)組成,其共識(shí)序列為G/AXXXXGKS/T(其中X可以是任何殘基),參與NTP的β-磷酸鹽和γ-磷酸鹽結(jié)合;Walker B基序由Asp殘基組成,其前有一段疏水氨基酸(h)hhhhD或hhhhDD/E,能螯合Mg-NTP復(fù)合物的Mg2+,共識(shí)序列為DXXG[14]。Gladue等[5]通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CSFV NS4B蛋白的NBM基序同樣能水解ATP、GTP和GDP,具有NTP激酶活性,這種活性是由Walker A和Walker B基序介導(dǎo)的。通過(guò)對(duì)Walker A或Walker B基序特定氨基酸的突變發(fā)現(xiàn),Walker A基序?qū)TP激酶活性的影響大于Walker B基序,這可能與Walker B基序的高度保守有關(guān)。與其他瘟病毒屬Walker A基序不同,CSFV NS4B蛋白中的Walker A基序在GKS/T特征序列中缺乏保守的K殘基,其中K被V或I取代,K殘基與NTP帶負(fù)電荷的β-磷酸和γ-磷酸相互作用,從而在體外促進(jìn)ATP和GTP的水解[15]。研究發(fā)現(xiàn),NTP激酶活性可影響CSFV蛋白對(duì)核苷酸的結(jié)合和水解所介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、膜運(yùn)輸和膜融合,在病毒復(fù)制、活力和毒力中起關(guān)鍵作用[16]。

Tamura等[17]鑒定出CSFV NS4B蛋白中不在NTP激酶基序內(nèi)的2個(gè)氨基酸,分別位于N端第2 475位和C端第2 563位,取代這2個(gè)位置可以影響NS4B復(fù)制酶復(fù)合物的穩(wěn)定性,并影響CSFV RNA復(fù)制的效率和病毒的毒力。此外,有研究在CSFV NS4B蛋白 C端區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了Toll-白細(xì)胞介素-1受體(Toll-interleukin-1 receptor,TIR)樣結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)保守基序:box 1、box 2 和box 3[16]。TIR結(jié)構(gòu)域能參與Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),促進(jìn)各種外源性或內(nèi)源性微生物成分的識(shí)別,激活宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)[18]。對(duì)CSFV強(qiáng)毒株(BICv)NS4B蛋白的box 1進(jìn)行突變可導(dǎo)致病毒活力喪失;對(duì)box 2進(jìn)行替換可導(dǎo)致病毒毒力衰減,僅在扁桃體中局部復(fù)制,表明TIR結(jié)構(gòu)域不僅在CSFV復(fù)制中發(fā)揮作用,還參與CSFV的致病過(guò)程。

2 CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B與宿主蛋白的相互作用

黃病毒科病毒NS4B蛋白與其他蛋白的相互作用常有報(bào)道,如HCV NS4B蛋白抑制雙鏈RNA觸發(fā)的干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)介導(dǎo)的干擾素(Interferon,IFN)產(chǎn)生[19];DV NS4B蛋白的表達(dá)可通過(guò)干擾信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)磷酸化來(lái)阻斷IFN誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[20];BVDV中NS4B蛋白殘基第15位的突變(Y至C)會(huì)導(dǎo)致病毒對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生致病性[21]。在CSFV感染中,Lv等[22]也篩選出14種與NS4B蛋白相互作用的宿主蛋白,包括DDX39B蛋白、細(xì)胞色素C氧化酶亞基 7C(Cytochrome C oxidase subunit 7C,COX7C)蛋白、鐵蛋白重鏈(Ferritin heavy chain 1,FTH1)蛋白、線粒體抗病毒信號(hào)(Mitochondrial antiviral signaling,MAVS)蛋白、核受體亞族2,F組第6號(hào)成員(Nuclear receptor subfamily 2,group F,member 6,NR2F6)蛋白、核糖體蛋白側(cè)柄亞基 P1(Ribosomal protein lateral peduncle subunit P1,RPLP1)蛋白、26S蛋白酶調(diào)節(jié)亞基6B(26S protease regulatory subunit 6B,PSMC4)蛋白、纖維蛋白原樣 2(Fibrinogen like 2,FGL2)蛋白、Makorin環(huán)指蛋白1(Makorin ring finger protein 1,MKRN1)蛋白、RPL15蛋白、RPS3蛋白、Rab22a(Rab protein 22a,Rab22a)蛋白、腫瘤蛋白 p53 結(jié)合蛋白 2(Tumor protein p53 binding protein 2,TP53BP2)和TANK結(jié)合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1),這些蛋白參與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物調(diào)控、催化反應(yīng)和蛋白定位等過(guò)程,在宿主細(xì)胞代謝中發(fā)揮作用,但具體的相互作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

2.1 NS4B與RPLP1相互作用 Zhang等[23]通過(guò)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)試驗(yàn)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase,GST)融合蛋白沉降技術(shù)和共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)RPLP1與CSFV NS4B蛋白相互作用,用慢病毒介導(dǎo)敲低RPLP1可抑制CSFV生長(zhǎng),過(guò)表達(dá)RPLP1可促進(jìn)CSFV增殖,且CSFV感染會(huì)明顯上調(diào)RPLP1的表達(dá)。RPLP1蛋白是60S 核糖體亞基的重要組成成分,負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)翻譯的延伸,可作為病毒粒子的受體蛋白參與病毒粒子的復(fù)制和組裝等[24]。研究發(fā)現(xiàn),核糖體蛋白 S25(Ribosomal protein S25,RPS25)在HCV內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal ribosome entry sites,IRES)介導(dǎo)的病毒蛋白的翻譯中起促進(jìn)作用,一旦RPS25耗盡,HCV的傳播就會(huì)受損,而RPLP1對(duì)CSFV的IRES活性卻沒(méi)有影響[6]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在CSFV感染的第1個(gè)生命周期內(nèi),RPLP1會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)外子代病毒滴度和E2蛋白的表達(dá),但不影響細(xì)胞內(nèi)病毒基因組的復(fù)制和蛋白合成,推測(cè)RPLP1主要在CSFV基因組的翻譯中起作用,其C端第66～114位氨基酸與NS4B蛋白相結(jié)合[13]。

2.2 NS4B與FHC相互作用 鐵蛋白重鏈(Ferritin heavy chain,FHC)是一種鐵蛋白,可將Fe2+轉(zhuǎn)化為Fe3+,并降低細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量,防止ROS的細(xì)胞毒性,此外,FHC還可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的產(chǎn)生[25]。Qian等[26]研究發(fā)現(xiàn),用慢病毒介導(dǎo)敲低FHC會(huì)抑制CSFV復(fù)制,過(guò)表達(dá)FHC會(huì)增強(qiáng)CSFV傳播,且NS4B蛋白表達(dá)會(huì)上調(diào)FHC表達(dá),進(jìn)一步研究表明,FHC可促進(jìn)CSFV增殖和抗細(xì)胞凋亡,但具體的作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究,且 FHC的抗凋亡作用依賴于其濃度,超過(guò)閾值時(shí),其細(xì)胞毒性作用會(huì)抑制CSFV生長(zhǎng);而CSFV病毒滴度過(guò)高會(huì)擾亂FHC蛋白與CSFV之間的平衡,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

2.3 NS4B與Rab22a相互作用 Rab22a蛋白作為Ras相關(guān)GTP結(jié)合蛋白(Ras-related GTP-binding protein,Rab)家族成員之一,在囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[27]。劉雅茹[28]通過(guò)激光共聚焦、co-IP和GST pull-down試驗(yàn)證實(shí)了Rab22a與NS4B蛋白相互作用,干擾細(xì)胞Rab22a會(huì)顯著抑制 CSFV的復(fù)制過(guò)程,過(guò)表達(dá)Rab22a則會(huì)促進(jìn)CSFV的復(fù)制和增殖;對(duì) Rab22a 進(jìn)行突變也能抑制CSFV的復(fù)制和增殖,進(jìn)一步證明了Rab22a對(duì)CSFV復(fù)制的促進(jìn)作用。CSFV作為囊膜病毒,在感染早期可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用入侵細(xì)胞,并在多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下運(yùn)送至復(fù)制靶點(diǎn)進(jìn)行病毒的復(fù)制和增殖,而 Rab5蛋白和Rab7蛋白是CSFV在入侵宿主細(xì)胞后,病毒從早期內(nèi)體演變?yōu)橥砥趦?nèi)體的關(guān)鍵因子[29],病毒入侵后先形成早期內(nèi)體,后形成晚期內(nèi)體,在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境pH發(fā)生變化后發(fā)生囊膜融合,最后病毒暴露核酸進(jìn)行增殖[30]。有研究報(bào)道顯示,Rab22a-Rab5-NS4B的相互結(jié)合可促進(jìn)CSFV的復(fù)制,但具體機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究[31]。

2.4 NS4B與FASN相互作用 有研究表明,CSFV膜結(jié)構(gòu)的形成需要脂肪酸的生物合成,該過(guò)程受脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FASN)的調(diào)節(jié),而CSFV NS4B蛋白在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體膜網(wǎng)的組裝中發(fā)揮重要作用[32]。Liu等[33]研究發(fā)現(xiàn),脂肪酸合成途徑中的2種限速酶會(huì)影響CSFV復(fù)制,FASN抑制劑會(huì)破壞CSFV的復(fù)制,但不影響病毒的內(nèi)吞,表明FASN對(duì)CSFV的積極作用;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)NS4B蛋白會(huì)導(dǎo)致與NS4B相互作用的FASN上調(diào),其相互作用位置主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng);脂滴(Lipid droplets,LDs)上的Rab18可通過(guò)與NS4B蛋白相互作用調(diào)節(jié)NS4B與FASN的作用,進(jìn)一步增加LDs的數(shù)量,促進(jìn)CSFV的復(fù)制。

2.5 NS4B與MAVS相互作用 在識(shí)別CSFV感染的過(guò)程中,各種模型識(shí)別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)在宿主的先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,CSFV可以被維甲酸誘導(dǎo)基因蛋白I樣受體[The retinoid acid-inducible gene-I (RIG-I) like receptors,RLRs]識(shí)別,并與MAVS蛋白結(jié)合,激活免疫反應(yīng)[34]。Dong 等[35]研究發(fā)現(xiàn),CSFV感染可導(dǎo)致豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs)中MAVS表達(dá)增加,MAVS可增強(qiáng)抗病毒和促炎細(xì)胞因子的誘導(dǎo)和細(xì)胞凋亡,并可抑制CSFV的復(fù)制;但CSFV Npro蛋白可抑制MAVS誘導(dǎo)的干擾素和促炎細(xì)胞因子的釋放以及細(xì)胞凋亡,且IRF3敲低也可抑制MAVS誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞防御,表明Npro蛋白能通過(guò)降解IRF3來(lái)抑制MAVS介導(dǎo)的宿主細(xì)胞防御。Dong等[36]研究發(fā)現(xiàn),CSFV NS4B蛋白可與MAVS相互作用,NS4B的表達(dá)不影響 MAVS 的表達(dá),但會(huì)抑制MAVS介導(dǎo)的NF-κB活化和IRF3表達(dá),從而抑制IL-8表達(dá),表現(xiàn)出和Npro蛋白相似的作用。

2.6 NS4B與Tsg101相互作用 研究證實(shí),內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體(Endocytic sorting complex required for transport,ESCRT)參與CSFV的入侵和排出[37]。Liu等[38]研究發(fā)現(xiàn),ESCRT-I蛋白中的腫瘤易感基因 101(Tumor susceptibility gene 101,Tsg101)蛋白可協(xié)助CSFV從晚期內(nèi)體Rab7和Rab9向溶酶體運(yùn)輸,并通過(guò)形成NS4B-NS5B-Tsg101復(fù)合物調(diào)節(jié)CSFV的復(fù)制。

2.7 NS4B與pRNF114相互作用 RING 結(jié)構(gòu)域 E3 連接酶 (RING domain E3 ligases,RING E3s) 是一組包含 RING 指結(jié)構(gòu)域的 E3 連接酶,可參與宿主免疫反應(yīng),抑制病毒復(fù)制[39]。Zhang等[40]篩選到1種RING E3 連接酶,即豬指環(huán)蛋白114(Porcine RING finger protein 114,pRNF114),并發(fā)現(xiàn)該蛋白C末端結(jié)構(gòu)域可與CSFV NS4B蛋白相互作用,通過(guò)蛋白酶體依賴的途徑導(dǎo)致K27連接的多泛素化和NS4B蛋白的降解,從而抑制CSFV的復(fù)制,但pRNF114的抗病毒作用取決于E3連接酶的活性。

3 小結(jié)與展望

CSFV NS4B蛋白與宿主蛋白Tsg101、Rab22a和FASN相互作用,參與病毒粒子內(nèi)吞、釋放和膜網(wǎng)結(jié)構(gòu)形成,促進(jìn)病毒復(fù)制;與宿主蛋白R(shí)PLP1相互作用,介導(dǎo)病毒粒子的翻譯過(guò)程;與宿主蛋白MAVS和FHC相互作用,參與病毒的免疫逃避;與宿主蛋白pRNF114相互作用,抑制病毒的復(fù)制。此外,CSFV NS4B蛋白結(jié)構(gòu)特定的氨基酸取代還會(huì)影響病毒的活力和毒力,可見(jiàn)其對(duì)CSFV生命周期的影響作用極大。非構(gòu)蛋白NS4B還存在很多蛋白相互作用模式,如DV NS4B蛋白可與人工抑制劑相互作用,導(dǎo)致NS3-NS4B復(fù)合物形成受阻,從而抑制NS4B蛋白的復(fù)制過(guò)程[41];DV NS4B蛋白可與NS2B-NS3蛋白酶解旋酶結(jié)合促進(jìn)病毒復(fù)制,可與NS5相互作用逃避宿主免疫反應(yīng)[42]。Zou等[43]研究發(fā)現(xiàn),DV NS4A-NS4B相互作用所需的最小區(qū)域?yàn)镹S4A氨基酸第40～76位和NS4B氨基酸第84～146位,表明非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B不僅可與宿主蛋白相互作用,還可與自身的結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白,如DDX39B、COX7C、NR2F6、PSMC4、FGL2、MKRN1、RPL15、RPS3、TP53BP2和TBK1蛋白等相互作用,但CSFV的這種相互作用模式報(bào)道較少,還有待進(jìn)一步驗(yàn)證和研究[44,45]。進(jìn)一步闡明CSFV NS4B蛋白復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)可以在一定程度上解釋CSFV的復(fù)制機(jī)理和致病機(jī)理,為抗病毒策略制定、疫苗研究和新藥開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。