段 鍛,江海洋,吳聰明

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193)

近年來,全球細(xì)菌耐藥性快速發(fā)展,妨礙抗菌藥物療效,增加細(xì)菌感染的治療失敗風(fēng)險(xiǎn),嚴(yán)重威脅動(dòng)物和人類健康[1]。細(xì)菌耐藥表型的快速檢測(cè)可以指導(dǎo)人醫(yī)和獸醫(yī)臨床用藥,是對(duì)抗耐藥細(xì)菌感染的有效手段。目前,基于微生物培養(yǎng)的傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)是細(xì)菌耐藥性檢測(cè)的主要手段,包括微量肉湯稀釋法、紙片擴(kuò)散法和抗生素濃度梯度法等[2]。雖然傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)準(zhǔn)確度較高,但檢測(cè)周期長(通常為24 h),不能夠滿足臨床用藥的時(shí)效需求,特別是對(duì)于菌血癥等重癥感染病例的治療[3]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,測(cè)定細(xì)菌耐藥基因型的方法在一定程度上可以指導(dǎo)臨床用藥,但細(xì)菌耐藥機(jī)制復(fù)雜,存在耐藥基因型與表型不一致的現(xiàn)象,因此耐藥基因型對(duì)臨床用藥的指導(dǎo)意義有限[4]。

質(zhì)譜儀是用來進(jìn)行質(zhì)量分析的儀器,具有靈敏度高、分析速度快、測(cè)量范圍廣和色譜聯(lián)用等特點(diǎn)。早期,質(zhì)譜技術(shù)主要用于化合物結(jié)構(gòu)鑒定[5];近年來,質(zhì)譜技術(shù)開始應(yīng)用于蛋白質(zhì)、肽、寡核苷酸、脂類和多糖等生物大分子的分析[6]。常用于細(xì)菌耐藥性檢測(cè)的質(zhì)譜儀有基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)和軌道阱組合質(zhì)譜。目前,主要通過檢測(cè)細(xì)菌蛋白質(zhì)的指紋圖譜分析其耐藥性,MALDI-TOF MS在人醫(yī)臨床中廣泛應(yīng)用于細(xì)菌屬種鑒定和重要細(xì)菌耐藥特征鑒定,但在獸醫(yī)臨床中應(yīng)用較少;LC-MS/MS通常用來檢測(cè)小分子的耐藥生物標(biāo)志物并且可以對(duì)其進(jìn)行定量,適用于部分耐藥機(jī)制清楚的細(xì)菌;軌道阱組合質(zhì)譜因其高分辨率常用來識(shí)別耐藥細(xì)菌的特征肽段。結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí),應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)已實(shí)現(xiàn)細(xì)菌耐藥特征的快速預(yù)測(cè),但受限于儀器性能、耐藥機(jī)制和數(shù)據(jù)分析方法等因素,該技術(shù)仍處于探索發(fā)展階段。本文介紹了當(dāng)前將質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌耐藥性檢測(cè)的兩類技術(shù)原理和相關(guān)方法,簡述了其在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床的應(yīng)用情況、發(fā)展方向和前景展望。

1 質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的原理和應(yīng)用情況

1.1 基于細(xì)菌與抗生素孵育的檢測(cè)

1.1.1 檢測(cè)抗生素的質(zhì)量變化 細(xì)菌表達(dá)耐藥酶作用于抗生素使其結(jié)構(gòu)和分子量發(fā)生變化,質(zhì)譜技術(shù)可通過檢測(cè)抗生素代謝產(chǎn)物來判定細(xì)菌耐藥性的存在[7]。Serafim等[8]用LC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、斯氏普羅威登斯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌共4種革蘭陰性菌對(duì)氨芐西林、美羅培南、亞胺培南、頭孢他啶、頭孢曲松和頭孢吡肟共6種抗生素的耐藥性,將每種細(xì)菌分別與6種抗生素的混合物一起孵育,使用LC-MS/MS檢測(cè)抗生素的代謝產(chǎn)物,結(jié)果顯示,LC-MS/MS和商業(yè)化藥敏平臺(tái)的檢測(cè)結(jié)果具有一致性,且LC-MS/MS檢測(cè)所需時(shí)間為3～5 h,小于商業(yè)化藥敏平臺(tái)檢測(cè)所需時(shí)間(8 h)。

由于采用質(zhì)譜檢測(cè)耐藥細(xì)菌中抗生素的代謝產(chǎn)物不需要過長時(shí)間的增菌,利用該原理開發(fā)的方法檢測(cè)時(shí)間短,還可進(jìn)一步結(jié)合微流控或微膠囊等技術(shù)縮短檢測(cè)時(shí)間。Zhang等[9]開發(fā)了一種質(zhì)譜結(jié)合微流控芯片的系統(tǒng),成功區(qū)分了2株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌和2株不產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌,該系統(tǒng)原理為注射的β-內(nèi)酰胺類抗生素通過芯片時(shí),抗生素被芯片上固定的細(xì)菌代謝通過對(duì)抗生素的代謝產(chǎn)物進(jìn)行在線電噴霧質(zhì)譜分析,可以在30 min內(nèi)評(píng)估細(xì)菌耐藥性。這種方法當(dāng)前主要用于產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶類耐藥細(xì)菌的檢測(cè),并且通過抗生素代謝產(chǎn)物的定量實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌耐藥程度的劃分,有希望與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的判讀結(jié)果實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)換。盡管存在以上優(yōu)點(diǎn),該方法仍僅適用于產(chǎn)生破壞抗生素結(jié)構(gòu)酶的耐藥細(xì)菌的檢測(cè),不適用存在外排泵作用增強(qiáng)或作用靶點(diǎn)改變等機(jī)制的耐藥細(xì)菌的檢測(cè)。

1.1.2 檢測(cè)細(xì)菌同位素標(biāo)記蛋白 細(xì)菌在同位素標(biāo)記培養(yǎng)基中生長時(shí),細(xì)菌蛋白被同位素標(biāo)記,在質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)相對(duì)正常細(xì)菌存在蛋白峰移現(xiàn)象。因此,向同位素標(biāo)記培養(yǎng)基中加入抗生素,耐藥細(xì)菌可以生長合成同位素標(biāo)記蛋白;而敏感細(xì)菌生長緩慢或不生長,較少或無法合成同位素標(biāo)記蛋白;根據(jù)細(xì)菌在同位素標(biāo)記培養(yǎng)基中生長的特征峰總強(qiáng)度與正常培養(yǎng)基中生長的特征峰總強(qiáng)度的比值設(shè)置合理的閾值,可以區(qū)分耐藥細(xì)菌和敏感細(xì)菌,實(shí)現(xiàn)耐藥性的半定量檢測(cè)[10]。

2013年,Sparbier等[10]用4株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌和4株甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌作為建立檢測(cè)方法的菌株,每株菌株分別在正常培養(yǎng)基、加同位素標(biāo)記培養(yǎng)基以及加60 mg/L苯唑西林和同位素標(biāo)記培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)3 h,然后進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測(cè),通過軟件選取細(xì)菌在正常培養(yǎng)基和加同位素標(biāo)記培養(yǎng)基中生長的特征峰,進(jìn)一步通過軟件計(jì)算后設(shè)置閾值為0.5,小于0.5判定為耐藥細(xì)菌;隨后用該新建立的方法分析28株金黃色葡萄球菌對(duì)苯唑西林的耐藥性,結(jié)果顯示,與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)相比,僅有1株細(xì)菌分類錯(cuò)誤。2016年,Sparbier等[11]應(yīng)用上述建立的方法檢測(cè)了多種細(xì)菌對(duì)不同抗生素的耐藥性,包括頭孢喹肟-大腸桿菌、美羅培南-肺炎克雷伯菌、美羅培南-銅綠假單胞菌、妥布霉素-肺炎克雷伯菌、妥布霉素-銅綠假單胞菌和妥布霉素-鮑曼不動(dòng)桿菌,結(jié)果顯示,上述組合培養(yǎng)和檢測(cè)所需的時(shí)間介于3～9 h,即可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)不同菌種對(duì)不同抗生素耐藥性的半定量檢測(cè)。該方法利用質(zhì)譜間接檢測(cè)了細(xì)菌的生長情況,理論上不受耐藥機(jī)制的限制,并且與檢測(cè)細(xì)菌生長情況的傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)相比,時(shí)間能縮短到幾個(gè)小時(shí),且能較好地區(qū)分耐藥細(xì)菌和敏感細(xì)菌;但該方法需要使用特殊的培養(yǎng)基和有代表性的譜圖,操作繁瑣,檢測(cè)成本高,因此應(yīng)用較少。

1.2 基于耐藥細(xì)菌生物標(biāo)志物的檢測(cè)

1.2.1 檢測(cè)耐藥性相關(guān)標(biāo)志物 細(xì)菌耐藥表型由耐藥基因型決定,根據(jù)已知耐藥基因所表達(dá)的耐藥蛋白或其他耐藥生物標(biāo)志物的分子量,可通過質(zhì)譜檢測(cè)耐藥蛋白或耐藥生物標(biāo)志物以判斷細(xì)菌耐藥性[12]。Camara等[13]通過MALDI-TOF MS成功檢測(cè)到質(zhì)荷比(m/z)=29 000處的峰,經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳和LC-MS/MS試驗(yàn)證實(shí)m/z=29 000處的蛋白為氨芐青霉素抗性基因表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶。該方法不僅可以鑒定細(xì)菌屬種,而且可以檢測(cè)基于β-內(nèi)酰胺酶的抗生素耐藥性,細(xì)菌不需要在選擇性培養(yǎng)基中生長,可縮短檢測(cè)時(shí)間,從而使醫(yī)生能夠及時(shí)做出適當(dāng)?shù)闹委煕Q定。

Dortet等[14]開發(fā)了一種基于MALDI-TOF MS檢測(cè)細(xì)菌多黏菌素耐藥性的方法,可在15 min內(nèi)檢測(cè)到細(xì)菌上與多黏菌素耐藥相關(guān)的脂質(zhì)A修飾,鑒定出多黏菌素耐藥分離株,同時(shí)區(qū)分染色體編碼的耐藥和質(zhì)粒編碼的耐藥。該方法具有準(zhǔn)確、快速和成本低的優(yōu)勢(shì),促進(jìn)了多黏菌素的耐藥性診斷。

在已知生物標(biāo)志物m/z的基礎(chǔ)上再利用MALDI-TOF MS,使得樣品的前處理過程變得簡單,縮短了檢測(cè)時(shí)間;缺點(diǎn)為即使已知某些生物標(biāo)志物,但其在質(zhì)譜中的響應(yīng)值很低,無法達(dá)到檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn),或者基質(zhì)效應(yīng)明顯,這時(shí)可以嘗試更復(fù)雜的前處理技術(shù)或者進(jìn)行色譜分離后再進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

1.2.2 檢測(cè)耐藥細(xì)菌特征肽段 質(zhì)譜不僅可以直接檢測(cè)耐藥蛋白,還可以檢測(cè)耐藥蛋白水解后的特異性多肽片段[15]。細(xì)菌蛋白質(zhì)樣品經(jīng)胰蛋白酶消化,經(jīng)色譜分離和高分辨質(zhì)譜識(shí)別肽段后采用低分辨質(zhì)譜進(jìn)行肽段定量。在此過程中,高效的蛋白質(zhì)消化對(duì)于分析過程至關(guān)重要。這種方法也得益于軌道阱組合質(zhì)譜的發(fā)展,該質(zhì)譜能夠準(zhǔn)確識(shí)別蛋白水解后的各種肽段。

Wang等[16]利用蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合軟件預(yù)測(cè)的方法,從可轉(zhuǎn)移黏菌素耐藥(Mobile colistin resistance,MCR)蛋白家族中的12種蛋白中初步篩選出MCR-1蛋白特有的胰蛋白酶酶切后的肽段,然后通過LC-MS/MS鑒定了3個(gè)MCR-1蛋白的特異性肽段,隨后用臨床分離的9株攜帶MCR-1蛋白的陽性菌和90株陰性質(zhì)控菌對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示其敏感性和特異性均達(dá)100%。Wang等[17]還采用類似的方法篩選出3個(gè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiellapneumoniaecarbapenemase,KPC)的特異性肽段,KPC經(jīng)胰蛋白酶快速消化后得到的特異性肽段可通過LC-MS/MS檢測(cè),蛋白印跡分析證實(shí)所選擇的特異性肽段為KPC所特有,隨后用20份KPC陽性和80份KPC陰性臨床分離株進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果顯示,最可靠的胰蛋白酶標(biāo)記物是LTLGSALAAPQR,具有100%的敏感性和100%的特異性。這種方法的缺點(diǎn)是在消化過程中僅使用胰蛋白酶[18],對(duì)蛋白質(zhì)組信息的挖掘不完整,且需要較復(fù)雜的前處理。有研究提出使用多種蛋白酶進(jìn)行蛋白質(zhì)消化以提高蛋白質(zhì)序列的覆蓋率[19,20],克服質(zhì)譜對(duì)于蛋白質(zhì)質(zhì)量檢測(cè)范圍的限制,即只需知道對(duì)應(yīng)的特征蛋白就可以設(shè)計(jì)相應(yīng)的檢測(cè)肽,因此適用范圍很廣。

1.2.3 檢測(cè)細(xì)菌指紋圖譜 MALDI-TOF MS已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床細(xì)菌屬種的快速鑒定[21,22]。與細(xì)菌屬種鑒定的原理類似,通過MALDI-TOF MS采集已知敏感細(xì)菌和耐藥細(xì)菌的譜圖,進(jìn)行譜圖分析,尋找耐藥細(xì)菌的一系列特征峰。隨著計(jì)算機(jī)科學(xué)的發(fā)展,目前可利用算法軟件輔助尋找最合適的預(yù)測(cè)模型,使得挑選特征峰變得更加快速和準(zhǔn)確。Giordano等[23]從比薩大學(xué)醫(yī)院2015—2017年的住院患者中采集139株肺炎克雷伯菌,對(duì)疑似多黏菌素耐藥菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序后,再通過蛋白提取上機(jī)進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定,創(chuàng)建特定的數(shù)據(jù)庫并形成算法分類模型,共收集了1 112個(gè)質(zhì)譜圖,根據(jù)質(zhì)量信號(hào)和強(qiáng)度創(chuàng)建了二維峰值分布,基于2種手動(dòng)選擇質(zhì)譜峰值建立的算法識(shí)別能力為91.8%,交叉驗(yàn)證能力為87.6%,該方法可正確分辨出91%的多黏菌素耐藥菌株和73%的多黏菌素敏感菌株。

此外,Weis等[24]在2016—2018年間收集了臨床分離菌株的303 195份MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)和相應(yīng)的768 300個(gè)耐藥表型信息,這是目前將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與細(xì)菌耐藥性信息相結(jié)合的最大的數(shù)據(jù)集;然后使用2種機(jī)器學(xué)習(xí)方法對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行分類,預(yù)測(cè)細(xì)菌對(duì)不同抗生素的耐藥性,并對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸肝菌和肺炎克雷伯菌三類臨床上重要的病原菌進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示,接收者操作特征曲線下的面積分別為0.80、0.74和0.74,對(duì)63名患者臨床病例的回顧性研究發(fā)現(xiàn),實(shí)施這種預(yù)測(cè)方法改變了9名患者的臨床治療方案,其中有利于8名患者的治療。以上結(jié)果表明,基于MALDI-TOF MS的機(jī)器學(xué)習(xí)可以預(yù)測(cè)臨床中的抗生素耐藥性,并幫助醫(yī)生更快地為患者制定合適的抗生素療法。但是,這種方法前期需要得到大量具有代表性的菌株圖譜,并且選擇合適的預(yù)測(cè)模型也至關(guān)重要。目前所建立的方法仍需要更多的菌株進(jìn)行分析和驗(yàn)證,以提高方法的準(zhǔn)確性和特異性。但與檢測(cè)生物標(biāo)志物或細(xì)菌生長狀態(tài)的方法相比,該方法用機(jī)器學(xué)習(xí)的方式獲得耐藥細(xì)菌的特征并進(jìn)行耐藥性預(yù)測(cè),不受抗生素種類和耐藥機(jī)制的限制,且菌株僅需進(jìn)行基本的上機(jī)前處理,具有非常大的臨床應(yīng)用潛力。

2 質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌耐藥性在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用

目前,質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性主要是以機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)耐藥性為主。雖然應(yīng)用質(zhì)譜進(jìn)行細(xì)菌耐藥性的研究主要集中于人源細(xì)菌,但研究發(fā)現(xiàn),食品零售店的肉類中的耐藥細(xì)菌可以傳播給人類[25],人源性耐藥細(xì)菌與動(dòng)物源耐藥細(xì)菌關(guān)系密切。另外已有應(yīng)用質(zhì)譜檢測(cè)動(dòng)物源耐藥細(xì)菌的報(bào)道,細(xì)菌種類包括腸球菌、大腸桿菌和空腸彎曲桿菌等[26],但未見有沙門菌等重要食源性致病菌的相關(guān)研究。

Feucherolles等[27]收集了來自人、地表水、浣熊、野鳥、牛、豬和家禽的224株空腸彎曲桿菌和116株大腸桿菌,通過MALDI-TOF MS獲得譜圖信息后使用機(jī)器學(xué)習(xí)建立模型,對(duì)環(huán)丙沙星、紅霉素、四環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素和氨芐西林共7種抗生素進(jìn)行耐藥性預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,使用隨機(jī)森林模型對(duì)環(huán)丙沙星耐藥菌株和四環(huán)素耐藥菌株的分類效果最好,靈敏度和精確度分別為92.3%和81.2%。利用機(jī)器學(xué)習(xí)分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)來預(yù)測(cè)細(xì)菌耐藥性具有非常大的潛力,有望成為監(jiān)測(cè)動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的新技術(shù)。

3 質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展方向和前景展望

傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果可以被劃分為耐藥、中介和敏感,但利用質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌的生長情況目前仍然可能將具有中等耐藥的菌株錯(cuò)誤分類。未來仍然需要將細(xì)菌的培養(yǎng)條件和檢測(cè)條件進(jìn)一步優(yōu)化,以及通過更多樣本的數(shù)據(jù)分析來實(shí)現(xiàn)與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果的轉(zhuǎn)換,這對(duì)臨床應(yīng)用具有重要意義。由于質(zhì)譜檢測(cè)蛋白質(zhì)、多肽和脂類等細(xì)菌耐藥的生物標(biāo)志物不能直接提供細(xì)菌對(duì)藥物敏感程度的相關(guān)信息,只能通過間接檢測(cè)生物標(biāo)志物來判斷該菌株是否為耐藥細(xì)菌,所以更適合用于提供有關(guān)耐藥機(jī)制的信息以輔助精準(zhǔn)治療,也可以用于耐藥機(jī)制的研究,如尋找新的耐藥靶標(biāo)。目前,研究人員也在嘗試將質(zhì)量分析器串聯(lián)或者液相系統(tǒng)與質(zhì)譜聯(lián)用,如液相系統(tǒng)與MALDI-TOF MS 結(jié)合使用以擴(kuò)大可檢測(cè)蛋白質(zhì)的數(shù)量,進(jìn)一步提高高分辨質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的能力[28]。盡管利用機(jī)器學(xué)習(xí)分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行耐藥性預(yù)測(cè)仍存在一些問題,但該方法具有應(yīng)用于臨床檢測(cè)耐藥細(xì)菌的巨大潛力,需要優(yōu)化預(yù)測(cè)模型并對(duì)多種耐藥細(xì)菌進(jìn)一步研究。

另外,MALDI-TOF MS直接進(jìn)行基因檢測(cè)已有一些應(yīng)用,其主要用來檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性、基因突變和DNA甲基化[29]。有研究成功利用MALDI-TOF MS檢測(cè)到ORF1ab基因和N基因,并將其作為新型冠狀病毒的檢測(cè)靶標(biāo)[30]。也有研究建立核酸飛行質(zhì)譜方法檢測(cè)結(jié)核耐藥基因突變體系[31]。雖然該方法目前仍需要PCR技術(shù)輔助,但也可作為對(duì)微生物間接測(cè)序的一種手段,質(zhì)譜核酸測(cè)序仍有很大的發(fā)展空間,未來可能通過質(zhì)譜對(duì)耐藥細(xì)菌進(jìn)行基因測(cè)序來鑒定耐藥基因。