王 宵 欒長霖 孫一帆 楊詩巧 王凱磊 郝 瑞 張 偉

近視是常見的屈光不正類型,近年來患病率不斷上升,已成為導致視力下降的主要原因,預計到2050年全球近視率將上升到50%[1]。在屈光度大于-6.00 D的情況下,近視可能會導致視網(wǎng)膜、脈絡膜等結(jié)構(gòu)的變化,還會增加青光眼、視網(wǎng)膜脫離和脈絡膜新生血管等疾病的風險[2-3]。目前的研究表明,戶外活動可以有效抑制近視的發(fā)展,可能與戶外的光強度和光譜波長有關[4],隨著科技發(fā)展,電子產(chǎn)品的應用和普及,人類生活的光環(huán)境也發(fā)生變化,其中視頻終端設備的照度和波長對近視的發(fā)展亦起著重要的作用[5]。

藍光波長范圍為400～500 nm,是短波長可見光中的主要組成部分,具有較高的能量[6]。短波長藍光經(jīng)過屈光系統(tǒng)聚焦在視網(wǎng)膜前,一部分藍光會被角膜和晶狀體所吸收,因此,藍光對眼球屈光系統(tǒng)各部分都會有一定的影響[7]。本研究通過觀察藍光誘導近視豚鼠眼生物學參數(shù)、角膜及視網(wǎng)膜的變化,探究藍光對豚鼠屈光系統(tǒng)發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組處理

18只3周齡雄性三色豚鼠(購自北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖公司),體重120～150 g,SPF級,飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗周期環(huán)境,水和食物可隨意獲得,均選取右眼為實驗眼。豚鼠隨機分為對照組、白光鏡片誘導近視(LIM)組、藍光LIM組3組,其中,對照組不做任何干預;在實驗開始前,藍光LIM組和白光LIM組豚鼠均右眼配戴-10.00 D鏡片,直至實驗結(jié)束。藍光LIM組豚鼠使用波長為420 nm LED燈置于籠子上方,對照組和白光LIM組豚鼠置于色溫4 500 K的白色LED燈下,照度均為700 lx,每天12 h光照/12 h黑暗。在干預前及干預2周、4周時,測量所有豚鼠屈光度、眼軸長度、晶狀體厚度、視網(wǎng)膜厚度、脈絡膜厚度。在實驗結(jié)束后進行豚鼠角膜熒光染色以及視網(wǎng)膜HE染色。所有動物實驗均遵循天津市醫(yī)學實驗動物保護中心的指導原則,動物實驗方案經(jīng)我院動物倫理委員會批準(批號：YSY-DWLL-2022249)。

1.2 屈光度檢測

在暗室內(nèi),每隔5 min給予豚鼠右眼10 g·L-1復方托吡卡胺滴眼液滴眼,共3次,以達到完全睫狀肌麻痹,帶狀光檢影鏡(蘇州六六醫(yī)療器械總廠)測量豚鼠屈光度,以水平和垂直兩個子午線方向的球鏡度平均值為等效球鏡度,重復測量3次,取平均值作為最終屈光度。

1.3 眼軸長度和晶狀體厚度測量

采用A/P型眼科超聲儀(MD-1000A/P型,天津邁達醫(yī)學科技有限公司)中的A型探頭測量眼軸長度,探頭直徑5 mm,頻率為11 MHz,精確度為0.01 mm。用5 g·L-1鹽酸丙美卡因滴眼液對豚鼠進行表面麻醉1～2次,測量過程中探頭頂端紅點與角膜表面中心垂直輕輕接觸,當檢測到眼球內(nèi)結(jié)構(gòu)的清晰痕跡且波形一致時,機器自動讀出眼軸長度和晶狀體厚度,每只眼球連續(xù)測量3次,取平均值作為最終結(jié)果。

1.4 角膜曲率測量

使用角膜曲率計(YZ38型,蘇州六六醫(yī)療器械總廠)測量角膜曲率半徑。將一個+8.00 D的鏡片貼于曲率計鏡筒的前表面,所得結(jié)果乘0.451為豚鼠角膜曲率半徑[8],連續(xù)測量3次取平均值。

1.5 OCT檢查

使用400 kHz SS-OCTA儀(BM400K,Towardpi醫(yī)療技術有限公司,北京)檢查。選擇十字掃描方式,以視盤作為中心,繪制距離視盤中心1 000 μm、1 500 μm、2 000 μm的三個交點,在四個象限中共12個位置測量視網(wǎng)膜厚度和脈絡膜厚度。其中,脈絡膜厚度定義為從視網(wǎng)膜色素上皮的外表面到鞏膜內(nèi)表面的距離,視網(wǎng)膜厚度定義為從內(nèi)界膜到視網(wǎng)膜色素上皮內(nèi)表面的距離(圖1),取平均值作為最終厚度。

脈絡膜厚度：從視網(wǎng)膜色素上皮的外表面(黃線)到鞏膜內(nèi)表面(綠線)的距離;視網(wǎng)膜厚度：從內(nèi)界膜到視網(wǎng)膜色素上皮內(nèi)表面(黃線)的距離。標記距離視盤中心1 000 μm、1 500 μm和2 000 μm的三個交叉點,垂直線與黃、綠線相交的點為脈絡膜。O示視盤。圖1 OCT檢測指標的界定

1.6 角膜上皮染色

干預第4周末,在豚鼠右眼表面滴入1 g·L-1熒光素鈉,用吸紙吸出多余液體,在裂隙燈鈷藍光下觀察角膜上皮情況,并采集圖像。

1.7 視網(wǎng)膜HE染色

1.8 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖。豚鼠眼屈光度、眼軸長度、晶狀體厚度、視網(wǎng)膜厚度和脈絡膜厚度均行Shapiro-Wilk正態(tài)分布檢驗,數(shù)據(jù)符合正態(tài)性分布時使用均數(shù)±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 屈光度變化

干預前,3組豚鼠屈光度間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。干預2周時,對照組和藍光LIM組豚鼠屈光度都向遠視輕度漂移,干預4周時遠視度數(shù)逐漸下降,但在不同時間點間各組內(nèi)差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。白光LIM組在干預的4周內(nèi)屈光度不斷下降,干預2周、4周時屈光度與干預前相比,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。干預2周時,白光LIM組豚鼠向近視漂移,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(t=3.603,P=0.005),并且在干預4周時屈光度不斷降低,與干預2周時相比差異有統(tǒng)計學意義(t=6.183,P<0.001),表明LIM模型建立成功。干預2周時,藍光LIM組豚鼠近視屈光度比白光LIM組低(t=2.863,P=0.017),與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(t=0.853,P=0.413)。干預4周時,藍光LIM組與白光LIM組相比,豚鼠近視屈光度明顯減小(t=4.016,P=0.003),與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(t=1.377,P=0.199)(表1)。

表1 干預前及干預2、4周時各組豚鼠生物學參數(shù)

以2周作為時間節(jié)點,比較各組豚鼠干預前到干預2周(0-2周)與干預2周到干預4周(2-4周)屈光度變化量情況。對照組豚鼠在0-2周屈光度變化量向遠視增加,2-4周變化量向近視發(fā)展,組內(nèi)差異有統(tǒng)計學意義(t=3.241,P=0.009)。白光LIM組豚鼠0-2周變化量向近視發(fā)展,在2-4周近視變化量增加,組內(nèi)差異有統(tǒng)計學意義(t=4.308,P=0.002)。藍光LIM組豚鼠0-2周基本不變,在2-4周向近視發(fā)展,組內(nèi)差異有統(tǒng)計學意義(t=2.720,P=0.021)。組間相比,白光LIM組豚鼠在0-2周變化量向近視偏移量最大,與對照組、藍光LIM組豚鼠相比差異均有統(tǒng)計學意義(t=4.349、3.827,P=0.001、0.003);在2-4周所有組豚鼠變化量都向近視發(fā)展,白光LIM組與對照組、藍光LIM組豚鼠相比差異均有統(tǒng)計學意義(t=5.624、2.982,P=0.001、0.014)(表2)。

表2 干預周期內(nèi)各組參數(shù)變化量

所有豚鼠角膜曲率半徑隨時間均逐漸增長,但在相同時間內(nèi)3組豚鼠間相比差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(表1)。

2.2 眼軸長度及晶狀體厚度變化

干預前,3組豚鼠間眼軸長度、晶狀體厚度相比差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。干預4周內(nèi),各組豚鼠眼軸長度及晶狀體厚度均有一定程度的增長。干預2周時,與對照組和藍光LIM組相比,白光LIM組豚鼠眼軸長度更長,差異均有統(tǒng)計學意義(t=3.659、4.422,P=0.004、0.001);而藍光LIM組與對照組豚鼠眼軸長度相比差異無統(tǒng)計學意義(t=0.496,P=0.630)。干預4周時,白光LIM組豚鼠眼軸長度不斷增加,與對照組、藍光LIM組豚鼠相比差異均有統(tǒng)計學意義(t=4.511、4.371,P=0.001、0.001);藍光LIM組與對照組豚鼠眼軸長度相比差異無統(tǒng)計學意義(t=0.798,P=0.444)。各組豚鼠晶狀體厚度變化趨勢與眼軸長度變化趨勢基本一致(表1)。

比較干預0-2周與干預2-4周時各組豚鼠眼軸長度變化量情況,結(jié)果見表2。對照組和白光LIM組豚鼠在0-2周和2-4周時眼軸長度變化量相似,組內(nèi)差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。藍光LIM組豚鼠2-4周眼軸長度變化量與0-2周相比有所增加,但差異無統(tǒng)計學意義(t=1.672,P=0.126)。組間相比,白光LIM組豚鼠0-2周變化量與對照組、藍光LIM組豚鼠相比差異均有統(tǒng)計學意義(t=4.876、4.665,P=0.001、0.001);在2-4周所有組豚鼠眼軸長度變化量都增大,白光LIM組與對照組、藍光LIM組豚鼠相比差異均有統(tǒng)計學意義(t=5.101、2.828,P=0.001、0.018)。

2.3 視網(wǎng)膜厚度及脈絡膜厚度變化

在實驗周期內(nèi),對照組豚鼠的視網(wǎng)膜和脈絡膜厚度隨時間輕微增厚,但在干預2周和4周組內(nèi)差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05);白光LIM組豚鼠視網(wǎng)膜和脈絡膜厚度不斷變薄,視網(wǎng)膜厚度在干預4周時與干預前相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),脈絡膜厚度在干預2周和4周組內(nèi)與干預前相比差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);藍光LIM組豚鼠在干預2周時脈絡膜厚度增加,視網(wǎng)膜厚度輕度增加;在干預4周時脈絡膜停止增厚并變薄,視網(wǎng)膜厚度出現(xiàn)下降,但組內(nèi)差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(表1)。

干預2周時,白光LIM組與對照組豚鼠相比脈絡膜厚度變薄(t=3.743,P=0.004),視網(wǎng)膜厚度差異無統(tǒng)計學意義(t=1.622,P=0.136);藍光LIM組與白光LIM組相比,脈絡膜厚度輕度增厚(t=2.898,P=0.016),視網(wǎng)膜厚度差異無統(tǒng)計學意義(t=2.161,P=0.056);藍光LIM組與對照組豚鼠相比,視網(wǎng)膜、脈絡膜厚度差異均無統(tǒng)計學意義(t=0.539、0.391,P=0.603、0.734)(表1)。

干預4周時,白光LIM組與對照組豚鼠相比脈絡膜厚度繼續(xù)變薄(t=6.484,P<0.001),并且視網(wǎng)膜厚度也明顯下降(t=5.596,P<0.001);藍光LIM組與白光LIM組豚鼠相比具有更厚的脈絡膜(t=5.435,P<0.001)和視網(wǎng)膜(t=1.139,P=0.281);藍光LIM組與對照組豚鼠相比,視網(wǎng)膜、脈絡膜厚度差異均無統(tǒng)計學意義(t=1.139、1.083,P=0.281、0.304)(表1)。

比較干預0-2周與干預2-4周時各組豚鼠視網(wǎng)膜厚度、脈絡膜厚度變化量情況,結(jié)果見表2。對照組和白光LIM組豚鼠在0-2周與2-4周時,視網(wǎng)膜厚度和脈絡膜厚度的變化量幾乎不變或輕微增加,組內(nèi)差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。藍光LIM組豚鼠2-4周時視網(wǎng)膜厚度、脈絡膜厚度的變化量與0-2周變化量相比明顯下降,但組內(nèi)差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.124、0.068)。組間相比,0-2周時白光LIM組與藍光LIM組豚鼠脈絡膜厚度變化量差異有統(tǒng)計學意義(t=3.765,P=0.004),視網(wǎng)膜厚度變化量差異無統(tǒng)計學意義(t=2.096,P=0.062);藍光LIM組與對照組豚鼠相比,視網(wǎng)膜厚度、脈絡膜厚度變化量差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。2-4周時視網(wǎng)膜厚度、脈絡膜厚度變化量各組間相比差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。

2.4 角膜的變化

干預4周時行角膜上皮熒光染色,結(jié)果顯示,對照組、白光LIM組豚鼠角膜上皮光滑,角膜染色呈陰性;藍光LIM組豚鼠角膜染色呈陽性,可見明顯的角膜損傷(圖2)。

A：對照組;B：白光LIM組;C：藍光LIM組。圖2 各組豚鼠角膜上皮熒光染色

2.5 對視網(wǎng)膜的影響

干預4周時,對照組和白光LIM組豚鼠視網(wǎng)膜各層邊界清晰,神經(jīng)節(jié)細胞形態(tài)正常,未見明顯異常,內(nèi)核層、外核層細胞排列整齊,界限清晰。藍光LIM組豚鼠視網(wǎng)膜可見神經(jīng)節(jié)細胞層邊界不清晰,神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量減少,核膜不完整,見核固縮;內(nèi)核層、外核層細胞排列稀疏紊亂,視網(wǎng)膜色素上皮層厚度變薄(圖3)。

A：對照組;B：白光LIM組;C：藍光LIM組。GCL：神經(jīng)節(jié)細胞層;INL：內(nèi)核層;ONL：外核層;RPE：視網(wǎng)膜色素上皮層。圖3 各組豚鼠視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果

3 討論

近視是最常見的屈光不正類型,影響范圍廣,病因復雜,當發(fā)展為高度近視時,常出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥[1-3]。隨著電子設備的普及,照明環(huán)境對屈光不正的影響越來越顯著[5-6,9]。眼球在出生后經(jīng)歷正視化,通過反饋機制調(diào)節(jié)眼軸生長,使視覺焦點保持在視網(wǎng)膜上[10-12]。在近視的發(fā)展中,眼球的生物學參數(shù)會發(fā)生相應的變化,通常會引起更長的眼軸、更薄的脈絡膜和鞏膜[12-13]。

以往研究顯示,藍光照射會抑制眼軸的延長和近視的發(fā)展,但其潛在的機制仍存在爭議,推測可能因為藍光為短波長光,經(jīng)屈光系統(tǒng)后,其焦點聚焦在視網(wǎng)膜前,產(chǎn)生的近視性離焦或縱向色差(LCA)通過反饋機制抑制了眼球的伸長[14-16]。脈絡膜主要由血管組成,為視網(wǎng)膜和鞏膜提供豐富的血液和氧氣,越來越多的證據(jù)表明,脈絡膜厚度與近視呈現(xiàn)顯著的負相關,脈絡膜厚度越薄通常近視度數(shù)越高,表明其在近視中的關鍵作用[12-13]。本研究也觀察到類似的現(xiàn)象：藍光可以抑制眼軸的過度伸長,抑制屈光度向近視漂移,并且增加了脈絡膜的厚度。

但在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)藍光抑制近視發(fā)展的效果隨光照時間發(fā)生改變,在干預的0-2周內(nèi),藍光LIM組豚鼠抑制近視的效果與時間呈正相關,而在干預2-4周時其屈光度降低,視網(wǎng)膜厚度變化量與0-2周相比明顯下降,脈絡膜厚度也停止增加。通過角膜熒光染色和視網(wǎng)膜HE染色觀察到角膜上皮的損傷和視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的改變。藍光是短波長光,具有較高的能量,在以往的研究中,研究者通常使用12 h光照/12 h黑暗周期作為誘導視網(wǎng)膜損傷的一種實驗方法,已被證明會導致感光細胞功能障礙,繼而導致鄰近組織微環(huán)境中炎癥和血管生成的失衡,產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物可引起角膜上皮細胞炎癥反應[16-20]。因此,我們推測是由于藍光的高能量對視網(wǎng)膜造成損傷,破壞角膜或視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu),引起某些影響近視的關鍵細胞凋亡,繼而對抑制近視的效果產(chǎn)生影響,但具體的機制還需要進一步研究。

在本實驗中,我們觀察到了在近視誘導的情況下,藍光對豚鼠屈光系統(tǒng)發(fā)育的影響。目前的結(jié)果表明,藍光能夠抑制近視的發(fā)展,減少眼軸的延長,增加脈絡膜的厚度,這與先前研究中觀察到的現(xiàn)象一致[21]。然而,延長到4周的藍光光照并沒有帶來更大的抑制變化量,提示藍光抑制近視發(fā)展存在LCA以外的原因。在目前的研究中,可能的原因有：藍光引起視網(wǎng)膜多巴胺水平升高[22],降低視網(wǎng)膜維甲酸水平[15],刺激視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞對藍光敏感的黑視素蛋白[23]等。據(jù)de Moraes等[24]的研究報道,藍光可以調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶,誘導大鼠主動脈環(huán)的血管擴張,提示實驗中觀察到的脈絡膜厚度增加可能是藍光影響了脈絡膜血管,從而影響脈絡膜和視網(wǎng)膜的厚度,但具體機制仍需進一步研究。由于個體發(fā)育的差異,我們僅對不同組別內(nèi)實驗動物相關的生物學參數(shù)進行了發(fā)育相關的對照和統(tǒng)計,而且從實驗結(jié)果來看,不同組內(nèi)實驗動物屈光結(jié)果的變化不僅僅與眼軸本身的生長發(fā)育有關,可能還與晶狀體厚度、脈絡膜厚度等結(jié)構(gòu)的生長和發(fā)育有相關性[11-13,21],因而得出了本文的結(jié)論。目前的研究結(jié)果仍具有一些局限性,與人類相比,豚鼠的眼睛相對較小,角膜曲率不同,這可能會導致不同的光學特性和視覺偏差。因此,在進行近視研究時,需要將豚鼠模型的結(jié)果與其他模型或觀察數(shù)據(jù)結(jié)合起來考慮,以便更全面地了解藍光對近視患者的影響。

4 結(jié)論

藍光抑制了眼軸的伸長,減緩了屈光度向近視漂移,并且增加了脈絡膜厚度,提示藍光可能通過脈絡膜相關機制影響近視的發(fā)展,但其抑制近視的效果并不隨藍光暴露時間的延長而增加。長期的藍光照射還會引起角膜上皮及視網(wǎng)膜的損傷。由此可以推測,藍光抑制近視的效果并不與時間呈單純的正相關,長期的藍光照射可能會影響眼球內(nèi)的近視相關細胞或蛋白,從而降低抑制效果。在未來的研究中,需要更精確最佳的藍光照射時間,探究對抑制近視發(fā)展的最有效藍光閾值。