鄒瑾，景明夷，朱寶華，3，陳明嶺?

（1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610000； 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610000；3. 中山市中醫(yī)院，廣東 中山 528400）

濕疹是一種具有滲出傾向的炎癥性皮膚病，臨床根據(jù)病程及皮損特點(diǎn)將其分為急性、亞急性、慢性濕疹［1-2］。急性濕疹在紅斑的基礎(chǔ)上見(jiàn)丘疹、丘皰疹，有明顯的滲出，皮損境界不清楚，瘙癢劇烈，可以發(fā)生于任何年齡、任何季節(jié)。本病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前多認(rèn)為與免疫功能異常、皮膚屏障功能障礙、菌群失調(diào)或內(nèi)分泌變化等因素相關(guān)，其中以T 細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)研究最多［3］。相關(guān)研究顯示，近30 年來(lái)在工業(yè)國(guó)家中，兒童和成人的濕疹患病率分別上升15%～30%和2%～10%［4］。目前西醫(yī)治療以外用糖皮質(zhì)激素制劑和口服抗組胺藥物為主，但療效短暫，具有停藥后容易復(fù)發(fā)、長(zhǎng)期使用不良反應(yīng)較多等缺陷。濕疹，中醫(yī)又稱(chēng)為濕瘡，因稟賦不耐，風(fēng)、濕、熱阻于肌膚所致［5］。中醫(yī)藥治療濕疹有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，大量的臨床研究證明中醫(yī)藥治療濕疹安全有效。本研究所使用的文氏馬齒莧湯是由簡(jiǎn)化消風(fēng)散合馬齒莧湯化裁而來(lái)，為四川文氏皮科流派傳承人艾儒棣教授及陳明嶺教授根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方。既往的臨床試驗(yàn)證明該方治療濕疹的療效明確，復(fù)發(fā)率較低，且無(wú)明顯不良反應(yīng)［6-9］，但未曾在動(dòng)物試驗(yàn)中開(kāi)展相關(guān)研究，故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立急性濕疹動(dòng)物模型，初步探討文氏馬齒莧湯對(duì)急性濕疹小鼠免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白 細(xì) 胞 介 素-5（interleukin-5，IL-5）的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康Balb/c 雄性小鼠36 只，8 周齡，體質(zhì)量（20 ±2）g，由四川省成都市達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2015-03，于成都醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)。動(dòng)物房?jī)?nèi)每日保持明/暗周期12/12 h（光照時(shí)間為7：00—19：00），每個(gè)Optimice 100 EVC籠具內(nèi)飼養(yǎng)6只動(dòng)物，籠具內(nèi)隔音、通風(fēng)、溫度控制在20～26 ℃、相對(duì)濕度40%～70%。常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食，在同一環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物均使用成都醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的飼料和滅菌水喂養(yǎng)。本研究已獲得成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批，倫理審批號(hào)：2022DL-013。

1.2 主要試劑

2，4-二硝基氯苯（DNCB，成都科龍化工有限公司，批號(hào)：2022042203）；丙酮（成都科龍化工有限公司，批號(hào)：20220116）；橄欖油（成都科龍化工有限公司，批號(hào)：20220316）；小鼠IgE、IL-2、IL-5檢測(cè)試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號(hào)分別為JM-02339M2、JM-02981M2、JM-02447M2）。

1.3 主要儀器

臥式冷凍箱（合肥美菱股份有限公司，型號(hào)：BCD-318AT）；電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司，型號(hào)：ME203E/02）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（龍醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號(hào)：D3024R）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津萊玻特瑞儀器有限公司，型號(hào)：GEL-70）；渦旋混合器（大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號(hào)：MXE）；酶標(biāo)檢測(cè)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司，型號(hào)：RT-6100）。

1.4 藥品

文氏馬齒莧湯組方：馬齒莧20 g，黃芩10 g，金銀花15 g，連翹15 g，生地黃20 g，川射干15 g，龍骨20 g，紫荊皮15 g，石膏20 g，知母10 g，地膚子30 g，煅磁石30 g，山藥30 g，生甘草6 g。由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房制備（其中高劑量組為105.298 g/kg，中劑量組為52.649 g/kg，低劑量組為26.325 g/kg）。龍膽瀉肝丸（北京同仁堂制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z11020653），小鼠服用劑量為2.466 g/kg。

1.5 動(dòng)物分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，依據(jù)體質(zhì)量按照區(qū)間分組法隨機(jī)分為空白組、模型組、龍膽瀉肝丸組和文氏馬齒莧湯高、中、低劑量組，每組6只。

1.6 模型制備

參照文獻(xiàn)［10-11］制備方法，采用2，4-二硝基氯苯（DNCB）的方法造模，造模前1 d于小鼠背部選1.5 cm ×2 cm 大小區(qū)域用剃毛刀去毛。第1 天和第2 天，以7%DNCB（0.7 g DNCB 溶于10 mL 丙酮-橄欖油溶劑，丙酮∶橄欖油 = 4∶1）100 μL 外涂小鼠去毛背部致敏；第7、9、11天，除空白組外，用移液槍在其余組小鼠右耳雙側(cè)外涂1% DNCB（0.1 g DNCB 溶于10 mL 丙酮-橄欖油溶劑，丙酮∶橄欖油 = 4∶1）20 μL激發(fā)，同時(shí)左耳外涂丙酮-橄欖油溶劑作為對(duì)照。

1.7 動(dòng)物給藥

造模成功后，龍膽瀉肝丸組予以龍膽瀉肝丸灌胃，文氏馬齒莧湯高、中、低劑量組予以高、中、低劑量文氏馬齒莧湯灌胃，每次灌胃0.2 mL，空白組和模型組予以等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)7 d。

1.8 檢測(cè)指標(biāo)

治療結(jié)束后，小鼠眼眶采血，3 000 r/min，離心15 min，采集血清，于-20 ℃中保存，采用ELISA 法檢測(cè)血清中IgE、IL-2、IL-5水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 局部皮損表現(xiàn)

與空白組比較，造模后小鼠背部可見(jiàn)紅腫、滲出、脫屑、結(jié)痂等皮損改變。7 d 治療結(jié)束后，龍膽瀉肝丸組小鼠背部可見(jiàn)焦黃色厚痂皮，皮膚紅斑、水腫、滲出減少；文氏馬齒莧湯高劑量組小鼠大部分痂皮脫落，局部皮膚仍可見(jiàn)少量痂殼、紅斑、脫屑；文氏馬齒莧湯中劑量組小鼠痂皮完全脫落，大部分皮膚已修復(fù)，肉眼可見(jiàn)少量紅斑；文氏馬齒莧湯低劑量組小鼠背部可見(jiàn)黃色厚薄不一的痂皮，上覆少量鱗屑，紅斑、水腫、滲出減少。見(jiàn)圖1。

圖1 不同組別小鼠局部皮損變化

2.2 各組血清IgE、IL-2、IL-5水平比較

與空白組比較，模型組IgE、IL-2、IL-5 水平顯著升高（P＜ 0.01）。經(jīng)藥物干預(yù)后，各藥物組IgE、IL-2、IL-5 水平出現(xiàn)不同程度降低。與模型組比較，龍膽瀉肝丸組及文氏馬齒莧湯高、中劑量組IgE、IL-2、IL-5 水平顯著降低（P＜ 0.01），文氏馬齒莧湯低劑量組IgE、IL-2 水平顯著降低（P＜ 0.01；P＜0.05）；與龍膽瀉肝丸組比較，文氏馬齒莧湯中劑量組IgE 顯著降低（P＜ 0.05），文氏馬齒莧湯高劑量組IL-2 水平顯著降低（P＜ 0.05），文氏馬齒莧湯中、低劑量組IL-5 水平顯著降低（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。具體見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清IgE、IL-2、IL-5水平比較（±s）

表1 各組小鼠血清IgE、IL-2、IL-5水平比較（±s）

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01；與龍膽瀉肝丸組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01。

組別空白組模型組龍膽瀉肝丸組文氏馬齒莧湯高劑量組文氏馬齒莧湯中劑量組文氏馬齒莧湯低劑量組IL-5/（pg/mL）10.57 ± 2.07##△△21.69 ± 1.86**△△17.30 ± 1.88**##15.01 ± 2.64**##13.35 ± 2.66*##△△20.24 ± 1.17**△n 6 6 6 6 6 6 IgE/（pg/mL）4.57 ± 0.75##△△9.27 ± 1.33**△△7.33 ± 1.20**##7.12 ± 1.48**##5.81 ± 0.91##△7.22 ± 1.13**##IL-2/（pg/mL）98.20 ± 16.87##△△230.03 ± 29.02**△△188.39 ± 29.29**##154.11 ± 27.91**##△159.28 ± 33.54**##194.56 ± 13.19**#

3 討論

文氏馬齒莧湯是由四川文氏皮科流派代表人物艾儒棣教授及陳明嶺教授經(jīng)驗(yàn)方——簡(jiǎn)化消風(fēng)散合馬齒莧湯化裁而來(lái)，兩方合用，針對(duì)急性濕瘡的病因病機(jī)，效果更佳。方中馬齒莧清熱解毒、散血消腫，黃芩清熱燥濕，兩者共為君藥；金銀花和連翹配伍可疏散風(fēng)熱、清熱解毒，生地黃清熱涼血、養(yǎng)陰生津，知母和石膏配伍可清熱瀉火、生津潤(rùn)燥，加上射干共助君藥清熱之力；紫荊皮、地膚子祛風(fēng)止癢，龍骨、磁石鎮(zhèn)驚安神止癢，佐以山藥，補(bǔ)益脾胃，以防用藥過(guò)于寒涼傷胃，甘草為使藥，全方共奏清熱除濕、祛風(fēng)止癢之效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明馬齒莧具有抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗氧化和增強(qiáng)免疫力的作用［12］；黃芩中含有黃芩苷、汗黃芩素等成分，通過(guò)強(qiáng)化機(jī)體的巨噬細(xì)胞功能，能夠提高機(jī)體的免疫功能［13］；生地黃能幫助合成淋巴細(xì)胞DNA 和蛋白質(zhì)，同時(shí)減輕毛細(xì)血管壁通透性，抑制血管內(nèi)皮炎癥，發(fā)揮抗過(guò)敏的作用［14］；地膚子提取物可以抑制速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)并且通過(guò)抑制白細(xì)胞總數(shù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和受體抗Ⅳ型超敏反應(yīng)［15］；龍骨和磁石配伍，鎮(zhèn)驚和催眠、止癢效果更佳。本研究發(fā)現(xiàn)給予急性濕疹小鼠文氏馬齒莧湯后，其皮損大部分已修復(fù)，肉眼僅可見(jiàn)少量紅斑、痂殼、鱗屑，其中文氏馬齒莧湯高、中劑量組最為顯著。

本研究通過(guò)建立急性濕疹小鼠模型，探討文氏馬齒莧湯對(duì)小鼠皮損及血清IgE、IL-2 和IL-5 的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組比較，文氏馬齒莧湯能不同程度降低血清IgE。與龍膽瀉肝丸組比較，文氏馬齒莧湯中劑量組IgE 表達(dá)更低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究表明濕疹患者的血清中IgE 濃度高于正常人［16］，原因是濕疹患者皮膚屏障功能的下降使過(guò)敏原滲透到皮膚中，刺激表皮的朗格漢斯細(xì)胞，從而產(chǎn)生高親和性的IgE抗體，吸附在細(xì)胞表面，引起免疫系統(tǒng)的高敏感性，細(xì)胞表面的IgE 抗體與抗原結(jié)合，最終引發(fā)I 型超敏反應(yīng)，表現(xiàn)為皮膚瘙癢［17］。

濕疹的致病原因復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制可能與Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)有關(guān)，相關(guān)的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生一系列淋巴因子，各種炎癥細(xì)胞活化因子共同引起血管擴(kuò)張，血管壁通透性增強(qiáng)從而形成皮膚濕疹樣改變［18］。所以本研究亦選擇IL-2 和IL-5 作為檢測(cè)的指標(biāo)。IL-2 是由Th1細(xì)胞活化所產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)因子，對(duì)于免疫細(xì)胞增殖和機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)有著重要的作用［19］，能促進(jìn)白介素-2 受體（IL-2R）的表達(dá)，并且刺激TNF-α、IFNγ 等其他細(xì)胞因子的分泌，引起組織形成以淋巴細(xì)胞（主要是T細(xì)胞）和單核吞噬細(xì)胞系浸潤(rùn)為主的滲出性炎癥，同時(shí)在各種炎癥細(xì)胞和活性因子的作用下，血管擴(kuò)張，管壁通透性增加，最終導(dǎo)致皮膚濕疹樣改變或加重濕疹皮損的炎癥反應(yīng)［20］。IL-5 是主要由Th2 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，能夠清除外來(lái)病原體，還可導(dǎo)致血清免疫球蛋白IgE 和嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)度表達(dá)，加重Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)［21］。IL-5 能夠與細(xì)胞因子特異性亞基受體IL-5Rα結(jié)合，后者主要在嗜酸性粒細(xì)胞上高表達(dá)，嗜酸性粒細(xì)胞在兩者的共同作用下分化形成［22］。總之，IL-5 在嗜酸性粒細(xì)胞的誘導(dǎo)和增殖中發(fā)揮重要作用，能夠促進(jìn)炎癥組織和血液中嗜酸性細(xì)胞增多，加重炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示模型組小鼠血清IL-2、IL-5表達(dá)水平明顯升高，經(jīng)藥物干預(yù)后，與龍膽瀉肝丸組比較，文氏馬齒莧湯高劑量治療組IL-2水平明顯降低，文氏馬齒莧中、低劑量組IL-5表達(dá)水平顯著降低。說(shuō)明不同劑量的文氏馬齒莧湯對(duì)降低IL-2、IL-5的水平不一，對(duì)血清中炎癥細(xì)胞因子IL-2、IL-5有較明顯的抑制作用，提示文氏馬齒莧湯能夠調(diào)節(jié)小鼠免疫反應(yīng)，抑制改善皮損水腫、紅斑和滲出狀態(tài)。

4 結(jié)論

綜上所述，文氏馬齒莧湯降低急性濕疹小鼠血清IgE、IL-2、IL-5 表達(dá)水平，具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，從而改善急性濕疹皮損狀況。