曹雪婷，陳靜

（1. 華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北省慢性疾病基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063210； 2. 華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063210）

刺五加，又名五加參、刺拐棒，是五加科植物的干燥根和根莖以及莖，根據(jù)中國(guó)藥典的記錄，刺五加是一種廣泛用于益氣、健脾、補(bǔ)腎、安神的中藥［1］，主要分布在俄羅斯以及我國(guó)東北三省、華北等地。刺五加苷B是刺五加中發(fā)揮藥用活性的主要成分，現(xiàn)在已經(jīng)被證實(shí)具有許多的藥理活性，其中就有抗疲勞、抗炎、抗腫瘤作用等［2-3］。刺五加苷B 在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，其中包含肺癌A549 細(xì)胞、宮頸癌Hela 細(xì)胞和乳腺癌MCF-7 細(xì)胞等，但刺五加苷B 對(duì)肺癌細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚，本研究初步探究了刺五加苷B 對(duì)肺癌A549 和H460 細(xì)胞遷移侵襲的影響，為刺五加苷B成為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 藥品

細(xì)胞：人肺癌細(xì)胞株A549 和H460 細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所饋贈(zèng)。

刺五加苷B（美國(guó)MREDA 公司，批號(hào)：02009154），純度不小于98%。刺五加苷B 是一種有生物活性酚苷類物質(zhì)，其為白色結(jié)晶狀，用DMSO 溶液將其制備成54 mmol/L濃度的溶液，并保存于-20 ℃冰箱中。

1.2 主要儀器

超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造有限公司，ZHJH-C1214B），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)賽默飛ThermoFisher，），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS，），酶標(biāo)儀（瑞士TECAN，），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Alpha Innotech公司產(chǎn)品，AlapHa ImagerTM 2200），電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.3 主要試劑

RPMI-1640 培養(yǎng)基（以色列BiologicalIndustries公司，批號(hào)：2131212）；胎牛血清產(chǎn)品（德國(guó)Cegrogen 公司，批號(hào)：19042772）；胰蛋白酶（中國(guó)Eallbio 公司，批號(hào)：F2303）；細(xì)胞裂解液（中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：060622220930）；10 × SDS-PAGE 電泳液、20 ×Western 快速轉(zhuǎn)模緩沖液、10 × TBST 洗滌緩沖液、4 ×分離膠mix、8 × 濃縮膠（中國(guó)莊盟生物公司，批號(hào)：2BD03LSXT1、AF08C、220H04C22）、22AB04C、21A008S）；30%Acr-Bis、ECL 顯影液（中國(guó)Report 公司，批號(hào)：A1010500、KF005）；基質(zhì)膠（中國(guó)ABW 公司，批號(hào)：20221514ZH）；MTT（東京TCI公司，批號(hào)：）。

2 方法

2.1 A549細(xì)胞和H460細(xì)胞培養(yǎng)

使用含有10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，該細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，每隔2～3 d傳代換液。

2.2 MTT法

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549和H460細(xì)胞以每孔6 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，之后吸掉上清，加入不同濃度的刺五加苷B，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（不加刺五加苷B，只加刺五加苷B的溶解液）和調(diào)零組（僅添加無(wú)血清的1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基），每個(gè)藥物濃度均設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔（包括對(duì)照組），培養(yǎng)24 h 后，吸掉上清，每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔中加入含有10%的 5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出上清并棄掉，每孔加入150 μL DMSO，96 孔板放到微型震蕩器上充分震蕩5～10 min，570 nm 測(cè)量每孔的吸光度OD 值。計(jì)算出細(xì)胞存活率及半抑制濃度IC50值。

2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549 和H460 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度于5 × 105個(gè)/mL的密度接種于六孔板中，每孔2 mL培養(yǎng)24 h，使用100 μL移液頭管頭在單層制造劃痕，以單次流體運(yùn)動(dòng)在細(xì)胞單層中畫(huà)一條線。PBS緩沖液清洗1～2次被劃下的細(xì)胞，倒置顯微鏡拍攝0 h的照片。對(duì)于H460細(xì)胞加入含有15、20、25 mmol/L刺五加苷B 的無(wú)血清1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)于A549細(xì)胞加入含有15、25、35 mmol/L 刺五加苷B 的無(wú)血清1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基。藥物作用24 h后在倒置顯微鏡下檢測(cè)24 h的細(xì)胞遷移，注意要拍攝與0 h位置相同的地方再次拍攝24 h的照片。使用ImageJ軟件分析。

2.4 Transwell細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)

用預(yù)冷的無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基將基質(zhì)膠配成相應(yīng)濃度的工作膠，每個(gè)Transwell 小室孔加入100 μL 工作膠（遷移實(shí)驗(yàn)此步省略），收集消化好的待處理細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，使H460細(xì)胞加入含有15、20、25 mmol/L刺五加苷B 的無(wú)血清1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，使A549 細(xì)胞加入含有15、25、35 mmol/L 刺五加苷B 的無(wú)血清1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以每孔2 × 104個(gè)細(xì)胞的密度接種到Transwell 小室的上腔室中，下腔室中加入含有15%血清的1640 完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，棄去舊培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定15 min 后，吸棄，PBS 緩沖液清洗1～2 次，用0.1%結(jié)晶紫染液室溫下對(duì)遷移侵襲細(xì)胞瞬時(shí)染色，PBS 緩沖液清洗1～2 次，棉簽輕輕擦去上腔室膜上的細(xì)胞并用倒置顯微鏡觀察遷移到上腔膜下的細(xì)胞，并拍照記錄。

2.5 Western Blot蛋白印跡法

收集經(jīng)藥物處理后的細(xì)胞，根據(jù)蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取A549 和H460 細(xì)胞總蛋白后，用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。金屬浴變性后，電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育E-cadherin、Slug、Snail 抗體及顯影，以β actin 為內(nèi)參，凝膠成像分析系統(tǒng)分析目的蛋白表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次及以上，結(jié)果以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，t檢驗(yàn)分析方法用于兩組間比較，單因素方差分析用于多組間比較，各組數(shù)值均應(yīng)用ImageJ和Graphpad prism 8.0 軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪圖，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 刺五加苷B對(duì)人肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)影響

用不同濃度（0、5、15、20、25、30、35、40、45 mmol/L）的刺五加苷B 作用于肺癌A549 和H460 細(xì)胞 24 h，MTT法測(cè)定刺五加苷B對(duì)人肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0 mmol/L 組相比刺五加苷B 可明顯抑制肺癌A549 和H460 細(xì)胞的增殖，刺五加苷B 誘導(dǎo)了肺癌細(xì)胞A549 和H460 的死亡，刺五加苷B 處理組細(xì)胞存活率明顯降低，見(jiàn)圖1。刺五加苷B作用于肺癌細(xì)胞A549和H460的IC50值見(jiàn)表1。

圖1 MTT法檢測(cè)刺五加苷B對(duì)肺癌A549和H460細(xì)胞存活率的影響

表1 刺五加苷B作用 A549和H460的IC50值比較（±s）

表1 刺五加苷B作用 A549和H460的IC50值比較（±s）

細(xì)胞A549 H460 n3 3 IC50/（mmol/L）28.64 ± 0.29 22.16 ± 0.25

3.2 刺五加苷B對(duì)肺癌細(xì)胞遷移侵襲的影響

不同濃度的刺五加苷B 作用于A549 和H460 細(xì)胞2 h后，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組劃痕面積最小，而實(shí)驗(yàn)組中隨著藥物濃度的增加劃痕面積也隨之增大，說(shuō)明刺五加苷B可以抑制肺癌A549和H460細(xì)胞的遷移。

Transwell 遷移的結(jié)果示，在肺癌細(xì)胞A549 和H460中隨著刺五加苷B 的濃度增加，通過(guò)Transwell小室膜孔的細(xì)胞數(shù)目減少，聯(lián)系劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以得出，刺五加苷B 能夠抑制肺癌細(xì)胞A549 和H460 遷移。結(jié)果見(jiàn)圖2～5及表2～3。

圖2 A549細(xì)胞細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

圖3 H460細(xì)胞細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

圖4 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)刺五加苷B對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響（×100）

圖5 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)刺五加苷B對(duì)H460細(xì)胞遷移的影響（×100）

表2 刺五加苷B對(duì)A549細(xì)胞遷移侵襲的影響（±s））

表2 刺五加苷B對(duì)A549細(xì)胞遷移侵襲的影響（±s））

注：與0 mmol/L組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

Transwell侵襲細(xì)胞數(shù)159.33 ± 13.96 104.33 ± 6.13***52.00 ± 6.38***37.00 ± 4.55***刺五加苷B濃度/（mmol/L）0 15 25 35 n3 3 3 3細(xì)胞遷移率/%53.03 ± 9.31 42.41 ± 4.94*30.47 ± 4.79***18.84 ± 4.13***Transwell遷移細(xì)胞數(shù)213.00 ± 20.61 150.67 ± 11.56**45.67 ± 11.95**19.67 ± 2.62**

表3 刺五加苷B對(duì)H460細(xì)胞遷移侵襲的影響（±s））

表3 刺五加苷B對(duì)H460細(xì)胞遷移侵襲的影響（±s））

注：與0 mmol/L組比較，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

Transwell侵襲細(xì)胞數(shù)83.33 ± 7.59 57.67 ± 3.86**40.37 ± 3.09***22.00 ± 4.89***刺五加苷B濃度/（mmol/L）0 15 20 25 n3 3 3 3細(xì)胞遷移率/%71.76 ± 2.55 50.23 ± 1.88***40.46 ± 2.64***31.98 ± 1.87***Transwell遷移細(xì)胞數(shù)355.00 ± 31.32 154.00 ± 19.20***59.00 ± 4.55***33.33 ± 2.49***

為了探究刺五加苷B 對(duì)肺癌A549 和H460 細(xì)胞侵襲能力的影響，應(yīng)用Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀察。在Transwell 小室中首先鋪上一層基質(zhì)膠，待基質(zhì)膠干至膠狀，加入細(xì)胞，與0 mmol/L 組比較，加藥組中通過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)量呈劑量依賴性減少。結(jié)果見(jiàn)圖6～7。

圖6 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)刺五加苷B對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響（×100）

圖7 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)刺五加苷B對(duì)H460細(xì)胞侵襲的影響（×100）

3.3 刺五加苷B 對(duì)肺癌細(xì)胞E-cadherin、Slug、Snail蛋白表達(dá)水平的影響

EMT上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程在腫瘤的轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色。上述實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)刺五加苷B可以抑制肺癌A549和H460細(xì)胞遷移侵襲，接下來(lái)探究刺五加苷B是否通過(guò)EMT 過(guò)程調(diào)控遷移侵襲。Western blot 表明，刺五加苷B 使E-cadherin 蛋白表達(dá)水平上調(diào)，EMT 轉(zhuǎn)錄因子也使侵襲促進(jìn)因子Slug和Snail表達(dá)水平以濃度依賴的方式被抑制。結(jié)果圖8 和表4、5。因此結(jié)合劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell 遷移侵襲實(shí)驗(yàn)以及Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同說(shuō)明刺五加苷B以濃度依賴調(diào)控EMT進(jìn)程抑制肺癌A549和H460細(xì)胞遷移侵襲。

圖8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表4 刺五加苷B作用A549細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況（±s））

表4 刺五加苷B作用A549細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況（±s））

注：與對(duì)照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

刺五加苷B濃度/（mmol/L）0（歸一化）Snail蛋白相對(duì)水平1.00 ± 0.00 0.83 ± 0.02**0.57 ± 0.07***0.43 ± 0.04***15 25 35 n3 3 3 3 E-cadherin蛋白相對(duì)水平1.00 ± 0.00 1.87 ± 0.21*2.48 ± 0.31**2.95 ± 0.40***Slug蛋白相對(duì)水平1.00 ± 0.00 0.81 ± 0.03*0.66 ± 0.05**0.27 ± 0.11***

表5 刺五加苷B作用H460細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況（±s））

表5 刺五加苷B作用H460細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況（±s））

注：與對(duì)照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

刺五加苷B濃度/（mmol/L）0（歸一化）Snail蛋白相對(duì)水平1.00 ± 0.00 0.84 ± 0.05*0.77 ± 0.09**0.50 ± 0.02***15 20 25 n3 3 3 3 E-cadherin蛋白相對(duì)水平1.00 ± 0.00 2.56 ± 0.33**2.93 ± 0.28***3.24 ± 0.32***Slug蛋白相對(duì)水平1.00 ± 0.00 0.86 ± 0.05*0.69 ± 0.05***0.46 ± 0.05***

4 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的危害人類健康的一種惡性腫瘤，我國(guó)肺癌的發(fā)病率和病死率居于所有惡性腫瘤的榜首［4］，肺癌患者確診時(shí)大多都是處于肺癌晚期狀態(tài)。常用的治療肺癌的方法包括手術(shù)、化療和放療，這些治療方法會(huì)造成患者的生活質(zhì)量低下、不良反應(yīng)增多同時(shí)也給患者造成沉重負(fù)擔(dān)。中藥及其活性成分被證實(shí)具有增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤作用，降低放化療的不良毒副作用并改善患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者生存期［5］。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［6-7］，也能夠使腫瘤細(xì)胞獲得侵襲性［8］。EMT 最重要的標(biāo)志是E-cadherin 蛋白表達(dá)降低，大量文獻(xiàn)報(bào)道E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［9-11］，E-cadherin 蛋白是跨膜糖蛋白的成員，其有維持細(xì)胞穩(wěn)固和粘連的作用，并發(fā)現(xiàn)其是通過(guò)介導(dǎo)鈣依賴性細(xì)胞間黏附的形成來(lái)發(fā)揮作用。EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（EMT-TFs）Snail、Slug、ZEB1、Twist 等的過(guò)表達(dá)及異常激活占有重要地位［12-15］，有研究已經(jīng)報(bào)道，Snail、Slug 參與EMT 過(guò)程并調(diào)控細(xì)胞黏附蛋白，Snail通過(guò)調(diào)控組蛋白甲基化和去乙?；M(jìn)一步抑制上皮基因的表達(dá)，在肝癌細(xì)胞中通過(guò)穩(wěn)定Slug 蛋白的表達(dá)可促進(jìn)EMT發(fā)生［16］。

綜上所述，刺五加苷B 具有抗腫瘤作用，本研究表明刺五加苷B 明顯抑制肺癌A549 和H460 細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移侵襲，并發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)影響EMT 進(jìn)程發(fā)揮其藥理作用。