孔令婉，王悅，張玥，張珊，楊雯越，姚成芳，，?

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355； 2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，山東 濟(jì)南 250355； 3. 山東第一醫(yī)科大學(xué)，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250117）

肺臟腫瘤的高發(fā)病率和高病死率嚴(yán)重威脅人類健康。肺臟對(duì)淋巴細(xì)胞具有較高的依賴性，無(wú)論是NK細(xì)胞等主導(dǎo)的天然免疫還是T細(xì)胞等主導(dǎo)的獲得性免疫，都對(duì)維持肺臟免疫微環(huán)境的穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用。在獲得性免疫中，T細(xì)胞是維持肺臟局部免疫反應(yīng)特異性和持久性的主體免疫細(xì)胞，特別是Ⅰ型輔助性T 細(xì)胞（type 1 T helper cell，Th1），通過(guò)大量分泌γ 干擾素（interferon gamma，IFN-γ）、顆粒酶B（granzyme B，GZMB）等細(xì)胞因子發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤效應(yīng)［1-3］；同時(shí)，Th1還可通過(guò)這些細(xì)胞因子促進(jìn)NK、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞的活化，增強(qiáng)天然免疫效應(yīng)。因此，促進(jìn)肺臟局部淋巴細(xì)胞，特別是Th1細(xì)胞的局部募集可成為增強(qiáng)肺臟免疫、防治腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要策略。

桔梗湯（platycodon decoction，PD）是肺系疾病常用方劑，首載于《傷寒雜病論》，由桔梗、甘草組成，具有清熱解毒、利咽止痛、祛痰排膿等功用。現(xiàn)代藥理研究表明，桔梗湯抗炎作用顯著，可阻斷NF-κB和ERK等信號(hào)活化，降低IL-17A、TNF-α等炎性因子的表達(dá)，抑制COPD進(jìn)程或緩解急性肺損傷［4-5］；另有研究證實(shí)，桔梗湯可通過(guò)調(diào)控Th1/Th2細(xì)胞平衡，在肝癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［6］，但桔梗湯是否可以調(diào)控生理狀態(tài)下或肺臟腫瘤微環(huán)境中Th1在肺臟的分布或募集尚未見報(bào)道。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)和單細(xì)胞測(cè)序等技術(shù)，探討桔梗湯在生理狀態(tài)下和肺臟腫瘤微環(huán)境中，優(yōu)勢(shì)調(diào)控Th1細(xì)胞在肺臟募集特征及作用機(jī)制，為桔梗湯特效治療肺系疾病的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)C57BL/6 雌性小鼠42 只（濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心），6～7周齡，體質(zhì)量18～22 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（魯）20190003，飼養(yǎng)于山東第一醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫22～26 ℃，相對(duì)濕度56%～60%，光照時(shí)長(zhǎng)12 h，黑暗時(shí)長(zhǎng)12 h。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，期間自由攝食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

桔梗、甘草（山東省建聯(lián)中藥股份有限公司）；佛波酯、DisPase 酶Ⅱ、離子霉素、蛋白轉(zhuǎn)錄抑制劑（德國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)：6561-29-8、BCBX6041、871911、569029）；Oligo-dT、TRIzol、M-MLV（美國(guó) Thermo 公司，貨號(hào)：406710、279509、00657100）；膠原酶D（瑞士Roche 公司，貨號(hào)： 11088858001）；胎牛血清（美國(guó)Gemini 公司，貨號(hào)：A24G00J）；脫氧核糖核苷、RNA 酶抑制劑（北京康為世紀(jì)有限公司，貨號(hào)：315A0113、3290-2500）； SYBR?Green master（美國(guó)Bio-Rad 公司，貨 號(hào)：17282）；破膜 液、Fc-Blocking、CD45-Percp-Cy5.5、CD45-APC-Cy7、CD4-PE、CD3-PE-Cy7、NK1.1-BV510、CXCR3-PE、CD4-BV510、NK1.1-Percp-Cy5.5、IFN-γ-PE-Cy7（美國(guó)BD公司，貨號(hào)：554714、176542、550994、557659、2293891、560591、563096、562152、100449、551114、557649）；RT-qPCR引物（上海鉑尚生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)（型號(hào)：SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)公司）；CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)：STERI-Cyclei160，美國(guó)Thermo 公司）；液體真空濃縮煎藥機(jī)（型號(hào)：YZN50，北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司）；高速離心機(jī)（型號(hào)：ST16R，美國(guó)Thermo 公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（型號(hào)：Countess Ⅱ，美國(guó)Thermo 公司）；熒光定量PCR 儀（型號(hào)：LightCycler96，羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）；PCR 擴(kuò)增儀（型號(hào)：JCS0118，德國(guó)Biometra 公司）；酶標(biāo)儀（型號(hào)：Synergy HTX，美國(guó)伯騰儀器有限公司）；全自動(dòng)組織處理器（型號(hào)：Gentle MACS，美天旎生物技術(shù)有限公司）；震蕩儀（型號(hào)：88880018，美國(guó)Thermo 公司）；流式細(xì)胞儀（型號(hào)：FACS Aria Ⅲ，美國(guó)BD公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 桔梗湯的制備

依據(jù)《傷寒雜病論》中的記載，桔梗和甘草的比例為1∶2，因此稱取桔梗250 g，甘草500 g，加入10倍水量浸泡過(guò)夜，煮沸后文火煎煮30 min，收集提取液，再次加8 倍水煎煮，合并兩次提取液并進(jìn)行濃縮、醇沉處理，共得上清5 200 mL，負(fù)壓回收乙醇后得藥液240 mL，生藥濃度為3.12 g/mL。4 ℃冰箱保存。HPLC 分析可知，主要藥效成分含量分別為桔梗皂苷D 3 730 μg/mL，甘草苷4 320.75 μg/mL，甘草酸7 801.38 μg/mL。

2.2 動(dòng)物模型構(gòu)建及給藥方式

2.2.1 正常小鼠灌胃處理

24 只C57BL/6 雌性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（CTRL 組）和PD 用藥組（PD 組），每組12 只，分別用于流式分析（6 只）和RT-qPCR 檢測(cè)（6 只）。按照成人每日服用PD 生藥22.5 g為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)不同動(dòng)物等效劑量折算系數(shù)法，計(jì)算每只 小 鼠灌胃劑量 為2.925 g（/kg·d），每天灌 胃1次，連續(xù)灌胃10 d，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。

2.2.2 B16黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建及給藥方式

18 只C57BL/6 雌性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（CTRL 組）、B16 黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型組（B16 組）和PD 治療組（B16 + PD 組），每組6 只，用于流式分析及分選。除正常對(duì)照組外，B16黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型組和PD 治療組小鼠尾靜脈注射B16 黑色素瘤細(xì)胞（注射濃度為2 × 105個(gè)/mL，注射劑量為200 μL/只），其中，PD 治療組小鼠自注射B16 黑色素瘤細(xì)胞前3 d 開始灌胃PD，連續(xù)灌胃17 d 至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。動(dòng)物處理前12 h禁食，自由飲水。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺臟Th 細(xì)胞及其CXCR3，IFN-γ的表達(dá)

取小鼠肺臟，制備單細(xì)胞懸液，按照每孔2 × 106個(gè)細(xì)胞接種24孔板，加入佛波酯、離子酶素、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，置5% CO2培養(yǎng)箱孵育5 h。孵育完成后，經(jīng)200目無(wú)菌過(guò)濾網(wǎng)將細(xì)胞過(guò)濾至無(wú)菌EP 管中，PBS 緩沖液洗滌兩遍，離心棄上清后加入Fc-Blocking，以阻斷非特異性結(jié)合。再次洗滌后加入外標(biāo)抗體（CD45、CD3、CD4、NK1.1、CXCR3等），放于4 ℃冰箱，避光孵育1 h。PBS 緩沖液再次洗滌后加入穿膜固定液，避光孵育40 min，1 × perm wash洗滌后，加入內(nèi)標(biāo)抗體（IFN-γ），放于4 ℃冰箱，避光孵育1 h，洗滌過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

2.4 RT-qPCR 檢測(cè)肺組織CXCL9，CCL5，IFN-γ，GZMB mRNA水平

取小鼠肺臟，勻漿后加入TRIzol 試劑，室溫放置5 min，提取RNA，檢測(cè)其濃度和純度。將RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。選用30 μL 的反轉(zhuǎn)錄體系，18 μL RNA mix（2 μg RNA + 1 μL OligodT + DEPC 水），70 ℃，5 min；再加入12 μL RT mix（6 μL 5 × RT buffer + 3 μL dNTP + 1.5 μL RNase Inhibitor + 1.5 μL RevertAid Reverse TranscriPtase），42 ℃，1 h。反轉(zhuǎn)錄完成后，選用20 μL 的qPCR 反應(yīng)體系（1 μL cDNA + 7 μL DEPC水 + 各1 μL上、下游引物 +10 μL SYBR?Green master ），94 ℃，10 min；95 ℃，10 s；60 ℃，40 s；72 ℃，5 min； 40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2.5 單細(xì)胞測(cè)序分析

取小鼠肺臟，制備單細(xì)胞懸液，經(jīng)流式分選后收集目的細(xì)胞并檢測(cè)其活性，通過(guò)微流控技術(shù)收集包裹Cell Barcode 的 bead 和細(xì)胞的液滴，裂解液滴中的細(xì)胞暴露出mRNA，使細(xì)胞標(biāo)記Cell Barcode，形成 Single Cell GEMs，反轉(zhuǎn)錄出cDNA 的一條鏈，洗脫序列后，以此為模板通過(guò)PCR 合成第二條鏈，并繼續(xù)擴(kuò)增。獲取原始數(shù)據(jù)后使用FastQC 軟件進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，使用Cell Ranger軟件進(jìn)行質(zhì)量統(tǒng)計(jì)，通過(guò)Seurat軟件包，Single R數(shù)據(jù)包篩除質(zhì)量較低的細(xì)胞數(shù)據(jù)，依據(jù)基因表達(dá)量對(duì)主要數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，鑒定Marker 基因，細(xì)胞類型等，結(jié)果使用Loupe Brower進(jìn)行目的細(xì)胞特征基因分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraPhPad Prism 8 軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用One Way-ANOVA 分析多組間數(shù)據(jù)、t檢驗(yàn)分析兩組間數(shù)據(jù)。P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 生理狀態(tài)下Th1細(xì)胞在肺臟的募集情況

3.1.1 生理狀態(tài)下Th細(xì)胞在肺臟的募集情況比較

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與CTRL 組相比，小鼠經(jīng)PD 灌胃處理后，肺臟CD45+細(xì)胞比例和數(shù)量均明顯升高（P＜ 0.001）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞比例沒(méi)有顯著變化，NKT細(xì)胞比例呈下降趨勢(shì)，但T細(xì)胞比例和數(shù)量上升（P＜ 0.001），其中，Th細(xì)胞比例和數(shù)量升高更為顯著（P＜ 0.001），而CD8+Tc細(xì)胞比例相對(duì)下降，說(shuō)明PD可優(yōu)勢(shì)促進(jìn)Th細(xì)胞在肺臟的募集。見表2、圖1。

表2 各組小鼠肺臟淋巴細(xì)胞比例及數(shù)量比較（±s）

表2 各組小鼠肺臟淋巴細(xì)胞比例及數(shù)量比較（±s）

注：與CTRL組比較，***P ＜ 0.001。

組別CTRL組PD組Th cells/107 7.95 ± 0.47 12.81 ± 0.84***n6 6 CD45P cells/%55.90 ± 0.01 64.33 ± 2.10***CD45P cells/107 51.69 ± 1.66 69.53 ± 2.29***T cells/%22.60 ± 0.91 27.20 ± 1.29***T cells/107 20.85 ± 0.92 29.25 ± 1.33***Th cells/%38.00 ± 1.01 43.67 ± 1.28***

圖1 各組小鼠肺臟淋巴細(xì)胞募集情況

3.1.2 生理狀態(tài)下CXCR3+Th 和IFN-γ+Th 細(xì)胞在肺臟募集情況比較

CXCR3 是Th1 的標(biāo)志性趨化因子受體，IFN-γ 是Th1細(xì)胞特異性功能因子。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與CTRL組相比，PD組小鼠肺臟Th細(xì)胞表達(dá)CXCR3的水平顯著升高，CXCR3+Th細(xì)胞比例和數(shù)量均上升（P＜0.001，P＜ 0.01）；小鼠肺臟Th細(xì)胞表達(dá)IFN-γ的水平顯著升高，IFN-γ+Th 細(xì)胞比例和數(shù)量均上升（P＜0.01，P＜ 0.001）。說(shuō)明PD可顯著促進(jìn)CXCR3+Th細(xì)胞和IFN-γ+Th細(xì)胞在肺臟的募集。見表3、圖2。

表3 各組小鼠肺臟Th細(xì)胞CXCR3、IFN-γ表達(dá)變化（±s，n = 6）

表3 各組小鼠肺臟Th細(xì)胞CXCR3、IFN-γ表達(dá)變化（±s，n = 6）

注：與CTRL組比較，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

組別CTRL組PD組IFN-γ+Th cells/107 0.51 ± 0.06 0.93 ± 0.06***CXCR3+Th cells/%5.52 ± 0.40 7.77 ± 0.34***CXCR3+Th cells/107 1.08 ± 0.31 1.73 ± 0.17**IFN-γ+Th cells/%6.37 ± 0.28 7.44 ± 0.52**

圖2 各組小鼠肺臟Th細(xì)胞CXCR3、IFN-γ表達(dá)情況

3.1.3 生理狀態(tài)下肺組織CXCL9、CCL5、IFN-γ、GZMB mRNA的表達(dá)情況比較

CXCL9、CCL5是Th1細(xì)胞趨化和遷移的重要趨化因子，IFN-γ、GZMB是Th1細(xì)胞的重要功能性因子。RTqPCR結(jié)果顯示，與CTRL組相比，經(jīng)PD灌胃處理后，小鼠肺臟CXCL9、CCL5、IFN-γ、GZMB mRNA表達(dá)水平均不同程度的升高（P＜ 0.001，P＜ 0.05，P＜ 0.01，P＜ 0.05），說(shuō)明PD 可通過(guò)升高趨化因子CXCL9、CCL5，優(yōu)勢(shì)促進(jìn)CXCR3+Th細(xì)胞在肺臟的分布，并且促進(jìn)Th1標(biāo)志性功能因子IFN-γ和GZMB在肺組織中高表達(dá)。見表4、圖3。

表4 各組小鼠肺臟CXCL9、CCL5、IFN-γ、GZMB mRNA表達(dá)情況比較（±s，n = 6）

表4 各組小鼠肺臟CXCL9、CCL5、IFN-γ、GZMB mRNA表達(dá)情況比較（±s，n = 6）

注：與CTRL組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

組別CTRL組PD組mRNA相對(duì)表達(dá)量GZMB 1.03 ± 0.06 1.16 ± 0.08*CXCL9 1.01 ± 0.07 1.75 ± 0.03***CCL5 1.02 ± 0.08 1.16 ± 0.10*IFN-γ 1.03 ± 0.05 1.19 ± 0.07**

圖3 各組小鼠肺組織CXCL9、CCL5、IFN-γ、GZMB mRNA表達(dá)情況

3.2 Th1 細(xì)胞在肺臟腫瘤微環(huán)境中分布并抑制B16黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移情況

3.2.1 肺臟腫瘤微環(huán)境中Th細(xì)胞的募集情況比較

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與CTRL 組相比，B16模型小鼠肺臟Th 細(xì)胞比例和數(shù)量均下降（P＜ 0.001，P＜ 0.05），經(jīng)PD 治療后，Th細(xì)胞比例和數(shù)量均顯著升高（P＜ 0.001，P＜ 0.001）。說(shuō)明在肺臟腫瘤微環(huán)境中，PD可促進(jìn)Th細(xì)胞的浸潤(rùn)或分布。見表5、圖4。

表5 各組小鼠肺臟Th細(xì)胞比例及數(shù)量變化（±s，n = 6）

表5 各組小鼠肺臟Th細(xì)胞比例及數(shù)量變化（±s，n = 6）

注：與CTRL 組比較，*P ＜ 0.05，***P ＜ 0.001；與B16 組比較，###P ＜0.001。

Th cells/107 105.7 ± 10.83 90.70 ± 6.22*114.8 ± 7.63###組別CTRL組B16組B16 + PD組Th cells/%44.33 ± 1.45 38.58 ± 2.06***50.20 ± 1.02***###

圖4 各組小鼠肺臟Th細(xì)胞募集情況

3.2.2 CXCR3+Th 和IFN-γ+Th 細(xì)胞在肺臟腫瘤微環(huán)境中的募集情況比較

在B16黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型中，經(jīng)PD治療后，肺臟腫瘤克隆數(shù)明顯減少（P＜ 0.01），PD對(duì)B16黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移具有顯著的抑制作用。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與B16模型組相比，經(jīng)PD治療后，小鼠肺臟Th細(xì)胞高表達(dá)CXCR3 和IFN-γ，CXCR3+Th 細(xì)胞比例和數(shù)量均升高（P＜ 0.001，P＜ 0.01），IFN-γ+Th細(xì)胞比例和數(shù)量均升高（P＜ 0.001，P＜ 0.01）。說(shuō)明在肺臟腫瘤微環(huán)境中，PD 可促進(jìn)CXCR3+Th 和IFN-γ+Th 細(xì)胞在肺臟募集，使其成為肺臟抗腫瘤的重要效應(yīng)細(xì)胞。見表6、圖5。

表6 各組小鼠肺臟腫瘤克隆及Th細(xì)胞表達(dá)CXCR3、IFN-γ比較（±s）

表6 各組小鼠肺臟腫瘤克隆及Th細(xì)胞表達(dá)CXCR3、IFN-γ比較（±s）

注：與CTRL組比較，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；與B16組比較，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001。

組別CTRL組B16組B16 + PD組IFN-γ+Th cells/107 3.59 ± 0.81 3.44 ± 0.86**##7.62 ± 1.39**##n 6 6 6腫瘤克隆—93.67 ± 12.69 69.33 ± 3.62##CXCR3+Th cells/%3.81 ± 0.28 10.95 ± 1.08***21.83 ± 1.267***###CXCR3+Th cells/107 4.45 ± 0.49 14.86 ± 3.27**23.54 ± 1.37***##IFN-γ+Th cells/%3.67 ± 0.24 3.20 ± 0.29 6.17 ± 0.99***###

圖5 各組小鼠肺臟腫瘤克隆及Th細(xì)胞CXCR3，IFN-γ表達(dá)情況

3.2.3 肺臟腫瘤微環(huán)境中CXCL9、CCL5、IFN-γ、GZMB基因的轉(zhuǎn)錄水平情況比較

單細(xì)胞測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PD 治療后，小鼠肺臟腫瘤微環(huán)境中CXCL9，CCL5 基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，同時(shí)，小鼠肺臟Th1細(xì)胞數(shù)由59升高至89，并且Th1細(xì)胞中IFN-γ 和GZMB 基因轉(zhuǎn)錄水平也明顯升高，說(shuō)明在肺臟腫瘤微環(huán)境中，PD 可促進(jìn)肺臟細(xì)胞高表達(dá)趨化因子CXCL9 和CCL5，促進(jìn)Th1 細(xì)胞在局部募集，且高表達(dá)IFN-γ 和GZMB 等抗腫瘤效應(yīng)因子，進(jìn)而抑制B16黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抗腫瘤作用。見圖6。

圖6 各組小鼠肺臟腫瘤微環(huán)境中Th1細(xì)胞分布及CXCL9、CCL5、IFN-γ、GZMB基因轉(zhuǎn)錄水平變化

4 討論

T 細(xì)胞是維持肺臟免疫微環(huán)境穩(wěn)定的重要細(xì)胞群體，其中，Th 細(xì)胞因大量分泌多種細(xì)胞因子，成為維持免疫微環(huán)境穩(wěn)定、肺臟局部免疫反應(yīng)特異性和長(zhǎng)效性的關(guān)鍵。目前對(duì)Th細(xì)胞亞群的認(rèn)識(shí)越來(lái)越豐富，根據(jù)表型和細(xì)胞因子分泌特征可將Th 分為Th1、Th2、Th17、Treg、Th9 和Tfh 等多個(gè)細(xì)胞亞群。其中，Th1 細(xì)胞以大量分泌IFN-γ 為主要特征，廣泛刺激天然免疫細(xì)胞和獲得性免疫細(xì)胞的活化和增殖［7］。在先天免疫反應(yīng)中，IFN-γ 促進(jìn)巨噬細(xì)胞、Ⅰ型先天淋巴樣細(xì)胞（ILC1s）和自然殺傷細(xì)胞（NK）的激活；可誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞（APC）主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類和Ⅱ類分子高表達(dá)；驅(qū)動(dòng)樹突狀細(xì)胞（DC）的擴(kuò)增，全面協(xié)調(diào)抗腫瘤先天免疫反應(yīng)，在腫瘤發(fā)展早期作用尤為顯著［8-10］。在適應(yīng)性免疫過(guò)程中，IFN-γ 促進(jìn)B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體，加速Th1 極化，促進(jìn)細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（CTL）的激活和記憶T 細(xì)胞（Tm）的擴(kuò)增，從而增強(qiáng)特異性和持久性抗腫瘤免疫［11-13］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Th1 的特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet 也可誘導(dǎo)Th1 細(xì)胞表達(dá)GZMB，PRF1 等殺傷性效應(yīng)因子，實(shí)現(xiàn)MHC-Ⅱ限制性和抗原特異性殺傷功能，進(jìn)一步強(qiáng)化了Th1 細(xì)胞的抗腫瘤效能［14］，使Th1 成為抗腫瘤免疫反應(yīng)的主力軍和放大器。因此，優(yōu)勢(shì)促進(jìn)Th1細(xì)胞在肺臟募集，是保持肺臟局部防御體系完整性、高效性和長(zhǎng)效性的重要策略。

Th1 細(xì)胞表達(dá)CXCR3、CXCR4 和CCR5 趨化因子受體，可在CXCL9/10/11/12 和CCL5 等趨化因子的引導(dǎo)下進(jìn)行組織分布。其中，Th1細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)CXCR3，CXCR3+Th1 細(xì)胞具有快速遷移、迅速識(shí)別病原信號(hào)和大量分泌IFN-γ、GZMB等效應(yīng)因子的特性，是駐守肺臟門戶的重要防御力量［15-17］。

本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是生理狀態(tài)下還是腫瘤微環(huán)境中，PD 均可促進(jìn)小鼠肺臟Th 細(xì)胞IFN-γ、CXCR3 表達(dá)，提示PD 可優(yōu)勢(shì)促進(jìn)Th1 細(xì)胞在肺臟募集，這與PD上調(diào)肺臟基質(zhì)細(xì)胞CXCL9、CCL5的表達(dá)密切相關(guān)。另外，PD 可增強(qiáng)Th1 對(duì)IFN-γ、GZMB 等效應(yīng)因子的釋放能力，而IFN-γ 可進(jìn)一步促進(jìn)CXCL9、CXCR3 的表達(dá)［18］，循環(huán)放大了Th1免疫效應(yīng)，逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)。PD 治療后肺臟腫瘤克隆數(shù)顯著降低，同時(shí)Th1 細(xì)胞中IFN-γ 和GZMB 表達(dá)升高，這些結(jié)果為PD 靶向調(diào)控Th1 募集和活化，放大抗腫瘤效應(yīng)提供了有力證據(jù)。B16 模型組小鼠肺臟CXCR3+Th 細(xì)胞比例也明顯升高，但I(xiàn)FN-γ 分泌能力顯著下降，其升高的CXCR3+Th 細(xì)胞主要來(lái)源于Th17 細(xì)胞（結(jié)果未展示）。進(jìn)一步說(shuō)明PD 可通過(guò)促進(jìn)肺臟趨化因子CXCL9、CCL5 的表達(dá)，優(yōu)勢(shì)募集Th1 細(xì)胞，并大量分泌IFN-γ和GZMB，全面提高肺臟抗腫瘤免疫功能，抑制B16 黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移，為PD抗腫瘤肺臟轉(zhuǎn)移的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

本研究的局限性在于針對(duì)PD 的藥理研究沒(méi)有進(jìn)行劑量依賴性系統(tǒng)觀察，雖然檢測(cè)了PD中部分有效成分的含量，但仍需對(duì)這些成分開展細(xì)胞選擇性和趨化因子靶向性的藥理機(jī)制研究，為PD的臨床應(yīng)用提供更加精準(zhǔn)的科學(xué)證據(jù)。