吳共發(fā) 邱麗湞 曾宇婷 劉鈺君 賴劍龍 姚金科

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 1 病理科,2 健康管理中心,3 肝膽外科,廣東廣州市 511300

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)作為一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,近年來,隨著人們飲食習(xí)慣和社會(huì)環(huán)境的不斷變化,其發(fā)病率逐年增高,目前已經(jīng)成為全世界死亡率第二的腫瘤,嚴(yán)重威脅人們的身體健康和生命安全[1]。其中,CRC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后差和死亡率高的主要原因,也是影響CRC 5年生存率的最強(qiáng)獨(dú)立預(yù)后因素之一[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3],腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(tumor-associated neutrophil, TAN)是CRC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。既往研究證實(shí)[4-6],上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)可通過特定程序?qū)⑸掀ぜ?xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的細(xì)胞,上皮鈣黏素(E-cadherin)表達(dá)減弱甚至缺失和波形蛋白(vimentin)表達(dá)增加是判斷是否發(fā)生EMT的金標(biāo)準(zhǔn)。EMT與CRC的侵襲、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有緊密聯(lián)系,可以作為新的治療策略和途徑。因此,本研究對TAN和EMT在CRC中的臨床病理意義進(jìn)行探討,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析本院2013年9月至2015年12月期間經(jīng)結(jié)直腸癌手術(shù)治療的100例患者的病歷,收集患者的癌組織和癌旁正常組織(距離癌組織5cm以上的正常腸黏膜組織)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)所有患者均經(jīng)過病理證實(shí)為腺癌;(2)患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療和靶向治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有其他惡性腫瘤病史;(2)合并其他肝腎疾病、心腦血管疾病者;(3)不能配合者。納入研究的患者中,男性57例,女性43例;年齡20～91(62.41±12.65)歲;TNM分期[7]:Ⅰ期22例,Ⅱ期34例,Ⅲ～Ⅳ期44例;分化程度:低分化10例,中分化78例,高分化12例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60例;生存隨訪從術(shù)后的第一天開始,本研究的觀察終點(diǎn)時(shí)間為2021年6月4日或該終點(diǎn)時(shí)間點(diǎn)之前因任何原因死亡,平均生存期為(57.26±26.25)個(gè)月。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色檢測TAN浸潤情況 所有病理標(biāo)本經(jīng)過4%中性緩沖甲醛進(jìn)行固定,經(jīng)全自動(dòng)組織脫水機(jī)進(jìn)行固定、脫水、透明和浸蠟,自動(dòng)包埋機(jī)進(jìn)行石蠟包埋制作成石蠟組織塊,4.0 μm厚切片,全自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行常規(guī)HE染色,中性樹膠封片,由高級職稱病理醫(yī)師使用顯微鏡進(jìn)行觀察。觀察病變范圍及程度、黏膜上皮是否完整、腺體排列是否規(guī)則、隱窩結(jié)構(gòu)是否正常、炎癥細(xì)胞浸潤是否增多,以及腺上皮細(xì)胞是否有變化。

1.2.2 免疫組化檢測結(jié)果判定 即用型E-cadherin抗體(貨號MAB-0738)和vimentin抗體(貨號MAB-0735)均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,免疫組化檢測試劑盒(貨號GK500710)購自丹麥Dako公司。免疫組化檢測操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。E-cadherin陽性對照為闌尾腺上皮組織、陰性對照為闌尾平滑肌組織,vimentin陽性對照為闌尾間質(zhì)組織、陰性對照為闌尾腺上皮組織。免疫組化染色完成后,由2名病理醫(yī)師盲法判讀。判斷標(biāo)準(zhǔn)[8]:觀察高倍(400×)視野下陽性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野,計(jì)數(shù)至少200個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞未染色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分?？傇u分=不同染色狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)×對應(yīng)的染色評分。將E-cadherin評分<200分稱為表達(dá)下降,vimentin評分>30分稱為表達(dá)上調(diào)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用(x±s)表示,組間的比較采用t檢驗(yàn)和t′檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示,比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier分析進(jìn)行生存分析,采用Spearman相關(guān)性分析進(jìn)行TAN和EMT與CRC的相關(guān)性分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CRC患者癌組織和癌旁正常組織TAN浸潤情況 在100例CRC患者中,29例CRC組織中有TAN浸潤,癌旁正常組織的腺體底部均未見中性粒細(xì)胞,見圖1。

A:癌旁正常組織無TAN浸潤;B:CRC組織有TAN浸潤(×400)

2.2 不同TAN浸潤情況CRC患者臨床資料的比較 在CRC患者中,有TAN浸潤者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況較無TAN浸潤者差,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表1。

表1 不同TAN浸潤情況CRC患者臨床資料的比較

2.3 不同TAN浸潤情況CRC患者的生存情況的比較 共100例患者,經(jīng)過隨訪后刪失8例。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn),有TAN浸潤患者的中位生存時(shí)間為28個(gè)月,無TAN浸潤患者的累積生存率高于有TAN浸潤患者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=46.436,P<0.001),見圖2。

圖2 不同TAN浸潤情況CRC患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.4 CRC組織和癌旁正常組織E-cadherin和vimentin的表達(dá)情況的比較 在CRC患者中,E-cadherin免疫組化染色總評分低于癌旁正常組織,vimentin免疫組化染色總評分高于癌旁正常組織(均P<0.05),見圖3、表2。

表2 CRC組織和癌旁正常組織E-cadherin和vimentin的表達(dá)情況的比較 [n(%),分]

A:E-cadherin在癌旁正常組織中陽性表達(dá);B:E-cadherin在CRC組織表達(dá)明顯減弱;C:Vimentin在癌旁正常組織中陰性表達(dá);D:Vimentin在CRC組織中陽性表達(dá)(×400)

2.5 CRC患者EMT標(biāo)志物與TAN浸潤的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,TAN浸潤與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.498,P<0.001),與vimentin表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.611,P<0.001),見表3。

表3 CRC患者EMT標(biāo)志物與TAN浸潤的相關(guān)性分析 [n(%)]

3 討 論

中性粒細(xì)胞是保護(hù)機(jī)體免受微生物感染并消除病原體的主要免疫細(xì)胞,具有促進(jìn)腫瘤和抑制腫瘤的雙重作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)[10-11],TAN可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移,且可通過作用于不同細(xì)胞因子產(chǎn)生不同分化表型,如分化成具有對抗腫瘤作用的N1表型和具有促生腫瘤作用的N2表型。盡管兩種分型的功能差異較大,但目前尚未有明確的表面標(biāo)志物能夠?qū)1和N2表型促成的TAN進(jìn)行有效的區(qū)分。研究顯示[12-13],N1表型的TAN可以通過生成腫瘤壞死因子-α、活性氧類、細(xì)胞間黏附分子1、死亡受體等,減少精氨酸酶表達(dá),增強(qiáng)細(xì)胞毒性,起到抗腫瘤的作用;而N2表型的TAN則通過表達(dá)精氨酸酶、血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶9等多種趨化因子,促進(jìn)腫瘤的生長和擴(kuò)散。TAN作為一種重要的炎癥細(xì)胞,在腫瘤微環(huán)境下,可通過生產(chǎn)釋放活性氧類、分泌促腫瘤細(xì)胞因子和趨化因子,以及免疫抑制等促進(jìn)腫瘤發(fā)生,影響腫瘤患者的生存情況[14]。本研究發(fā)現(xiàn),不同TAN浸潤情況CRC患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和生存情況存在差異。這可能是因?yàn)槟[瘤分期越嚴(yán)重、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況越多,治療難度越大,CRC患者生存情況越差。尹小平[15]等報(bào)告CRC患者外周血中TAN表達(dá)水平高,TAN或具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用,在組織學(xué)層面水平進(jìn)一步驗(yàn)證了TAN在CRC中的作用。

腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移首先需要打破與周圍細(xì)胞之間的連接,通過破壞基底膜障礙,侵入周圍間質(zhì),從而進(jìn)入血液循環(huán),造成癌細(xì)胞的擴(kuò)散。EMT是癌細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)發(fā)生侵襲和遷移的重要機(jī)制,E-cadherin表達(dá)水平下降和vimentin表達(dá)水平增加是判斷EMT發(fā)生的重要標(biāo)志[16]。本研究結(jié)果顯示,和癌旁正常組織比較,CRC組織中E-cadherin表達(dá)下降,vimentin表達(dá)上調(diào),說明CRC組織中存在EMT現(xiàn)象。本研究還發(fā)現(xiàn),TAN與EMT相關(guān)蛋白表達(dá)存在密切關(guān)系。Berry等[17]的研究發(fā)現(xiàn),高水平的TAN與CRC患者的總體生存改善有關(guān),這可能是因?yàn)楦咚降腡AN能夠抑制腫瘤的分化。研究顯示[18-20],TAN可促進(jìn)CRC侵襲、轉(zhuǎn)移,造成患者的預(yù)后不良,提示TAN可促進(jìn)EMT的發(fā)生與發(fā)展,進(jìn)而誘發(fā)了CRC的侵襲、轉(zhuǎn)移,且CRC的發(fā)展部分可能是TAN通過參與EMT過程實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,TAN浸潤與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān),與vimentin表達(dá)呈正相關(guān);TAN可能通過參與EMT過程,促進(jìn)CRC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。