■ 戰(zhàn)曉燕 滑志民 陳菊紅 劉志國

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095；2.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201699；3.遼寧威蘭生物技術(shù)有限責(zé)任公司，遼寧沈陽 110020）

肉雞生長速度快，其免疫系統(tǒng)和肝臟功能發(fā)育相對不完善，易遭受各種病原菌的侵襲。脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一，也是其侵襲宿主的關(guān)鍵成分，可引起機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，破壞肝臟結(jié)構(gòu)和功能，對動物的全身性健康和生產(chǎn)性能都可造成很大危害[1]。

研究發(fā)現(xiàn)LPS 對巨噬細(xì)胞和腎臟的刺激會增加精氨酸的消耗并抑制精氨酸的產(chǎn)生[2]，說明精氨酸的耗竭可能在LPS 誘導(dǎo)機(jī)體損傷反應(yīng)的過程中起到重要作用。精氨酸是一種重要的功能性氨基酸，也是家禽的一種必需氨基酸，在機(jī)體免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要功能。體外研究表明精氨酸可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞免疫反應(yīng)[3]，緩解細(xì)胞炎癥反應(yīng)和死亡[4]。添加精氨酸可調(diào)節(jié)肉雞內(nèi)臟器官中白介素和干擾素等細(xì)胞因子的表達(dá)[5]，減輕LPS 刺激引起的畜禽炎癥反應(yīng)和肝臟損傷[6-7]。以上研究結(jié)果表明精氨酸具有緩解LPS 誘導(dǎo)肉雞肝臟損傷的潛力。目前在畜禽生產(chǎn)中使用的精氨酸產(chǎn)品通常是L-精氨酸單體，研究表明動物消化道對小肽吸收效率高于氨基酸[8-9]，小肽形式可能比游離氨基酸形式的精氨酸的功效更好[10-11]。故本試驗擬探究一種新的精氨酸源-富精氨酸小肽（arginineriching small peptide, ARSP）對LPS 刺激下肉雞肝臟功能的保護(hù)作用，從而評估其在養(yǎng)殖中的應(yīng)用價值，以期為ARSP作為一種新型精氨酸源在養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

ARSP（遼寧威蘭生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供）是以豆粕和玉米漿干粉為發(fā)酵原料，以精氨酸產(chǎn)生菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌和植物乳桿菌作為發(fā)酵菌群，在特定生產(chǎn)工藝條件下發(fā)酵生成。ARSP 中粗蛋白含量為52%，小肽（分子量低于2 000 u）含量在12%以上，精氨酸含量為3.26%。LPS（貨號L2880）來源于大腸桿菌O55:B5，購自Sigma公司。

1.2 試驗設(shè)計

選擇120 只1 日齡AA 肉公雞[初始體重（49.85±1.92） g]按照2×2 因子設(shè)計隨機(jī)分為4 個組：對照組、LPS 組、ARSP 組和ARSPL 組，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)10 只雞，各重復(fù)之間的初始體重?zé)o顯著差異。其中，對照組和LPS 組肉雞飼喂基礎(chǔ)日糧，ARSP 組和ARSPL組肉雞飼喂基礎(chǔ)日糧并添加0.5%ARSP?；A(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。LPS組和ARSPL組肉雞于第27、29、31 天分別腹腔注射LPS（1 mg/kg 體重）一次，對照組和ARSP組于相同時間注射等量生理鹽水。于31 d 注射后3 h 和12 h 后，從每個重復(fù)中隨機(jī)挑選一只雞進(jìn)行翅靜脈采血并分離肝臟，剪取一小塊肝臟樣，液氮速凍后保存于-80 ℃。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗雞采用立體籠養(yǎng)、人工持續(xù)光照制度，育雛時采用紅外燈供暖，保持正常溫度（第1 周33～34 ℃，第2 周27～31 ℃），其后視具體氣溫情況供暖；雞舍自然通風(fēng)，相對濕度保持在55%～65%。試驗期間雞自由采食和飲水，每天觀察雞群的健康狀況，及時處理死雞并記錄。按飼養(yǎng)常規(guī)進(jìn)行雞舍消毒并對雞只進(jìn)行免疫。

1.4 指標(biāo)分析

1.4.1 血清肝功能酶的活性

將采血管中的血液傾斜放置2 h 后，在4 ℃以3 000 r/min 離心20 min，取血清裝于離心管中，放入-20 ℃冰箱中保存。采用比色法測定血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）以及堿性磷酸酶（ALP）的活性。試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。

1.4.2 肝臟細(xì)胞因子的含量

稱取0.2 g肝臟組織樣品，加入9倍體積預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行勻漿，將勻漿液以8 000 r/min 離心10 min，分離上清液，稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測肝臟勻漿上清液中細(xì)胞因子,包括白介素（IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10 和IL-12）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的含量。以上所有試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司。

1.4.3 肝臟基因的mRNA相對表達(dá)量

采用試劑盒FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit（南京諾唯贊生物有限公司）提取肝臟樣品總RNA，使用Nano-drop2000 檢測上述RNA 的濃度和純度，再用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢驗RNA 樣品的完整性。采用HiScript Ⅱ qRT Super Mix for qPCR 試劑盒（南京諾唯贊生物有限公司）對上述RNA 樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 樣品，隨即采用2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒（南京諾唯贊生物有限公司）在Apllied Biosystems ABI-7500 儀器上進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s；再分別于58.1、60.1、62.0 ℃和64.0 ℃退火15 s；72 ℃延伸30 s，歷經(jīng)30個循環(huán)；最后于72 ℃徹底延伸5 min。各基因引物序列信息如表2 所示。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)量。

表2 引物序列信息

1.5 統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示，利用SPSS 20.0 軟件中GLM 過程中的two-way ANOVA 對結(jié)果進(jìn)行分析。方差分析顯著時，用Duncan’s 法做多重比較，以P＜0.05 作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)，0.05＜P＜0.10則認(rèn)為趨向顯著。交互作用顯著時，采用one-way ANOVA進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清肝功能相關(guān)酶活性的測定結(jié)果

由表3 可知，血清AST 和ALT 活性在LPS 注射后3 h 顯著增加（P＜0.05），血清AST 和ALP 活性在LPS注射后12 h顯著增加（P＜0.05）。ARSP 處理可顯著降低）注射后3 h血清ALP活性（P＜0.05），并有降低注射后3 h血清AST活性的趨勢（P=0.063）。

表3 注射LPS后肉雞血清肝功能相關(guān)酶的活性 (U/L)

2.2 肝臟細(xì)胞因子含量的測定結(jié)果

如表4所示，肝臟中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12及TNF-α的含量在LPS注射后3 h和12 h均顯著增加（P＜0.05）。LPS注射后3 h，ARSP處理顯著減少肝臟中IL-4 和IL-8 的含量（P＜0.05）。LPS 注射后12 h，ARSP處理顯著減少肝臟中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12及TNF-α的含量（P＜0.05）。此外，在LPS注射后3 h和12 h，ARSP與LPS之間對肝臟細(xì)胞因子含量存在交互作用，ARSP顯著降低了LPS注射組肉雞肝臟中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α的含量（P＜0.05）。

表4 注射LPS后肉雞肝臟細(xì)胞因子的含量（ng/L）

2.3 肝臟細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)量的測定結(jié)果

由表5 可知，肝臟細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-12α、IL-12β和INF-γ的表達(dá)量在注射LPS 后3 h和12 h都顯著上調(diào)（P＜0.05）。在LPS 注射后3 h，ARSP 處理顯著下調(diào)（P＜0.05）肝臟IL-12β和INF-γ的表達(dá)量（P＜0.05）；而在LPS注射后12 h，ARSP處理顯著下調(diào)肝臟INF-γ的表達(dá)量（P＜0.05）并有下調(diào)IL-1β表達(dá)量的趨勢（P=0.059）。ARSP與LPS之間對肝臟細(xì)胞因子表達(dá)量存在交互作用（P＜0.05）：在LPS注射后3 h，ARSP顯著下調(diào)LPS 組肉雞肝臟中IL-1β、IL-6、IL-12α、IL-12β和INF-γ的表達(dá)量（P＜0.05）；而在LPS 注射后12 h，ARSP顯著下調(diào)LPS組肉雞肝臟中IL-1β、IL-8和INF-γ的表達(dá)量（P＜0.05）。

表5 注射LPS后肉雞肝臟細(xì)胞因子的mRNA相對表達(dá)量

2.4 肝臟炎癥信號分子mRNA相對表達(dá)量的測定結(jié)果

由表6 可知，注射LPS 后3 h 和12 h，肝臟中炎癥信號分子TLR2、TLR4、NF-κB p65和TRAF6的表達(dá)量均顯著上調(diào)（P＜0.05）。ARSP 與LPS 之間對上述信號分子表達(dá)量存在交互作用（P＜0.05），表現(xiàn)為：ARSP 對正常組肉雞肝臟TLR2、TLR4、TRAF6和NF-κB p65的表達(dá)量無顯著影響（P＞0.05），但顯著下調(diào)LPS 注射組肉雞肝臟中TLR2和TLR4表達(dá)量以及NF-κB p65（注射后12 h）和TRAF6（注射后3 h）的表達(dá)量（P＜0.05）。此外，在注射后3 h 時，ARSP 還有下調(diào)LPS 注射組肉雞肝臟NF-κB p65表達(dá)量的趨勢（P=0.057）。

表6 注射LPS后肉雞肝臟炎癥信號分子的mRNA相對表達(dá)量

3 討論

肝臟是體內(nèi)最大的實質(zhì)臟器，是營養(yǎng)物質(zhì)代謝與合成的關(guān)鍵器官。腸腔中一些細(xì)菌代謝產(chǎn)物可通過門靜脈易位到肝臟中，導(dǎo)致肝臟損傷，進(jìn)而危害機(jī)體的全身健康。LPS 是革蘭氏陰性病原菌細(xì)胞壁中的關(guān)鍵抗原成分，可誘導(dǎo)肉雞肝臟炎癥反應(yīng)[12]。研究表明緩解LPS 造成的肝臟炎性損傷對于家禽健康具有重要意義[13]。

保護(hù)畜禽肝臟健康的方法主要有藥物性手段和營養(yǎng)性手段，而后者安全性高且能起到一定的預(yù)防效果，因而在養(yǎng)殖業(yè)中備受推崇。補(bǔ)充精氨酸是緩解畜禽肝臟損傷的一個重要營養(yǎng)性手段[7]。目前動物生產(chǎn)中使用的L-精氨酸單體，而動物對小肽的利用比對氨基酸的利用更高效[10-11]，小肽形式可能比游離形式的精氨酸更好地發(fā)揮作用功效。故本試驗探究了ARSP（作為一種新的精氨酸源）對LPS 刺激下肉雞肝臟功能的保護(hù)效果。

LPS 刺激可引起肝細(xì)胞膜通透性增加甚至壞死，使得肝細(xì)胞內(nèi)的酶釋放進(jìn)入血液中，故血清中與肝功能相關(guān)的酶（如ALT、AST 和ALP）的活性可反映肝臟損傷程度。很多研究表明，LPS刺激可增加血清ALT、AST 和ALP 的活性[12，14]。本試驗同樣發(fā)現(xiàn)LPS注射后3 h 和12 h，肉雞血清ALT、AST 和ALP 的活性顯著增加，證實LPS 引起了肉雞肝細(xì)胞損傷。而添加ARSP可降低肉雞血清ALT、AST 和ALP 的活性，說明ARSP對 LPS 引起的肉雞肝臟損傷具有緩解作用。前人研究表明飼糧中補(bǔ)充精氨酸可緩解禽腺病毒導(dǎo)致的肉雞肝細(xì)胞損傷[15]及LPS 刺激導(dǎo)致的仔豬肝臟結(jié)構(gòu)破壞和功能紊亂[7]。

在LPS 注射后數(shù)小時之內(nèi)，會引起機(jī)體較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，肝臟產(chǎn)生和釋放大量細(xì)胞因子，比如IL 和TNF[16]，并呈現(xiàn)時間依賴性變化[17]。與此同時，為了盡可能減輕炎性介質(zhì)對自身組織造成的損傷，機(jī)體同時存在著復(fù)雜的抑炎機(jī)制，比如分泌一些抗炎因子[1]。在本試驗中，我們觀測到肝臟中促炎因子（IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8 和IL-12）和抗炎因子（IL-4 和IL-10）的含量在LPS 注射后的3 h 和12 h 基本都顯著增加，表明LPS 刺激導(dǎo)致了肉雞肝臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生，后者同時也反饋性引起肝臟抗炎反應(yīng)的發(fā)生，這是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制。但這種保護(hù)機(jī)制可能加劇營養(yǎng)消耗，最終不利于肉雞生長性能的發(fā)揮。精氨酸可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，在動物機(jī)體免疫反應(yīng)以及抗炎癥過程中發(fā)揮重要作用[18-19]。有研究表明飼糧精氨酸可緩解LPS 誘導(dǎo)的動物肝臟炎癥反應(yīng)和損傷[5，15]。本試驗發(fā)現(xiàn)飼糧中添加ARSP 緩解了LPS 刺激引起肉雞肝臟中多種促炎因子含量的增加，進(jìn)而反饋性引起肝臟中抗炎因子分泌減少（含量下降）。除了炎癥因子的含量，我們還同時測定了肉雞肝臟炎癥因子mRNA 表達(dá)量的變化。測定結(jié)果同樣表明LPS顯著上調(diào)肝臟促炎因子（IL-1β、IL-6、IL-12α、IL-12β和INF-γ）的表達(dá)量，而添加ARSP 逆轉(zhuǎn)了LPS 刺激引起的上述促炎因子表達(dá)量的上調(diào)。以上結(jié)果證實ARSP可有效抑制LPS引起的肉雞肝臟炎癥反應(yīng)。

TLRs 是細(xì)胞膜表面的一類跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體家族，其中的TLR2 和TLR4 可識別LPS，經(jīng)過下游通路的介導(dǎo)引起胞內(nèi)NF-κB 等信號通路的激活，最終啟動各種炎性介質(zhì)的產(chǎn)生[20-21]。當(dāng)TLR4或TLR2與LPS結(jié)合后，在CD14 分子的協(xié)助下轉(zhuǎn)移至TLR4-MD2 復(fù)合體，引發(fā)下游級聯(lián)免疫反應(yīng)，募集髓樣分化因子88（MyD88）和TRIF 等接頭分子。TLR4 既能通過MyD88/TIRAP（MyD88 依賴性途徑）也可通過TRIF/TRAM（MyD88 非依賴性途徑）將信號傳導(dǎo)至胞內(nèi)，進(jìn)而作用于TRAF6。TRAF6 的活化可引起NF-κB 抑制因子（IκB）激酶（IKKs）活化，導(dǎo)致胞漿中IκB 磷酸化，其中的IκBα與NF-κB 二聚體（p50-p65）發(fā)生解離，游離出來的NF-κB p65 亞基隨即轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與DNA 特定片段結(jié)合，從而啟動一系列炎癥基因的表達(dá)[22]。本試驗中，肉雞肝臟中炎癥信號分子TLR2、TLR4、NF-κB p65和TRAF6的表達(dá)量在LPS注射后3 h和12 h 均顯著上調(diào)，提示LPS 可通過TLR2/NF-κB 和TLR4/NF-κB通路誘導(dǎo)肉雞肝臟炎癥反應(yīng)。前人研究表明精氨酸可通過代謝產(chǎn)生一氧化氮來調(diào)節(jié)TLR4信號通路的狀態(tài)[23]。在肉雞上的研究發(fā)現(xiàn)飼糧中補(bǔ)充精氨酸可通過抑制TLR4 信號通路緩解LPS 誘導(dǎo)肉雞全身性和腸道炎癥反應(yīng)[24]，在仔豬上的研究表明飼糧精氨酸可抑制TLR4/NF-κB通路緩解LPS誘導(dǎo)肝臟炎性損傷[25]。本試驗中，無論是注射后3 h 還是12 h，ARSP 處理都緩解了LPS 刺激引起的肝臟中TLR4和TLR2表達(dá)量上調(diào)，并緩解了注射后12 h 時肝臟NFκB p65表達(dá)量上調(diào)以及注射后3 h 時肝臟TRAF6表達(dá)量上調(diào)，這些結(jié)果表明了ARSP 可通過抑制TLR4/NF-κB或TLR2/NF-κB信號通路的激活減輕LPS誘導(dǎo)肉雞肝臟炎癥反應(yīng)，進(jìn)而有利于緩解肝臟損傷（血清肝功能相關(guān)酶活性的增加）。

4 結(jié)論

LPS 刺激引起肉雞肝臟炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞損傷。飼糧中添加ARSP可抑制TLR4//NF-κB和TLR2/NF-κB信號通路的激活緩解肉雞肝臟中炎癥因子表達(dá)量的上調(diào)，進(jìn)而減輕LPS誘導(dǎo)肉雞肝臟損傷。