賈修濱,劉春燕,3,劉運(yùn)超,劉伯言,張 穎

(1山東第一醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院·山東 泰安 271000;2山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院·山東 泰安 271000;3泰安市中醫(yī)二院·山東 泰安 271000)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是全球最廣泛的肝病之一,在普通人群中患病率接近30%,中國脂肪性肝病正以每年0.594%的速度增長[1]。NAFLD的發(fā)生與發(fā)展與機(jī)體攝入熱量超標(biāo)緊密相關(guān),高脂飲食導(dǎo)致脂肪在肝臟中過度積累誘發(fā)NAFLD[2],而其發(fā)病的初始步驟是三酰甘油(TG)在肝細(xì)胞中的沉積[3]。迄今為止,尚無針對NAFLD發(fā)病機(jī)制的特效治療藥物。尋找安全有效、機(jī)制明確的藥物用于 NAFLD 的防治,成為研究者的重要任務(wù)。肉蓯蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)是管狀花目列當(dāng)科(Orobanchaceae)肉蓯蓉屬的一種寄生植物,其主要成分苯乙醇苷(Phenylethanoid glycosides)具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗衰老、抗輻射、抗氧化以及保肝等作用[4-5]。本研究擬對肉蓯蓉苯乙醇苷(Phenyle-thanoid glycosides fromCistanchedeserticola, PGCD)改善脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物 肉蓯蓉肉質(zhì)莖(含水量8.5%)購買于安徽亳州康美中藥城;苯乙醇苷(主要成分毛蕊花糖苷和松果菊苷)對照品(純度均為>98%)購買于四川成都曼斯特生物科技有限公司;阿伐他?。荷虾］x瑞公司;依折麥布：默沙東制藥有限公司。

1.2 實驗動物 6～8周齡雄性C57BL/6J小鼠和ApoE-/-小鼠,體質(zhì)量(20±2)g,購買于常州卡文斯實驗動物有限公司,許可證號：SCXK(蘇)2016-0010,12 h/12 h循環(huán)光照,溫度(22±1)℃,濕度50%～60%,自由攝入食物和水。實驗前,小鼠喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)1 周。所有動物養(yǎng)護(hù)和實驗均遵循山東第一醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會章程(倫理學(xué)編號：W202107080303)。

1.3 實驗試劑 高脂飼料：Harlan Teklad;TG、ALT、AST試劑盒：北京索萊寶生物科技有限公司;FAS、LCAD試劑盒：上海朗頓生物科技有限公司;GSH-Px 試劑盒：上海紀(jì)寧生物科技有限公司;SOD、MDA、LPO、BCA試劑盒：南京建成生物科技有限公司;Trizol 試劑盒：Invitrogen, Carlsbad, CA;ACOX1和 CPT2引物：生工生物工程(上海)有限公司設(shè)計。

1.4 實驗儀器 Hei-VAP Expert 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph;Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀：Thermo Fisher;FD8508真空冷凍干燥機(jī)：韓國Ilshin;F6/10勻漿器：上海氟魯克;Agilent1260高效液相色譜儀、Cary 3500紫外分光光度計：安捷倫科技有限公司;Quant Studio5RT-PCR儀：賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司。

2 實驗方法

2.1 藥物提取及含量測定 參照以往方法提取純化肉蓯蓉苯乙醇苷[4]：稱取適量干燥后的肉蓯蓉肉質(zhì)莖粉末(40目),65 ℃條件下50%乙醇超聲提取46 min,3 次,濃縮濾液,濃縮液經(jīng)水稀釋,采用HPD300大孔吸附樹脂純化得到苯乙醇苷提取物。紫外分光光度法333 nm處檢測總苯乙醇苷含量,高效液相色譜法檢測苯乙醇苷主要活性成分毛蕊花糖苷和松果菊苷的含量。

2.2 動物分組及給藥 70 只雄性ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組(MOD)、阿伐他汀[20 mg/(kg·d)]+依折麥布[20 mg/(kg·d)]陽性對照組(A+C)及肉蓯蓉苯乙醇苷低、中、高劑量組[250、500、1 000 mg/(kg·d)](L-PGCD、M-PGCD、H-PGCD),每組14 只,均以高脂飼料(脂肪42%,膽固醇0.15%)喂飼12 周;另取14 只雄性C57BL/6J小鼠喂食普通飼料作為正常對照組(CON)。

2.3 觀察指標(biāo)及測定 12 周末,小鼠禁食過夜,實驗前稱量體質(zhì)量,戊巴比妥鈉麻醉后處死小鼠,血漿在4 ℃條件下離心,離心半徑7.5 cm,3 000 r/min,15 min,取血清低溫保存;取肝組織稱重,于-80℃保存。

2.3.1 體質(zhì)量和肝臟指數(shù) 12周末,小鼠禁食后稱量體質(zhì)量,戊巴比妥鈉麻醉后處死小鼠,取肝臟,計算肝臟指數(shù)。

2.3.2 血清指標(biāo)檢測 取血清,按照試劑盒操作依次檢測血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性;BCA測定血清中蛋白含量,檢測TG含量。

2.3.3 肝組織脂質(zhì)代謝相關(guān)因子檢測 4 ℃條件下,稱取適量新鮮肝臟于PBS中勻漿,離心(離心半徑7.5 cm,3 000 r/min)勻漿液1 min,取上清液,BCA測定肝組織蛋白含量,檢測肝組織中TG含量,ELISA方法檢測肝組織脂肪酸合成酶(FAS)和長鏈?；o酶A脫氫酶(LCAD)含量。

2.3.4 肝組織相關(guān)氧化因子檢測 4 ℃條件下,稱取適量新鮮肝臟于PBS中勻漿,離心(離心半徑7.5 cm,3 000 r/min)勻漿液15 min,取上清液,BCA測定肝組織蛋白含量,按照試劑盒說明檢測超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性,同時檢測丙二醛(MDA)和脂質(zhì)過氧化物(LPO)含量。

2.3.5 RT-PCR檢測肝組織ACOX1/CPT2 mRNA表達(dá) 取新鮮肝臟組織適量,采用Trizol 試劑盒提取肝組織總mRNA,利用MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA合成,以 cDNA 為模板,進(jìn)行實時熒光定量 PCR(quantitative realtime PCR,Qpcr)檢測, 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性10 s、退火： 60 ℃ 30 s、72 ℃延伸 35 s,循環(huán)次數(shù) 34 次,最后 72 ℃條件下再延伸 5 min,自動分析儀實時定量ACOX1和CPT2 mRNA表達(dá)。采用Rotor-gene Q software ver.1.7 (Qiagen) 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,2-△△Ct方法統(tǒng)計mRNA相對GAPDH水平,每組實驗平行進(jìn)行>3 次。引物序列如下： GAPDH, 上游： 5’-TGCCACCC AGAAGACTGTG-3’, 下游： 5’-ATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3’; ACOX1,上游： 5’-CGCCACCTT CAATCC AGAGT-3’ 下游： 5’-TCTGCGATGCCAAATTCCCT-3’; CPT2, 上游： 5’-TCCTCCTACTC AGGACGCAA-3’ 下游：TTGGGATCTTCCGCTCACAC。

3 實驗結(jié)果

3.1 肉蓯蓉提取物中苯乙醇苷含量及其主要活性成分 紫外分光光度計檢測純化后的提取物中苯乙醇苷含量為81.00%,高效液相色譜檢測苯乙醇苷中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量分別為31.16%和7.23%。

3.2 肉蓯蓉苯乙醇苷對小鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響 見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)比較

3.3 肉蓯蓉苯乙醇苷對小鼠血清TG、ALT、AST水平的影響 見表2。

表2 各組小鼠血清TG、ALT、AST水平比較

3.4 肉蓯蓉苯乙醇苷對小鼠肝臟脂質(zhì)及脂質(zhì)代謝酶含量的影響 見表3。

表3 各組小鼠肝組織TG含量及FAS、LCAD含量比較

3.5 肉蓯蓉苯乙醇苷對小鼠肝組織相關(guān)氧化因子的影響 見表4。

表4 各組小鼠肝組織GSH-PX、SOD活性及MDA、LPO含量比較

3.6 肉蓯蓉苯乙醇苷對ACOX1/CPT2 mRNA表達(dá)的影響 見圖1。

注：與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01圖1 各組小鼠肝組織ACOX1、CPT2 mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測結(jié)果比較

4 討論

肝臟是機(jī)體最主要的代謝器官,肝脂質(zhì)代謝障礙可引發(fā)多種疾病,例如NAFLD、高脂血癥、代謝綜合征、動脈粥樣硬化等。肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝包括脂肪合成和脂肪分解,二者相互作用以維持脂代謝的平衡。FAS是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)源性脂肪酸合成過程的重要酶系之一,也是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶,可催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成TG,FAS主要調(diào)控脂肪酸的合成[6]。正常肝細(xì)胞中FAS呈低表達(dá),而代謝異常組織中的FAS呈過表達(dá),在許多代謝相關(guān)疾病的發(fā)展過程中起重要作用。本文結(jié)果可見,肉蓯蓉苯乙醇苷可顯著降低肝組織FAS水平,提示其在抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)合成中發(fā)揮一定作用。LCAD在肝細(xì)胞脂肪酸β氧化中催化長鏈脂肪酸第一步脫氫反應(yīng),是脂肪酸分解代謝的關(guān)鍵酶[7]。本文結(jié)果可見,肉蓯蓉苯乙醇苷可顯著上調(diào)LCAD含量,提示其具有加速肝臟脂質(zhì)代謝之功效。

ACOX1作為β氧化酶之一,在脂肪酸進(jìn)入線粒體后,發(fā)揮重要作用。ACOX1是脂肪酸β氧化的關(guān)鍵限速酶,主要調(diào)節(jié)脂肪酸在線粒體和過氧化物酶體中的β氧化過程,促進(jìn)脂肪酸的代謝[8]。ACOX1 還是過氧化體氧化增殖的標(biāo)志,研究顯示ACOX1基因敲除小鼠,肝細(xì)胞嚴(yán)重脂肪變性和自發(fā)過氧化體增殖,證實了ACOX1 在 NAFLD 中的作用[9-10]。本文實驗結(jié)果表明,高脂飲食導(dǎo)致脂肪酸代謝過程顯著減慢,肝內(nèi)脂質(zhì)沉積和過氧化物MDA、LPO增多;肉蓯蓉苯乙醇苷可劑量依賴性地升高ACOX1 mRNA在肝組織的表達(dá)水平,抑制FAS的活性,從而顯著降低TG 在肝組織的沉積和MDA、LPO過度表達(dá)。

CPT系統(tǒng)不僅在長鏈脂肪酸β-氧化這一過程中起著重要作用,同時 CPT 系統(tǒng)也是線粒體脂肪酸氧化產(chǎn)生ATP 的關(guān)鍵組成部分[11]。CPT2基因是CPT家族中的一個亞型,CPT2 蛋白位于線粒體內(nèi)膜,是線粒體β-氧化的限速酶。在脂代謝過程中,CPT2 基因參與TG分解與脂肪酸代謝相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄活化,從而調(diào)控相關(guān)酶的表達(dá),對脂代謝起調(diào)控作用[12]。本實驗結(jié)果顯示,高、中劑量肉蓯蓉苯乙醇苷可顯著提升CPT2 mRNA在肝組織的表達(dá)水平,表明肉蓯蓉苯乙醇苷能改善脂肪酸β氧化障礙,減少異常代謝產(chǎn)物堆積,逆轉(zhuǎn)脂質(zhì)氧化增加趨勢,從而降低脂質(zhì)在肝組織的沉積。

肉蓯蓉因富含苯乙醇苷類、糖類、環(huán)煉醚蔽類、揮發(fā)油類、木脂素類、生物堿類、氨基酸等多種活性成分而被譽(yù)為“沙漠人參”,不僅作為傳統(tǒng)名貴中藥材,也是常用的補(bǔ)益用品之一[13]。苯乙醇苷類物質(zhì)是肉蓯蓉的主要活性成分,其種類和含量是評價肉蓯蓉質(zhì)量的重要指標(biāo)[14]。本研究初步探討了肉蓯蓉苯乙醇苷對肝組織脂質(zhì)代謝的影響,結(jié)果表明肉蓯蓉苯乙醇苷能夠顯著降低高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠血清和肝組織中TG含量升高,與其調(diào)控脂質(zhì)代謝的FAS酶和LCAD酶含量有關(guān)。實驗顯示肉蓯蓉苯乙醇苷可提高抗氧化酶SOD和GSH-px酶活性,降低脂質(zhì)過氧化物MDA和LPO含量,抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肝組織ALT和AST活性,從而改善高脂飲食誘導(dǎo)的肝組織過氧化損傷。關(guān)于肉蓯蓉苯乙醇苷各活性成分的藥理作用及其其調(diào)控ACOX1/CPT2的深入機(jī)制將在后續(xù)研究中報道。