吳 迪,王 清,張殿文,李 偉,李 響

(1吉林省中醫(yī)藥科學院·吉林 長春 130012;2吉林大學基礎醫(yī)學院·吉林 長春 130021)

發(fā)熱是各種疾病常見的臨床癥狀,西醫(yī)常規(guī)給予解熱藥等進行治療,反復應用易出現(xiàn)一定的副作用。而中藥治療不僅標本兼治,可雙向調(diào)節(jié)且毒副作用較小[1-2]。黃芩是清熱復方制劑中應用較為廣泛的中藥之一,具有清熱瀉火解功效[3]。黃芩黃酮類化合物的含量較高,黃芩苷具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗抑郁、解熱、降壓和抗變態(tài)反應等藥理作用[4]。在很黃芩復方制劑中,黃芩苷解熱作用顯著[5],其解熱機制還不十分清楚。本研究采用背部皮下注射干酵母方法構(gòu)建大鼠發(fā)熱模型,觀察不同劑量不同時間黃芩苷的解熱作用,通過檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2和cAMP的含量以及腦組織NF-κB表達,探討其解熱機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康SPF級SD 大鼠75 只,雄性,6周齡,體質(zhì)量180～200 g,購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2020-0001,質(zhì)量合格證號為210726220101217356。實驗前適應環(huán)境3 d,屏障條件下常規(guī)喂養(yǎng),自由攝取水和食物。

1.2 藥物及試劑 黃芩苷：購自潤友化學(深圳)有限公司,批號G07S11L123706;阿司匹林腸溶片：購自沈陽奧吉娜藥業(yè)有限公司,國藥準字H20065051。酵母浸粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司,批號20210302;RIPA裂解液：北京康為世紀生物科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒：上海碧云天公司;TNF-α、1L-1β、1L-6、PGE2和cAMP ELISA試劑盒：美國BD公司。

1.3 主要儀器 ST-360酶標儀：上海科華實驗系統(tǒng)有限公司;DT5-3低速臺式離心機：北京時代北利離心機有限公司;HC-3618R型高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司;KZ-II高速組織研磨儀：武漢賽維爾生物科技有限公司;微量移液器：德國Eppecdorf公司;BT255天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥 取適應環(huán)境的SD大鼠75 只,實驗前測量大鼠的基礎肛溫。剔除體溫超過正常范圍或相鄰兩次體溫差值過大的動物。取其平均值作為基礎體溫。選出符合實驗條件的大鼠70 只,分為正常對照組10 只(蒸餾水10 mL/kg)、造模組60 只(20%干酵母10 mL/kg)。造模組隨機分為模型組(蒸餾水10 mL/kg),阿司匹林腸溶片組(0.1 g/kg),黃芩苷高、中、低劑量組(160、80、40 mg/kg),每組12 只。正常組和模型組灌胃相同體積的蒸餾水,其他各組分別給予相應藥液,每日1 次,連續(xù)3 d。第3 天采用酵母菌誘導大鼠發(fā)熱模型[6-7]。實驗前12 h禁食不禁水,給藥第3 天,除正常組背部皮下注射生理鹽水(10 mL/kg),其余各組均背部皮下注射20%干酵母混懸液(10 mL/kg)。酵母菌注射2 h后,給予第3 天藥液。

2.2 觀察指標及檢測方法

2.2.1 體溫測定 造模組大鼠皮下注射干酵母混懸液后,每間隔1 h測量1 次體溫,造模成功后(約2 h),每組選擇造模成功的10 只大鼠進行測溫。各組分別灌胃給予相應藥液,藥后1、2、3、4 h各測量體溫1 次,記錄數(shù)據(jù)。

2.2.2 血清TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2與cAMP含量測定 末次測溫后,3%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉(300 mg/kg,10 mL/kg),解剖大鼠,腹主動脈取血,靜置,4 ℃、離心半徑8 cm,2 500 r/min離心10 min,收集上清液,按照試劑盒說明書方法,ELISA方法測定大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、cAMP含量。

2.2.3 腦組織NF-κB p65蛋白表達的Western Blot檢測 稱取100 mg腦組織加入RIPA裂解液及磷酸酶抑制劑于1.5 mL的EP管中,超聲粉碎后靜置15～20 min,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,取上清用BCA法進行蛋白定量;Western blot法檢測NF-κB p65蛋白表達,以β-actin為內(nèi)參,根據(jù)蛋白灰度比值,計算相對表達量。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠體溫變化 見表1。

表1 各組大鼠體溫變化比較

3.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、cAMP含量變化 見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、cAMP水平比較

3.3 各組大鼠腦組織NF-κB p65蛋白表達的Western Blot檢測結(jié)果 見圖1～圖2。

注：1.正常組;2.模型組;3.阿司匹林組;4～6.黃芩苷高、中、低劑量組圖1 各組大鼠腦組織NF-κB p65蛋白表達的Western Blot 檢測結(jié)果

注：1.正常組;2.模型組;3.阿司匹林組;4～6.黃芩苷高、中、低劑量組與模型組比較 *P<0.05,**P<0.01圖2 各組大鼠腦組織NF-κB p65表達的比較

4 討論

利用干酵母構(gòu)建發(fā)熱模型是研究藥物解熱作用機制的常用方法[8]。注射酵母菌后,注射部位發(fā)生局部潰爛,從而引發(fā)劇烈炎癥反應而發(fā)熱[9]。龔春燕[10]利用干酵母誘導發(fā)熱模型明確了酵母菌的致熱作用。黨玨[11]吳佳霖[12]等的研究證實干酵母致熱后動物體溫的發(fā)展變化趨勢,本文模型組動物體溫的發(fā)展變化與之相一致。干酵母誘導體溫升高后,促進內(nèi)生致熱原的產(chǎn)生和釋放,同時激活體內(nèi)的內(nèi)生致熱原細胞[13]。目前公認的參與多種致熱性發(fā)熱的重要細胞因子包括 TNF-α、IL-1β、IL-6[14],其通過作用于中樞體溫正性調(diào)節(jié)介質(zhì),促使下丘腦前部視前區(qū)的體溫正調(diào)節(jié)中樞核將體溫調(diào)定點上調(diào),引起發(fā)熱[15]。PGE2是與體溫調(diào)節(jié)有關(guān)的主要介質(zhì),同時也是最強的內(nèi)生致熱源之一[16-17]。研究表明,發(fā)熱時動物的血清或者腦脊液中PGE2含量增高。cAMP是發(fā)熱中樞正調(diào)節(jié)介質(zhì)[18],cAMP含量增多,體溫相對應升高,二者成顯著正相關(guān)[19]。PGE2和cAMP可通過某種特定方式作用于下丘腦,使體溫調(diào)定點上移,引起體溫升高。NF-κB是細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子家族的通用名稱,參與機體的應激反應、炎癥反應、免疫應答和調(diào)節(jié)細胞凋亡等,是重要的核轉(zhuǎn)錄因子和關(guān)鍵介質(zhì)[20]。一系列致病刺激如：細菌毒性產(chǎn)物和病毒蛋白、炎性細胞因子、生長因子、物理化學因子、致凋亡因子、輻射、缺血/再灌注和氧化應激均可激活NF-κB通路。由此可見,NF-κB的活化是引起炎癥的關(guān)鍵步驟[21]。NF-κB家族成員有P50(NFκB1)、P65(RelA)、P52(NFκB2)、RelB和c-Rel。其發(fā)揮生物學作用的前提是各個亞型形成二聚體,最常見的就是NF-κB p65[22]。許多包含中藥成分的抗炎藥物,都以NF-κB p65炎癥信號通路的激活為靶點[23]。因此,抑制NF-κB是抑制發(fā)熱的有效途徑。

本研究結(jié)果表明,模型組大鼠皮下注射酵母菌懸液后體溫持續(xù)升高達6 h,而黃芩苷高劑量組大鼠體溫明顯低于模型組,且血清TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2和cAMP含量明顯降低;提示黃芩苷對致熱炎癥因子有顯著抑制作用。同時,模型組大鼠下丘腦NF-κB p65蛋白表達量增多,而黃芩苷高劑量組大鼠NF-κB p65蛋白表達下降,提示黃芩苷對腦組織NF-κB p65蛋白有抑制作用。表明黃芩苷通過抑制炎癥因子的分泌和釋放以及降低腦組織NF-κB p65蛋白的活性從而影響NF-κB信號通路來發(fā)揮解熱作用。