葉 芳 ，李鶴祥

（韶關(guān)學(xué)院 化學(xué)與土木工程學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

龍眼又名桂圓，它開(kāi)胃健脾，補(bǔ)虛益智，可藥食兼用，是極好的滋補(bǔ)佳品［1-2］. 中國(guó)是龍眼的原產(chǎn)國(guó)及生產(chǎn)大國(guó)，種植面積和產(chǎn)量均居世界首位［2-3］. 我國(guó)每年在獲得龍眼果肉及其加工產(chǎn)品過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量廢棄的龍眼殼，若能合理利用這些廢棄的龍眼殼，不僅能夠節(jié)約資源，保護(hù)環(huán)境，還能提高龍眼種植業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益. 而龍眼殼中所富含的黃酮類(lèi)化合物，具有抗氧化抗衰老［4-5］、抗腫瘤［6-7］、改善血液循環(huán)［8-9］、降低膽固醇［10］、鎮(zhèn)痛［11］等作用.

影響龍眼殼黃酮提取率的因素較多，如提取的溶劑溶解度、溫度、時(shí)間以及料液比等，只有通過(guò)大量試驗(yàn)探索才能得到提取的最佳條件. 為了減少試驗(yàn)次數(shù)，本研究采用了響應(yīng)面法來(lái)得到龍眼殼中黃酮提取的最佳條件.

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要試驗(yàn)材料與儀器

龍眼購(gòu)自韶關(guān)市市場(chǎng)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（福州飛凈生物科技有限公司）；無(wú)水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3及NaOH 均為分析純（天津大茂化學(xué)試劑廠）；722S 型分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；AUY-220 型電子天平（日本島津公司）；KQ-50B 型超聲波清洗儀器（江蘇昆山儀器有限公司）；SHD-Ⅲ型真空泵（保定市陽(yáng)光儀器廠）.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 龍眼殼原料的處理

將廢棄的龍眼殼清洗干凈，自然晾干，80 ℃烘干，粉碎，過(guò)0.213 mm（80 目）的篩子，即為廢棄龍眼殼粉末，待用.

1.2.2 龍眼殼黃酮的超聲提取方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的廢棄龍眼殼粉末，分別加入適量乙醇，超聲提取一段時(shí)間，冷卻至室溫，離心，取上清液測(cè)定吸光度，計(jì)算廢棄龍眼殼中的黃酮提取率.

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取25.0 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用50%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇溶液完全溶解后轉(zhuǎn)移到250.0 mL 容量瓶中，再用50%乙醇溶液稀釋至刻度線(xiàn)并搖勻，即可得濃度為0.1 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，待用［12］.

分別量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 于25.0 mL 容量瓶中，各加入5% NaNO2溶液1.0 mL，搖勻靜置6 min 后，各加入10% Al（NO3）3溶液1.0 mL，搖勻，靜置6 min［13-14］，再各加入4%NaOH 溶液10.0 mL，搖勻后用乙醇定容，搖勻，靜置15 min，在波長(zhǎng)510 nm 處用分光光度計(jì)測(cè)其吸光度.繪制吸光度A隨蘆丁c（mg·mL-1）變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程為A=27.336c-0.004 71，R2=0.999 8.

1.2.4 龍眼殼中黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g 廢棄龍眼殼粉末，加入25.0 mL 70%乙醇，超聲50 min 后，冷卻至室溫，離心，取1.0 mL的上清液于25.0 mL 容量瓶中，加入1.0 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min，加入1.0 mL 10% Al（NO3）3溶液，搖勻，靜置6 min［13-14］，再加入10.0 mL 4%NaOH 溶液，搖勻，再加入無(wú)水乙醇定容至刻度線(xiàn)，搖勻后靜置15 min，在510 nm 波長(zhǎng)處用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度A，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的黃酮質(zhì)量濃度c（mg·mL-1），按公式Y(jié)=c×1.0/（1.00×1 000）×25×100%計(jì)算黃酮提取率Y（%）. 式中，1.0 為所取上層清液體積，mL；1.00 為取樣質(zhì)量，g；1 000 為換算系數(shù)，mg·g-1；25 為返算倍數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取6 份1.00 g 龍眼殼粉末，分別加25.0 mL的70%乙醇，使液料比為25∶1，分別超聲提取20、30、40、50、60、70 min，冷卻至室溫，離心，取1.0 mL 上層清液，按“1.2.4”方法測(cè)其吸光度，然后計(jì)算出龍眼殼中的黃酮提取率，考察超聲提取時(shí)間對(duì)龍眼殼黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1.由圖1 可知，隨著超聲提取時(shí)間的增加，龍眼殼黃酮提取率逐漸增加，但是超聲提取時(shí)間超過(guò)50 min 后，提取率反而下降，這可能是由于開(kāi)始隨著提取時(shí)間增加，龍眼殼黃酮能夠充分溶解出來(lái)，所以黃酮含量逐步增加，但是提取時(shí)間超過(guò)50 min 后，長(zhǎng)時(shí)間的超聲作用會(huì)破壞龍眼殼黃酮的結(jié)構(gòu)，降低黃酮的提取率，同時(shí)組織中大量破裂的細(xì)胞，增加了溶液中的雜質(zhì)含量，使有效成分的溶出受到影響［15］，因而，選擇50 min 為適宜的超聲提取時(shí)間.

圖1 超聲提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

2.1.2 乙醇體積濃度對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取6 份龍眼殼粉末1.00 g，分別加入25.0 mL的體積濃度為40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液，使液料比25∶1，搖勻后，將其超聲提取50 min，提取過(guò)程及黃酮測(cè)定方法同“2.1.1”，考察乙醇體積濃度對(duì)龍眼殼黃酮提取率影響，結(jié)果見(jiàn)圖2. 由圖2 中可知，隨著乙醇體積濃度的增大，龍眼殼黃酮的提取率逐漸提高，但當(dāng)乙醇濃度超過(guò)70%后，龍眼殼黃酮的提取率反而降低，這可能是由于開(kāi)始隨著乙醇體積濃度增加，龍眼殼中黃酮更容易溶解，但是乙醇體積濃度超過(guò)70%后，從廢棄龍眼殼中溶出的一些親脂類(lèi)雜質(zhì)反而抑制了黃酮的溶出［16］.

圖2 乙醇體積濃度對(duì)黃酮提取率的影響

2.1.3 液料比對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取6 份1.00 g 龍眼殼粉于錐形瓶中，分別按照10∶1、15∶1、20∶1，25∶1、30∶1 的液料比加入不同體積的70%乙醇，搖勻后超聲提取50 min，提取過(guò)程及黃酮測(cè)定方法同“2.1.1”，考察液料比的改變對(duì)龍眼殼黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3. 由圖3 可知，隨著液料比的增加，龍眼殼黃酮提取率逐步增大，直到液料比超過(guò)25∶1 后，提取率趨于穩(wěn)定，這可能是由于開(kāi)始隨著液料比增加，使得龍眼殼粉末與乙醇溶液接觸更充分，因此黃酮提取率也會(huì)隨著提高［17-18］，但是當(dāng)液料比超過(guò)25∶1 后，龍眼殼中的黃酮已在乙醇溶液中溶解達(dá)飽和，所以試驗(yàn)確定料液比為25∶1 較合適.

圖3 液料比對(duì)黃酮提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲提取時(shí)間（A），乙醇體積濃度（B）和液料比（C）3 個(gè)因素為自變量，并以1，0，-1 代表自變量的高、中、低水平，以廢棄龍眼殼黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，參照Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3 因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平，如表1.

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

2.3 響應(yīng)面法分析及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)方案，以超聲提取時(shí)間（A），乙醇體積濃度（B）和液料比（C）3 個(gè)因素為自變量，龍眼殼黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了3 因素3 水平共17 個(gè)響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2，采用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合分析［19-24］. 得到龍眼殼中黃酮提取率為響應(yīng)值（Y）的二次多元回歸方程為Y=-2.847 080+0.032 600A+0.059 678B+0.069 575C+1.665 330×10-18AB-1.400 000×10-4AC-5.000 000×10-6BC-2.772 500×10-4A2-4.097 500×10-4B2-1.179 000×10-3C2.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4 回歸方程的方差分析

對(duì)回歸方程進(jìn)行顯著性方差分析及誤差統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表3 和表4［10，19-24］. 回歸模型的F值為58.90，P＜0.01，表明回歸模型極顯著，回歸方程擬合度好；失擬項(xiàng)的F值為2.17，P值0.234 7＞0.05，說(shuō)明模型的失擬項(xiàng)差異不顯著、誤差由隨機(jī)誤差而引起、該模型與試驗(yàn)有良好的擬合性；相關(guān)系數(shù)R2為0.987 0，表明預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值之間具有較高的相關(guān)性；校正系數(shù)R2Adj為0.970 2，預(yù)測(cè)系數(shù)R2Pred=0.863 2 且R2Adj-R2Pred＜0.2，兩個(gè)系數(shù)值高且接近，說(shuō)明回歸模型能充分說(shuō)明試驗(yàn)過(guò)程；模型的變異系數(shù)CV值為0.64%＜10%，表明試驗(yàn)可信度和精確度高；精密度（Adeq Precision）=21.466＞4，視為合理，也從另外一個(gè)角度表明此方程模型可信度高，能很好地描述本次試驗(yàn)結(jié)果，因此可用該模型來(lái)優(yōu)化龍眼殼中黃酮提取條件.

表3 方差分析結(jié)果

表4 誤差統(tǒng)計(jì)分析表

同時(shí)根據(jù)表3 中的P值大小可以看出，一次項(xiàng)A、B、C均對(duì)響應(yīng)值Y的影響極顯著（P＜0.01）；模型交互項(xiàng)AC、AB、BC均對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著（P＞0.05）；模型二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)響應(yīng)值的影響均極顯著（P＜0.01）. 因此，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系. 由F值大小可知，各因素對(duì)龍眼殼中黃酮提取率的影響順序?yàn)椋築（乙醇體積濃度）＞C（液料比）＞A（超聲提取時(shí)間）.

2.5 響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖分析

根據(jù)擬合的二次回歸方程可繪制各影響因素之間的三維立體響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖，可直觀顯示相關(guān)因素對(duì)響應(yīng)值（龍眼殼黃酮提取率）的交互影響作用，其中響應(yīng)面的坡度越陡峭，表明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大；且等高線(xiàn)圖的形狀越接近橢圓，表明兩因素間的交互作用越明顯［10，19-24］. 具體見(jiàn)圖5～圖7.

圖5 超聲提取時(shí)間和液料比交互作用的響應(yīng)面和等高線(xiàn)

由圖5 可知，響應(yīng)面中液料比曲線(xiàn)比超聲提取時(shí)間更為陡峭，說(shuō)明液料比對(duì)響應(yīng)值（龍眼殼黃酮提取率）的影響比超聲提取時(shí)間大，但從兩者的等高線(xiàn)圖形狀可以看出，超聲提取時(shí)間和液料比的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響不太顯著，這與表3 中的方差分析結(jié)果相符.

由圖6 可知，響應(yīng)面中乙醇體積濃度曲線(xiàn)比超聲提取時(shí)間更陡峭，說(shuō)明乙醇體積濃度對(duì)龍眼殼黃酮提取率的影響比超聲提取時(shí)間大，但從兩者的等高線(xiàn)圖形狀可以看出，超聲提取時(shí)間與乙醇體積濃度的交互作用對(duì)龍眼殼黃酮提取率的影響不顯著，這與表3 中的方差分析結(jié)果相符.

圖6 超聲提取時(shí)間和乙醇體積濃度交互作用的響應(yīng)面和等高線(xiàn)

由圖7 可知，響應(yīng)面上乙醇體積濃度曲線(xiàn)的陡峭程度比料液比大，說(shuō)明乙醇體積濃度對(duì)龍眼殼黃酮提取率的影響比液料比大. 但從兩者的等高線(xiàn)圖形狀可以看出，乙醇體積濃度與液料比的交互作用對(duì)龍眼殼黃酮提取率的影響不顯著，這與表3 中的方差分析結(jié)果相符.

圖7 乙醇濃度和液料比交互作用的響應(yīng)面和等高線(xiàn)

2.6 驗(yàn)證優(yōu)化條件

經(jīng)過(guò)Design-Expert 8.0.6 軟件分析預(yù)測(cè)，在超聲提取時(shí)間為52.16 min，乙醇體積濃度為72.66%，液料比為26.25∶1 的條件下，可從廢棄龍眼殼中得到最大的黃酮提取率為1.085%. 為了檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果與真實(shí)情況是否吻合，我們進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn). 考慮試驗(yàn)實(shí)際操作情況，將條件數(shù)據(jù)四舍五入，調(diào)整超聲提取時(shí)間為52 min，乙醇體積濃度為73%，液料比為26∶1；在此條件下，分別進(jìn)行3 次試驗(yàn)，測(cè)得實(shí)際的廢棄龍眼殼中黃酮的提取率為1.071%、1.075%、1.078% ，取平均值約為1.075%，與預(yù)測(cè)結(jié)果相近，說(shuō)明應(yīng)用響應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化提取廢棄龍眼殼中黃酮，具有較好的實(shí)用價(jià)值.

3 結(jié)論

本研究試驗(yàn)利用響應(yīng)面法探究了超聲提取廢棄龍眼殼中的黃酮條件，試驗(yàn)表明各因素對(duì)提取率的影響大小順序?yàn)椋阂掖俭w積濃度＞液料比＞超聲提取時(shí)間，最佳提取條件是：超聲提取時(shí)間52 min，乙醇體積濃度73%，料液比26∶1 時(shí)，超聲輔助醇法對(duì)龍眼殼中黃酮的提取率可達(dá)1.075%.