古淑青, 陳念念, 曾 靜, 彭小雨, 張 敏, 高 宇,潘麗娜, 葛 城, 李 威, 伊雄海, 郭德華, 鄧曉軍

(1. 上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心, 上海 200135; 2. 澳優(yōu)乳業(yè)(中國)有限公司, 湖南 長沙 410127;3. 上海體育大學(xué)國家興奮劑檢測上海實驗室, 上海 200438)

目前,動物乳市場朝著多元化方向快速發(fā)展,除普通牛乳外,駱駝乳、山羊乳、水牛乳、馬乳、驢乳、牦牛乳等特種乳受到人們的廣泛關(guān)注。聯(lián)合國糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization, FAO)的數(shù)據(jù)顯示,截止到2020年,牛乳仍占全球生鮮乳生產(chǎn)量排名的榜首,水牛奶、山羊奶、綿羊奶和駱駝奶等特種乳產(chǎn)量相對較低,其中駱駝乳產(chǎn)量遠低于其他動物乳[1]。駝乳營養(yǎng)豐富,被譽為“沙漠白金”,不含有過敏原β-乳球蛋白,適合過敏癥患者,且成分與人乳相似,可以作為人乳替代品[2]。由于駱駝乳產(chǎn)量低,乳供應(yīng)量明顯受季節(jié)性波動的影響,且奶源質(zhì)量難以控制,駱駝乳及其制品成為蓄意摻假的目標。向高價值的駱駝乳及其制品中摻入低價值的牛、羊等動物乳是最常見的摻假行為,這不僅會造成消費者的經(jīng)濟損失,還可能危害消費者的身體健康。因此,亟需建立一種準確、高效的駝乳及其制品中的動物源性成分測定方法。

常用的駱駝奶和其他物種奶的鑒別主要采用基于DNA的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)[3-7]、基于蛋白質(zhì)組學(xué)的質(zhì)譜(MS)[8-10]、二維凝膠電泳(2-DE)[11]與核磁共振(NMR)[12]等方法。然而,由于多重引物設(shè)計要求高,PCR方法無法實現(xiàn)8個物種同時檢測;2-DE方法分辨率較低,需要結(jié)合MS方法進行驗證,這兩種方法均增加了實驗的復(fù)雜性;而NMR方法無法靶向識別目標物,需要額外的數(shù)據(jù)解析?；诘鞍踪|(zhì)組學(xué)的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)技術(shù)克服了以上問題,具有通量高、特異性強且操作簡便的優(yōu)勢,可根據(jù)不同物種本身蛋白質(zhì)氨基酸序列的細微差異識別動物乳來源,同時可以高效、準確地靶向定量多個物種的特征肽段[13]。

本文將超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Q/Exactive-HRMS)和超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(UHPLC-QqQ-MS)相結(jié)合,篩選出駱駝、家牛、水牛、牦牛、山羊、綿羊、驢和馬共8個物種的22個特征肽段,并建立了以特征肽段為分析對象的駱駝奶/奶粉摻假鑒別和定量方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Ultimate 3000超高效液相色譜-Q-Exactive HRMS四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司);LC-30 AD超高效液相色譜-MS-8060三重四極桿質(zhì)譜儀(日本Shimadzu公司);離心機(Allegra X-22R,美國Beckman Coulter公司);水浴鍋(SW22,德國Julabo公司);渦旋混合器(美國Talboys公司);所有實驗用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制得。

碳酸氫銨(NH4HCO3,純度≥99%)、尿素(CH4N2O,純度≥99%)、氯化鈉(NaCl,純度≥99%)、氯化鈣(CaCl2,純度≥99%)、二硫蘇糖醇(DTT,純度≥99%)、碘乙酰胺(IAA,純度≥99%)均購自德國Merck公司。乙腈(色譜純,美國Thermo Fisher公司)、甲酸(色譜純,德國Fluka公司)、Tris-HCl緩沖液(1 mol/L, pH=8.0,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、胰蛋白酶(測序級,美國Promega公司)。

低蛋白吸附管(1.5 mL,德國Eppendorf公司),低蛋白吸附移液器吸頭(10～100 μL, 100～1 000 μL,德國Brand公司),醋酸纖維素膜(0.22 μm,天津博納艾杰爾科技有限公司)。駱駝奶/奶粉及其他動物奶/奶粉購自市場。

1.2 實驗條件

1.2.1樣品前處理

吸取10 mL液態(tài)乳(或稱取1 g奶粉用超純水定容至10 mL),于-20 ℃冷凍10 min, 10 000 r/min下離心5 min,然后用玻璃棒挑去液態(tài)乳上層的脂肪層。取200 μL脫脂乳,加入800 μL乙腈(含1%甲酸),振蕩混勻,-20 ℃放置30 min。10 000 r/min下離心5 min,棄去上清液。加入1 mL超純水懸浮沉淀并振蕩混勻,10 000 r/min下離心3 min,棄去上清液。向沉淀中加入800 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液(含6 mol/L尿素),渦旋振蕩5 min。觀察無明顯顆粒,用50 mmol/L NH4HCO3溶液(含6 mol/L尿素)定容至1 mL。用超純水稀釋5倍后待酶解。

1.2.2酶解

吸取200 μL試樣于1.5 mL低蛋白吸附離心管中,加入200 μL 500 mmol/L NH4HCO3溶液,10 μL 500 mmol/L DTT,渦旋混勻,于75 ℃恒溫水浴中振蕩30 min。靜置至室溫,加入20 μL 500 mmol/L IAA,混勻,置于暗處避光反應(yīng)30 min。加入10 μL 100 mmol/L CaCl2溶液,向離心管中加入20 μL 100 μg/mL的胰蛋白酶溶液,37 ℃酶解過夜。放至室溫,加入10 μL甲酸終止反應(yīng),渦旋后靜置15 min。加水補至1 mL, 用0.22 μm低蛋白吸附濾膜過濾,濾液待上機檢測。

1.2.3UHPLC-Q/Exactive-HRMS條件

采用UHPLC-Q/Exactive-HRMS進行多肽生物標志物的鑒定。

色譜條件 色譜柱為Aeris peptide XB-C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Phenomenex, USA),流動相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B為0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液。液相色譜梯度洗脫程序:0～4 min, 97%A; 4～19 min, 97%A～30%A; 19～20 min, 30%A～10%A; 20～24 min, 10%A; 24～25 min, 10%A～97%A; 25～30 min, 97%A。流速:0.2 mL/min;進樣體積:10 μL;柱溫:40 ℃。

質(zhì)譜條件 電噴霧電離(ESI)源,正離子模式;噴霧電壓3.5 kV,毛細管溫度320 ℃,輔助氣體溫度250 ℃,鞘氣壓力206.85 kPa,輔助氣壓力68.95 kPa;采用全掃描數(shù)據(jù)依賴的二級離子掃描模式(Full MS/Data-dependent-MS2),掃描范圍為m/z300～1 500 ;全掃描一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜的分辨率分別為70 000和17 500。

圖 1 駱駝特征肽段INEDNHPQLGEPVK(m/z 795.4)的碎片離子實驗結(jié)果與理論對比Fig. 1 Comparison of experimental results and the theoretical prediction results for the fragment ion arrangement of the precursor ion at m/z 795.4 assigned to the camel marker peptide INEDNHPQLGEPVK The red and green lines represent the fragment peaks of the theoretical y and b ions, respectively. The blue lines represent the experimentally obtained ion fragment peaks.

1.2.4UHPLC-QqQ-MS條件

采用UHPLC-QqQ-MS定量檢測特征肽段。

色譜條件 XBridge BEH Amide XP色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm),流動相A為0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液,流動相B為0.1%(v/v)甲酸水溶液。梯度洗脫程序:0～2 min, 5%A; 2～11 min, 5%A～55%A; 11～13 min, 55%A; 13～13.1 min, 55%A～5%A; 13.1～15 min, 5%A。流速:0.3 mL/min,進樣體積:5 μL;柱溫:40 ℃。

質(zhì)譜條件 ESI源,正離子模式;霧化氣:氮氣,2 L/min;加熱氣:空氣,12 L/min;干燥氣:氮氣,6 L/min;碰撞氣:氬氣;離子源接口溫度:350 ℃;脫溶劑管(DL)溫度:300 ℃;加熱模塊溫度:400 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 特征肽段的選擇

特征肽段的篩選原則與步驟和之前的工作[14]所述一致。采用Uniprot數(shù)據(jù)庫對駱駝(Camelus)、家牛(Bostaurus)、水牛(Bubalusbubalis)、牦牛(Bosgrunniens/Bosmutus)、山羊(Caprahircus)、綿羊(Ovisaries)、驢(Equusasinus)和馬(Equuscaballus)這8個物種搜索常見乳蛋白(酪蛋白、α-乳球蛋白和β-乳清蛋白等)的氨基酸序列。借助Skyline軟件模擬酶切后,基于BLAST搜索UniprotKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫,篩選理論特征肽段。采用UHPLC-Q/Exactive-HRMS對8個物種來源的真實奶/奶粉進行蛋白質(zhì)確證。選Full MS/Data-dependent-MS2模式進行掃描,通過Protein Pilot軟件(Version5.0, ABSCIEX)對特征肽段進行鑒定和篩選。多肽的質(zhì)譜鑒定主要考察特征肽段的質(zhì)譜碎片離子檢測結(jié)果與理論碎片的匹配度。檢測到的碎片離子峰和理論碎片峰匹配度高,表明該肽段的置信度高,更適合于后續(xù)的MRM定量分析。多肽在二級質(zhì)譜中,主要產(chǎn)生C端碎片離子(y離子)和N端碎片離子(b離子)。以駱駝特征肽段INEDNHPQLGEPVK碎片離子質(zhì)譜圖(圖1)為例,理論y離子碎片峰和b離子碎片峰與實驗獲得的碎片峰具有較好的匹配度,28個理論y、b離子碎片峰中有19個碎片峰得到鑒定,表明該肽段的實驗結(jié)果與理論碎裂模式高度匹配,可進一步應(yīng)用于MRM模式定量分析。

選擇鑒定結(jié)果較好的肽段作為備選特征肽段。特征肽段為目標蛋白中所特有的能夠?qū)⑵渑c其他蛋白質(zhì)特異性區(qū)分的肽段序列,是一段高保守的氨基酸序列,不含易脫氨的Asp-Gly、易環(huán)化的N端Gln等,不易發(fā)生修飾影響定量;易被質(zhì)譜系統(tǒng)檢測,且具有響應(yīng)較強的碎片離子;酶切具有較高的重現(xiàn)性,不會發(fā)生錯切或漏切;8～25個氨基酸長度的肽為優(yōu)先選擇。在滿足上述條件的基礎(chǔ)上,還要考察特征肽段在實際樣品檢測中的適用性,采用MRM技術(shù)對多種真實物種來源的樣品乳酶切后進行質(zhì)譜檢測采集數(shù)據(jù),保留響應(yīng)高、干擾峰少、穩(wěn)定的肽段,最終確定駱駝、家牛、水牛、牦牛、山羊、綿羊、驢和馬共22條特征肽段,結(jié)果見表1。

表1 8個物種的特征肽段及MRM參數(shù)

2.2 MRM方法的優(yōu)化

在質(zhì)譜電離技術(shù)中,所謂的“軟電離”技術(shù),例如電噴霧電離,靈敏度高,源內(nèi)碎片最少,已發(fā)展成為食品蛋白質(zhì)和多肽分析的首選方法[15,16]。通過優(yōu)化儀器的碰撞能量、載氣流量、脫溶劑管溫度和離子源接口溫度,可以提高方法的靈敏度。以駱駝特征肽段IEEQQQTEDEQQDK(874.42+→ 992.4+)為例,子離子是由母離子經(jīng)氬氣碰撞后所產(chǎn)生的碎片,每個子離子均對應(yīng)一個最佳的碰撞能,利用Skyline軟件生成優(yōu)化碰撞能方法,對離子通路m/z874.4>992.4分別施加29.5～39.5 eV的11個不同碰撞能,結(jié)果表明,碰撞能為35.5 eV時可獲得最佳的響應(yīng)強度(圖2a)。

利用島津LC-MS/MS自帶的Interface軟件考察了霧化氣、加熱氣和干燥氣流量、脫溶劑管溫度和離子源接口溫度對離子響應(yīng)強度的影響,如圖2b～d所示。結(jié)果表明,當霧化氣、加熱氣和干燥氣流量分別為2、12和6 L/min時,離子響應(yīng)強度最高;當DL溫度和離子接口溫度分別為300 ℃和350 ℃時,離子響應(yīng)強度最佳。按照相同步驟,對每個離子對優(yōu)化出一個最佳的質(zhì)譜條件,生成最終的MRM定量方法。22條特征肽段優(yōu)化后的MRM參數(shù)見表1,優(yōu)化后特征肽段的提取離子色譜圖見圖3。

圖 2 駱駝特征肽段IEEQQQTEDEQQDK的質(zhì)譜條件考察Fig. 2 Investigation on MS conditions of the IEEQQQTEDEQQDK peptide of camela. collision energy; b. nebulizing gas flow rate; c. heating and drying gas flow rates; d. desolvation line (DL) and interface temperatures.

2.3 前處理條件的選擇

全脂奶主要由乳脂球和酪蛋白膠束組成,酪蛋白膠束粘附在乳脂球表面,脫脂處理后二者分離[17]。有研究表明,部分酪蛋白通過疏水鍵與膠束結(jié)合,冷卻至4 ℃會使一些鍵斷裂,導(dǎo)致β-酪蛋白從膠束中解離[18],增加其游離態(tài)濃度。因此,本工作對比了酪蛋白提取前脫脂處理前后質(zhì)譜響應(yīng)信號的變化情況,結(jié)果顯示冷凍脫脂確實對β-酪蛋白肽段C4的響應(yīng)信號顯示出積極作用(圖4a)。

動物乳中酪蛋白含量約占蛋白質(zhì)總量的80%左右[19],對酪蛋白進行提取純化有利于去除雜質(zhì),增加所選定量肽段的檢測信號。本工作綜合考察了丙酮、乙腈、乙醇3種不同的有機溶劑沉淀法和等電點(isoelectric point, pI)沉淀法對肽段響應(yīng)強度的影響、操作過程的難易程度、沉淀后蛋白質(zhì)的復(fù)溶性。結(jié)果表明,乙腈沉淀法操作簡便、易復(fù)溶,經(jīng)該方法提取的酪蛋白特征肽段響應(yīng)強度最高(圖4b)。孫姍姍等的研究[20]表明等電點沉淀法優(yōu)于有機溶劑沉淀法,乙腈沉淀法會使蛋白質(zhì)變性而降低復(fù)溶率。但等電點沉淀法需過夜處理,通量較低。本研究將乙腈沉淀法在低溫下進行,可在一定程度上保護蛋白質(zhì)不變性;提取沉淀過程僅需30 min,較等電點沉淀法表現(xiàn)出更好的提取效果,因此采用乙腈沉淀法提取駝乳中的酪蛋白。

酪蛋白有很強的形成大分子聚集體(即酪蛋白膠束)的傾向,超速離心得到的酪蛋白沉淀難以復(fù)溶[21]。復(fù)溶效率不僅影響定量結(jié)果,也關(guān)系到前處理操作的難易程度與實驗時間。高濃度尿素溶液和高pH值條件有利于酪蛋白膠束解離[22]。本研究比較了pH=8.0±0.1的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液、含6 mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液、50 mmol/L NH4HCO3緩沖液、含6 mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3緩沖液對酪蛋白沉淀后復(fù)溶回收率的影響,結(jié)果如圖4c所示。在相同的pH下,與緩沖液中不加入尿素相比,緩沖液中加入尿素能夠提高復(fù)溶率,可能是由于尿素作為蛋白質(zhì)變性劑提高了蛋白的溶解性。最終選擇含6 mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3緩沖液作為復(fù)溶液。

圖 3 22個特征肽段的提取離子流色譜圖Fig. 3 Extracted ion chromatograms of the 22 biomarker peptides

圖 4 不同前處理方法對4種肽段響應(yīng)強度的影響(n=3)Fig. 4 Effects of different pretreatments on the intensities of the four peptides (n=3) a. degreasing treatment; b. different protein precipitation methods; c. different re-dissolving buffer solutions.

2.4 特異性驗證

雖然所篩選的各物種特征肽段均經(jīng)過BLAST搜索確定在數(shù)據(jù)庫中具有特異性,但是某些物種的數(shù)據(jù)庫存在不完善的情況[23];另外,親緣物種蛋白質(zhì)序列同源性較高,在胰蛋白酶酶切過程中會出現(xiàn)錯切或漏切等現(xiàn)象;以上因素都可能造成特征肽段在其他物種中出現(xiàn)干擾。

為確保所選肽段的特異性,本工作首先考察了駱駝奶特征肽段在牛奶、水牛奶、牦牛奶、山羊奶、綿羊奶、驢奶和馬奶7個物種奶等質(zhì)量混合液中的檢出情況。檢測結(jié)果如圖5a所示,駱駝的4條特征肽段均未檢出。本工作還考察了其他7個物種特征肽段在駱駝奶中的檢出情況。結(jié)果如圖5b所示,7個物種的特征肽段在駱駝奶中均未檢出,其中檢測到了個別肽段的單個離子對的色譜峰,但保留時間和對應(yīng)肽段并不相同,為干擾離子峰,未出現(xiàn)保留時間和至少2個離子對相符合的情況。說明本工作中篩選出的特征肽段可以用于駱駝奶及其制品中的動物源性成分的測定。

圖 5 肽段特異性考察的提取離子流色譜圖Fig. 5 Extracted ion chromatograms for investigation of peptide specificity a. camel biomarker peptides in the mixture of cow, bubalus, mutus, goat, sheep, donkey, horse milk; b. cow, bubalus, mutus, goat, sheep, donkey and horse biomarker peptides in a camel milk sample.

2.5 摻假標準曲線的繪制

牛奶和山羊奶作為國內(nèi)較普遍的兩種奶源,其乳品成本相對較低,通常被摻入駱駝奶中以牟取經(jīng)濟利益,因此本工作對駱駝奶及奶粉進行了摻假定量研究。

向駱駝奶中摻入0、2.5%、5%、10%、25%、50%、75%、100%(質(zhì)量分數(shù))的牛奶或山羊奶,向駱駝奶粉中摻入上述相同質(zhì)量分數(shù)的牛奶粉或山羊奶粉。以測量的每個混合樣品中?；蛏窖虻奶卣麟亩蔚姆迕娣e為縱坐標,以添加的摻假物的質(zhì)量分數(shù)為橫坐標,繪制摻假定量標準曲線。如表2所示,摻假的標準曲線具有良好的線性,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。以3倍和10倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),最終確定駱駝奶中牛奶和山羊奶的摻假檢出限分別為0.35%和0.49%,摻假定量限分別為1.20%和1.69%;駱駝奶粉中牛奶粉和山羊奶粉的摻假檢出限分別為0.68%和0.73%,摻假定量限分別為1.65%和2.45%,見表2。

表2 駱駝奶(粉)中摻入牛奶(粉)/山羊奶(粉)的定量肽段的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

表3 11種市售樣品的檢測結(jié)果

在駱駝奶中分別添加質(zhì)量分數(shù)為2.5%、5%和25%的牛奶和山羊奶,在駱駝奶粉中中分別添加質(zhì)量分數(shù)為2.5%、5%和25%的牛奶粉和山羊奶粉,采用標準曲線定量計算加標回收率。定量肽段的平均回收率范圍為85.8%～106.9%,日內(nèi)精密度≤8.4%,日間精密度≤11.7%(n=3)。

2.6 摻假驗證及實際樣品檢測

為考察摻假定量方法的準確性,本工作分別驗證了將駱駝奶、牛奶、山羊奶,以及駱駝奶粉、牛奶粉、山羊奶粉均按照質(zhì)量比1∶1∶1的比例分別混合后的定量檢測結(jié)果。以家牛的特征肽段SPAQILQWQVLSNTVPAK(990.52+→315.2+)和山羊的特征肽段FPQYLQYPYQGPIVLNPWDQVK(898.52+→772.4+)為靶標進行檢測。結(jié)果表明,液態(tài)奶混合樣品中駱駝奶、牛奶和山羊奶的定量檢測結(jié)果分別為38.7%、31.0%、30.3%;奶粉混合樣品中駱駝奶粉、牛奶粉和山羊奶粉的定量檢測結(jié)果分別為36.3%、32.2%、31.5%。液態(tài)奶和奶粉的摻雜檢測結(jié)果均與理論值接近。因此,該方法可以為駱駝奶及奶粉摻假檢測提供一定的技術(shù)支持。

本工作選擇11個市售樣品進行了實際樣品的檢測分析,其中包括5個駝乳及6個駝乳粉。測定結(jié)果表明,有10個樣品僅檢測出駱駝特征肽段,而1個駝奶粉樣品中不僅檢出了駱駝的特征肽段,還檢出了家牛的特征肽段。經(jīng)核對其配料表,發(fā)現(xiàn)這款奶粉含有全脂乳粉,但未標注其來源。因此,推斷家牛的特征肽段來源于全脂乳粉。該實驗也表明了建立該鑒別方法的必要性和現(xiàn)實意義。

3 結(jié)論

本研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),將UHPLC-Q/Exactive-HRMS和UHPLC-QqQ-MS/MS相結(jié)合,共篩選出8個物種的22條特征肽段。基于此,建立了以特征肽為分析對象的駱駝奶/奶粉的摻假鑒別和定量測定方法,并對11個實際樣品進行檢測,以確保標簽的真實性。所開發(fā)的方法,具有高靈敏、高通量和可重復(fù)性等優(yōu)點,有望為駱駝乳及其制品摻假檢測提供一種有力的技術(shù)平臺。