宋菲,李晨,閆子茹,張娜,田洪濤,4,5*

1(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,河北 保定,071000)2(邢臺(tái)學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北 邢臺(tái),054001) 3(保定學(xué)院 生物化工與環(huán)境工程學(xué)院,河北 保定,071000)4(河北省益生功能性乳制品技術(shù)創(chuàng)新中心, 河北 保定,071000)5(國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心,河北 保定,071000)

馬鈴薯作為一種糧、菜、飼和工業(yè)原料兼用型經(jīng)濟(jì)作物[1],不僅產(chǎn)量高栽培適應(yīng)性廣,而且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[2-3]。在收獲、貯藏、運(yùn)輸和銷售過程中,機(jī)械損傷、溫度、濕度和光照等因素會(huì)導(dǎo)致塊莖中糖苷生物堿(glycoalkaloids, GAs)的含量急劇上升[4-5]。GAs是茄科和百合科植物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,又名龍葵素。馬鈴薯中GAs主要成分為α-茄堿和α-卡茄堿,其均以茄啶作為苷元并連接一個(gè)三糖側(cè)鏈(圖1)。GAs對(duì)所有的哺乳動(dòng)物都有毒性,且人類對(duì)GAs的毒性更加敏感[6]。在我國(guó),由于馬鈴薯中GAs含量上升而造成的產(chǎn)業(yè)損失高達(dá)15%～20%。這嚴(yán)重制約著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和糧食安全。因此,降低馬鈴薯塊莖中GAs的含量,減少馬鈴薯產(chǎn)業(yè)損失顯得尤為重要。

圖1 α-茄堿和α-卡茄堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The structures of α-solanine and α-solanine

截止目前的實(shí)際生產(chǎn)中,沒有專用試劑用于抑制馬鈴薯塊莖產(chǎn)生GAs。通過施用氯苯胺靈(chlorpropham,CIPC)在抑制發(fā)芽的同時(shí)抑制塊莖中產(chǎn)生GAs。但CIPC在安全性上存在一定風(fēng)險(xiǎn),歐盟自2019年起已禁止使用CIPC。物理方法(控制溫濕度、CO2濃度以及避光)也是控制馬鈴薯GAs含量的手段。但是此方法會(huì)增加成本,尤其在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)。在運(yùn)輸和銷售過程中難以控制儲(chǔ)存條件。通過基因改造進(jìn)行馬鈴薯育種,必須在降低塊莖中GAs含量的同時(shí)維持植株其他器官中GAs的水平,從而保持整個(gè)植株的抗性,導(dǎo)致基因改造育種周期長(zhǎng)、降毒率不高。因此,亟需尋找新的高效安全的解毒技術(shù)。

生物降解是利用微生物或其產(chǎn)物來降解食品中的污染物,包括外源污染物和內(nèi)源毒素。微生物可以在生長(zhǎng)過程中將有毒的污染物轉(zhuǎn)化為無毒化合物。到目前為止,已經(jīng)開發(fā)出許多微生物來降解食品中的污染物。有研究表明,紅串紅球菌[7]、結(jié)合分枝桿菌[8]和嗜麥芽窄食單胞菌[9]可以降解黃曲霉毒素B1。乳酸菌[10]、枯草芽孢桿菌[11]和小片球菌[12]可降解葡萄及其制品中的赭曲霉毒素。微生物降解以其代謝多樣性,降解產(chǎn)物對(duì)食品和環(huán)境沒有二次污染等優(yōu)點(diǎn)成為有效去除食品毒素污染物的首選技術(shù)。

本研究從發(fā)芽綠化的馬鈴薯塊莖中分離篩選高效降解馬鈴薯GAs的菌株,通過16S rDNA測(cè)序結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化試驗(yàn)進(jìn)行菌株鑒定,評(píng)價(jià)其安全性并探究其降解特性和降解產(chǎn)物,以期得到馬鈴薯GAs高效降解菌,為開發(fā)馬鈴薯GAs的生物降解技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)及技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料

馬鈴薯塊莖購自河北省保定市蓮池區(qū)人人樂超市。

1.1.2 試劑與儀器

α-茄堿、α-卡茄堿,上海源葉生物科技有限公司;乙腈、甲醇,均為色譜純,德國(guó)Merck公司;PCR試劑盒,北京博邁德基因技術(shù)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司;藥敏試劑盒,杭州濱和微生物試劑有限公司。

1260高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;PCR儀,美國(guó)Bio-Rad公司;YXQ-SG46-280S型蒸汽滅菌器,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SHP-250型生化培養(yǎng)箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10、牛肉膏3、NaCl 5,調(diào)節(jié)pH 至7.5;固體培養(yǎng)基添加瓊脂15 g;121 ℃高壓滅菌20 min。

無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(g/L):NaCl 1、KH2PO40.5、K2HPO41.5、(NH4)2SO42、MgSO40.2,調(diào)節(jié)pH至7.0,121 ℃滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基:在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加α-茄堿或α-卡茄堿至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 馬鈴薯塊莖內(nèi)生菌的分離

參考葉文雨等[13]的方法對(duì)馬鈴薯塊莖進(jìn)行表面消毒。選取綠皮、發(fā)芽處塊莖和芽進(jìn)行研磨,加入1 mL無菌水,取100 μL涂布于LB培養(yǎng)基平板,置于30 ℃培養(yǎng)箱中。

1.2.2 GAs降解菌株的篩選

將分離的內(nèi)生菌接種至篩選固體培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)72 h。挑取菌體分別接種至篩選液體培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)72 h。以不接菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照,培養(yǎng)條件同上。參照HENNESSY等[14]的方法并加以改進(jìn)建立薄層色譜法(thin-layer chromatography,TLC)檢測(cè)方法:將10 μL培養(yǎng)液點(diǎn)樣于GF254硅膠板上,以正丁醇∶乙醇∶水(2∶1∶1,體積比)為流動(dòng)劑,顯影液為50%硫酸,顯影時(shí)間5 min。將初篩到的菌株按上述方法培養(yǎng),使用HPLC檢測(cè)α-茄堿和α-卡茄堿的含量。HPLC檢測(cè)條件:色譜柱,Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×250 mm,5 μm);柱溫40 ℃;檢測(cè)器VWD;流動(dòng)相,V(0.01 mol/L磷酸鹽,pH 7.6)∶V(乙腈)=40∶60;進(jìn)樣量10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。降解效率按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中:C,對(duì)照組中GAs含量,μg/mL;T,試驗(yàn)組中GAs含量,μg/mL。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 菌落及細(xì)胞形態(tài)觀察

將篩選得到的GAs降解菌株劃接種于LB固體培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)特征,并用革蘭氏染色法和孔雀綠染色法進(jìn)行細(xì)胞染色觀察。

1.2.3.2 生理生化試驗(yàn)

菌株的生理生化試驗(yàn)參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.3 16S rDNA鑒定

利用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)法[16]提取菌株的基因組DNA。以基因組DNA為模板,參照葉文雨等[13]的方法,采用通用引物27F/1492R進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NBCI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)上進(jìn)行BLAST對(duì)比。使用MEGA-X軟件,Neighbor-joining方法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.2.4 安全性評(píng)價(jià)

1.2.4.1 藥敏試驗(yàn)

以劃線的方式將待測(cè)菌液涂布到LB固體培養(yǎng)基中。用無菌鑷子取藥敏片貼于培養(yǎng)基表面。30 ℃培養(yǎng)24 h后,觀察抑菌圈。

1.2.4.2 質(zhì)粒提取

按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取,并以1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4.3 有害代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]中的方法,檢測(cè)降解菌株的硝基還原酶、氨基脫羧酶活性、吲哚檢測(cè)。

1.2.4.4 溶血活性檢測(cè)

將菌液涂布于血瓊脂培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)24 h后,觀察溶血圈,金黃色葡萄球菌ATCC 25923作為陽性對(duì)照。

1.2.5 降解特性測(cè)定

挑取菌株C11的單菌落,接種于LB液體培養(yǎng)基,30 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至OD600值為1.0獲得種子培養(yǎng)液。將菌株C11種子液以1%接種量分別接種于含α-茄堿或α-卡茄堿(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中,分別檢測(cè)不同溫度(20、25、30、35、40 ℃)、pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、時(shí)間(1、3、5、7 d)、GAs初始質(zhì)量濃度(12.5、25、50、75、100 μg/mL)、接種量(1%、5%、10%)和金屬離子(Mn2+、Al3+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Zn2+,0.1 mmol/L)對(duì)降解率的影響。

1.2.6 降解活性成分測(cè)定

菌株C11培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后,根據(jù)LEI等[17]的方法分離胞外培養(yǎng)液、胞內(nèi)提取物和微生物細(xì)胞。將α-茄堿和α-卡茄堿(終質(zhì)量濃度50 μg/mL)添加到菌株C11全細(xì)菌培養(yǎng)物和各組分中,30 ℃孵育72 h,測(cè)定GAs含量。

1.2.7 降解產(chǎn)物測(cè)定

將菌株C11分別接種到含有α-茄堿或α-卡茄堿(50 μg/mL)的 LB 液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)72 h。取 1 mL培養(yǎng)液,加入1 mL體積分?jǐn)?shù)10%的乙酸,混合均勻后12 000×g離心15 min,取上清液。上清液經(jīng)過有機(jī)濾膜(0.22 μm)過濾后,參照鄭旭等[18]的方法通過液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-ion trap-time of flight mass spectrometry,LC-IT-TOF-MS)檢測(cè)降解產(chǎn)物。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,GraphPad Prism 7作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GAs降解菌株的分離篩選

通過TLC檢測(cè)到一株可同時(shí)降解α-茄堿和α-卡茄堿的菌株C11,結(jié)果見圖2。α-茄堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=4.346x+46.93,R2=0.997 2, α-卡茄堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=4.051x+32.05,R2=0.998 8, 兩者R2均大于0.99,滿足檢測(cè)要求。HPLC檢測(cè)菌株C11對(duì)α-茄堿和α-卡茄堿降解率分別為(71±2.0)%和(72.3±1.6)%,具有較好的GAs降解效果。

a-α-茄堿;b-α-卡茄堿圖2 TLC檢測(cè)GAsFig.2 Detection of GAs by TLC

2.2 GAs降解菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征

菌株C11的形態(tài)學(xué)特征見圖3。C11菌落白色、不透明、菌落大,邊緣褶皺表面光滑。菌株C11為革蘭氏陽性菌,菌體呈桿狀,且具有芽孢。

a-菌落形態(tài);b-革蘭氏染色;c-孔雀石綠染色圖3 菌株C11的形態(tài)學(xué)特征Fig.3 Morphological characteristics of strain C11

2.2.2 生理生化試驗(yàn)

表1顯示降解菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果。菌株C11的V.P.試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)和硝酸鹽還原為陰性,接觸酶和明膠液化為陽性,該菌株能利用淀粉、半乳糖、葡萄糖和山梨醇,不能利用木糖醇,不能水解酪蛋白,苯丙氨酸脫氨酶反應(yīng)陰性,不脫氨。

表1 降解菌的生理生化測(cè)定Table 1 Physiological and biochemical features of degrading strain

2.2.3 16S rDNA鑒定

將菌株C11的16S rDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI-BLAST進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖4。經(jīng)同源性分析,菌株C11為芽孢桿菌屬。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示,菌株C11與Bacillusvelezensis遺傳相對(duì)距離最近,同源性上最近。結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征和生理生化鑒定,菌株C11可確定為貝萊斯芽孢桿菌,命名為BacillusvelezensisC11。

圖4 基于16S rDNA序列的菌株C11系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain C11 based on 16S rDNA sequencing

2.3 安全性評(píng)價(jià)

2.3.1 藥敏試驗(yàn)

菌株C11對(duì)?？股孛舾行詼y(cè)定結(jié)果見表2。菌株C11對(duì)頭孢他啶、乙酰螺旋霉素、阿奇霉素、麥迪霉素和四環(huán)素具有抗性。

表2 降解菌對(duì)常見抗生素的敏感性Table 2 Sensitivity of degrading strain C11 to common antibiotics

續(xù)表2

2.3.2 質(zhì)粒檢測(cè)

對(duì)菌株C11進(jìn)行質(zhì)粒提取,結(jié)果顯示菌株C11中不含有質(zhì)粒(圖5)。

M-DNA marker;1-含有質(zhì)粒的芽孢桿菌菌株;2-菌株C11圖5 菌株C11質(zhì)粒提取電泳圖Fig.5 Plasmid extraction electrophoresis of strains C11

2.3.3 有害代謝產(chǎn)物檢測(cè)

菌株C11的有害代謝產(chǎn)物的測(cè)定結(jié)果見表3,硝基還原酶和氨基酸脫羧酶活性為陰性,吲哚試驗(yàn)結(jié)果為陰性,表明菌株C11不產(chǎn)生亞硝酸鹽、生物胺和吲哚。

表3 菌株C11的有害代謝產(chǎn)物檢測(cè)Table 3 Detection of harmful metabolites of strain C11

2.3.4 溶血試驗(yàn)

菌株C11的溶血試驗(yàn)結(jié)果見圖6。陽性對(duì)照菌株金黃葡萄球菌ATCC 25923周圍出現(xiàn)溶血圈,表明實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確。菌株C11的菌落周圍沒有觀察到溶血圈,表明菌株C11沒有溶血活性。

a-菌株C11;b-ATCC 25923圖6 菌株溶血試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Hemolysis test results of strains

2.4 降解特性測(cè)定

菌株C11對(duì)GAs的降解特性見圖7。菌株C11在30 ℃時(shí)降解率達(dá)到最大,對(duì)α-茄堿和α-卡茄堿的降解率分別為79.84%和80.36%。并且菌株在20～35 ℃對(duì)GAs的降解率均大于50%。因此,30 ℃是菌株C11對(duì)GAs的最適降解溫度,同時(shí)菌株C11在20～40 ℃均能有效降解GAs。

菌株C11在pH為6.0時(shí),對(duì)GAs的降解率最高。在pH 5.0～8.0的范圍內(nèi)菌株C11對(duì)GAs的降解率在60%以上。因此菌株C11對(duì)GAs的最適降解pH為6.0,并且在較寬的pH范圍內(nèi)有效降解GAs。

隨著時(shí)間的增加,菌株C11對(duì)GAs的降解率逐漸增加,在5 d后對(duì)GAs的降解率達(dá)到90%以上。隨著GAs濃度的升高,菌株C11的降解作用有所下降,但降解率均在65%以上。 結(jié)果表明,菌株C11能夠耐受并降解高濃度的GAs。菌株C11的接種量對(duì)GAs的降解率沒有顯著影響。1 mmol/L的Cu2+對(duì)菌株C11降解GAs有抑制作用,Mn2+對(duì)菌株C11降解GAs有激活作用。

a-溫度;b-pH;c-培養(yǎng)時(shí)間;d-GAs初始濃度;e-接種量;f-金屬離子圖7 菌株C11對(duì)GAs的降解特性Fig.7 Degradation characteristics of GAs by strain C11

2.5 降解GAs的活性成分測(cè)定

將菌株C11的全細(xì)菌培養(yǎng)物與各種組分的GAs降解率進(jìn)行比較(圖8),全細(xì)菌培養(yǎng)液的降解率最高為79.81%(α-茄堿)和81.78%(α-卡茄堿),使用微生物細(xì)胞降解率為67.52%(α-茄堿)和59.75%(α-卡茄堿),使用胞內(nèi)提取物降解率為50.56%(α-茄堿)和46.37%(α-卡茄堿),使用胞外培養(yǎng)液降解率為4.96%(α-茄堿)和8.24%(α-卡茄堿)。結(jié)果表明降解GAs的活性成分位于細(xì)胞內(nèi)。

2.6 降解產(chǎn)物的測(cè)定

LC-IT-TOF-MS對(duì)LB液體培養(yǎng)基中GAs的代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖9所示。碎片的質(zhì)荷比(m/z)由陽離子模式質(zhì)譜掃描獲取,結(jié)合降解產(chǎn)物性質(zhì),α-茄堿和α-卡茄堿的降解產(chǎn)物可能有茄啶(圖9-c和圖9-d)和膽固醇(圖9-e和圖9-f)。

圖8 菌株C11不同組分對(duì)GAs的降解率Fig.8 Degradation rate of GAs by different compositions of strain C11

a-對(duì)照組α-茄堿和α-卡茄堿的液相色譜;b-菌株C11降解α-茄堿和α-卡茄堿的液相色譜; c、e-菌株C11降解α-茄堿代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜;d、f-菌株C11降解α-卡茄堿代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜圖9 菌株C11 降解GAs的代謝產(chǎn)物Fig.9 Metabolites of GAs by strain C11 degrading

3 結(jié)論與討論

本研究從發(fā)芽和綠化馬鈴薯塊莖中篩選得到GAs降解菌株C11,經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。菌株C11可以制備為菌劑,在馬鈴薯收獲后施用于其表面以期在貯藏期間降低GAs含量。菌株C11為芽孢桿菌,形成的孢子能夠在各種土壤和植物環(huán)境中定殖并且在環(huán)境中保持更長(zhǎng)的時(shí)間,也是芽孢桿菌用于制備菌劑的優(yōu)勢(shì)。由于這一特性,菌株C11能夠在馬鈴薯塊莖中長(zhǎng)時(shí)間定殖,從而獲得更為持久的GAs降解能力。

對(duì)菌株C11進(jìn)行體外安全性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn),雖然菌株C11對(duì)部分抗生素有抗性,但是不含有質(zhì)粒,因此不存在耐藥因子轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí),菌株C11不具有溶血性,不產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物,綜上,可判定菌株C11具有一定的安全性。后續(xù)可通過動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)菌株C11的安全性。貝萊斯芽孢桿菌是常見的生防菌,對(duì)多種病原菌均具有良好的抑制作用[19-20]。

菌株C11對(duì)GAs的最適降解條件為30 ℃、pH 6.0。菌株C11培養(yǎng)5 d即可對(duì)GAs的降解率達(dá)到90%以上。并且菌株C11具有良好的環(huán)境適應(yīng)性,以及能夠耐受并降解高濃度的GAs。三糖側(cè)鏈的性質(zhì)強(qiáng)烈影響GAs的毒性。菌株C11在細(xì)胞內(nèi)可能通過脫糖基化去除三糖側(cè)鏈,生成茄啶,后者可能代謝為膽固醇,再被微生物代謝利用,從而達(dá)到解毒的效果。菌株C11將茄啶代謝為膽固醇過程中是否存在中間代謝產(chǎn)物還需進(jìn)一步確定。這些結(jié)果表明菌株C11是一株具有較高潛力的GAs降解菌株。

本研究從發(fā)芽綠化馬鈴薯塊莖中分離篩選得到一株馬鈴薯GAs高效降解菌,經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌C11,體外安全性試驗(yàn)表明菌株C11具備一定的安全性。菌株C11具有良好的環(huán)境適應(yīng)性和GAs耐受性,在較大的溫度和pH值范圍內(nèi)以及在短時(shí)間內(nèi)有效降解GAs。菌株C11可能在細(xì)胞內(nèi)將GAs降解為膽固醇后進(jìn)一步代謝利用。本研究為開發(fā)綠色安全的馬鈴薯GAs生物降解技術(shù)從而確保食品安全提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。