王則徐,周文菊,陳正行,張鑫,杜艷,涂兆鑫,李娟,4*

1(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122)2(青海華實科技投資管理有限公司, 青海 西寧,810016)3(青海華實青稞生物科技開發(fā)有限公司,青海 西寧,810016)4(江蘇省生物活性制品 加工工程技術(shù)研究中心,江蘇 無錫,214122)

青稞是我國青藏高原地區(qū)特有的傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)作物,因其有高β-葡聚糖、高纖維、高蛋白、低血糖生成指數(shù)和低熱量等特點(diǎn),符合現(xiàn)代消費(fèi)者所需的膳食結(jié)構(gòu),引起了國內(nèi)外研究者廣泛的關(guān)注[1]。淀粉是人體主要的能源物質(zhì),青稞中含有60%～80%的淀粉。根據(jù)淀粉消化性能和生物可利用性,將其分為易消化淀粉(rapidly digestible starch,RDS)、慢消化淀粉(lowly digestible starch,SDS)和抗性淀粉(resistant starch,RS)[2]。研究表明,抗性淀粉在對人體控制血糖、降低血脂、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等方面具有明顯功效。

抗性淀粉又稱抗酶解淀粉,具有類似于膳食纖維的生理功能,對糖尿病、心腦血管疾病等具有較好的預(yù)防作用。大量文獻(xiàn)資料顯示,常見的抗性淀粉多由小麥淀粉、玉米淀粉等制備。青稞中淀粉含量較高,是制備抗性淀粉的理想原料。然而,應(yīng)用青稞淀粉(highland barley starch,HBS)制備抗性淀粉方面的研究相對較少。壓熱冷卻法(hydrothermal cooling cycle method,HC)和酶解脫支法(enzymatic branching method,EB)是常用的抗性淀粉制備方法。其中HC處理的HBS經(jīng)高溫高壓處理后顆粒結(jié)構(gòu)塌陷,冷卻過程中淀粉分子重結(jié)晶,呈現(xiàn)不規(guī)則的塊狀,形成抗酶解耐熱結(jié)構(gòu)[3],而EB處理則用酶降解淀粉分子,使淀粉分子的聚合度和直鏈A支鏈淀粉的比例達(dá)到適合形成RS的程度,進(jìn)而促進(jìn)RS的形成[4]。但這2種方法所得抗性淀粉含量不高(HC處理的RS含量在8%左右[3],EB處理的RS含量在10%左右)。研究表明,多種制備方法聯(lián)合處理淀粉是一種有效提高抗性淀粉含量的方法。濕熱法(damp heat method,DH)是一種在低濕度條件下對淀粉進(jìn)行熱處理的方法,具有提高直鏈和支鏈淀粉相互作用和提高抗性淀粉含量的優(yōu)點(diǎn)。因此,以青稞淀粉為原料,采用HC-DH或EB-DH聯(lián)合處理方法以期望得到高抗性、高熱穩(wěn)定性和低消化性的青稞抗性淀粉(highland barley resistant starch,HBRS)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

昆侖14號黃青稞粉(100目),青海華實科技投資管理有限公司;D-葡萄糖(GOPOD法)檢測試劑盒,無錫浩正生物科技有限公司;淀粉葡萄糖苷酶(黑曲霉),上海泰坦科技股份有限公司;無水乙醇、NaOH、HCl溶液、Na2CO3(均為分析純),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-250型恒溫恒濕箱、HHS型數(shù)顯恒溫水浴鍋,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;GZX-9246 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;UV-3200型紫外分光光度計,上海美譜達(dá)儀器有限公司;D2 PHASER型X射線衍射儀,德國布魯克AXS公司;BCD-258 WDPM型冰箱,青島海爾股份有限公司;Thermo1510酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;SU8100 冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡,日本株式會社日立高新技術(shù);AX224ZH/E 型電子天平,奧豪斯儀器(常州)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 青稞淀粉提取

參考張慧娟等[5]的方法略有修改:稱取青稞粉300 g,加入1 500 mL 4 g/L的NaOH溶液浸泡2 h。然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性,離心(4 800×g,10 min)。舍棄上清液、上層黃色黏稠液體和暗黃色固體,用去離子水多次洗滌下層沉淀物,離心(4 800×g,10 min),舍棄上清液及上層黃色黏稠液體,保留下層白色固體沉淀。用無水乙醇洗滌沉淀2次,抽濾,置于平皿中自然干燥,即得HBS。

1.3.2 HBRS的制備

1.3.2.1 壓熱冷卻循環(huán)法和酶解脫支法制備HBRS

采用韓麗瑤等[6]的方法略有修改:稱取HBS 10 g,加入去離子水100 mL,攪拌均勻,在125 ℃條件下處理45 min,取出,冷卻至室溫,隨后于4 ℃冰箱中放置12 h,以上操作重復(fù)3次。將淀粉糊冷凍干燥,粉碎,過篩(100目),即得HC制備的HBRS。

稱取HBS 10 g,加入去離子水100 mL,攪拌均勻,在125 ℃條件下預(yù)糊化45 min,取出冷卻至55 ℃,用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.5,并在淀粉糊出現(xiàn)明顯凝膠時,加入6 U/g普魯蘭酶,于50 ℃環(huán)境中孵育6 h。將酶解后的淀粉糊在125 ℃壓熱處理45 min,隨后于4 ℃冰箱中放置24 h。將淀粉糊冷凍干燥,粉碎,過篩,即得EB制備的HBRS。

1.3.2.2 HC-DH和EB-DH聯(lián)合制備HBRS

稱取HC和DH制備的HBS各1 g,控制水分含量為30%,室溫放置過夜。在105 ℃烘箱密封放置2 h,取出,于50 ℃條件下干燥24 h。之后加水保持水分30%,重復(fù)2次之前操作。淀粉糊冷凍干燥,粉碎,過篩,即得HC-DH和EB-DH制備的HBRS。

1.3.3 淀粉的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

1.3.3.1 X-射線衍射及相對結(jié)晶度測定[7]

利用X-射線衍射儀(X-ray diffraction,XRD)對淀粉的結(jié)晶特性進(jìn)行表征。測試條件:衍射角范圍5°～35°,掃描速率2°/min,在40 kV和40 mA條件下進(jìn)行掃描。相對結(jié)晶度(relative crystallinity,RC)使用MDI-Jade 6.5軟件(Material Date,Inc.Livermore,California,USA)進(jìn)行分析。計算如公式(1)所示:

(1)

式中:RC,相對結(jié)晶度;Ac,淀粉結(jié)晶區(qū)面積;Aa,淀粉無定形區(qū)的面積。

1.3.3.2 傅立葉變換紅外光譜測定[8]

將HBS(HBRS)與適量KBr充分混合(1∶100),研磨后進(jìn)行壓片,然后置于傅立葉變換紅外光譜儀中檢測。掃描波數(shù)范圍及儀器分辨率分別為 400～4 000 cm-1和4 cm-1。

1.3.4 糊化特性

稱取HBS(HBRS)3 g,加入到裝有25 mL蒸餾水的樣品盒中并充分?jǐn)嚢?將樣品盒置于快速黏度分析儀樣品槽內(nèi),開始15 s以150 r/min攪拌,將淀粉溶液混勻。淀粉的糊化特性用黏度參數(shù)表示[9]。

1.3.5 HBS(HBRS)的顆粒形態(tài)觀察

HBS(HBRS)顆粒形態(tài)特征使用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。將HBS(HBRS)樣品平鋪于帶有導(dǎo)電膠帶的鋁制坩堝上并進(jìn)行真空噴金處理,樣品的顆粒形態(tài)特征在3.0 kV,5.00 μm條件下進(jìn)行觀察,圖像放大倍數(shù)為500×[10]。

1.3.6 淀粉消化特性

用改良后的Englyst方法[11]測試HBS(HBRS)的體外消化率。稱取100 mg HBS(HBRS),置于離心管中,糊化后加入玻璃珠,密封,將離心管于37 ℃恒溫振蕩,振蕩速率為120 r/min;加入4 mL新鮮配制的消化液并開始計時;分別在20和120 min吸取100 μL水解液,加入900 μL無水乙醇滅活消化酶;離心(8 000×g,2 min),收集上清液,利用3 mL葡萄糖氧化酶試劑盒(GOPOD)測定上清液中的葡萄糖含量。20 min內(nèi)消化的淀粉部分為RDS, 20～120 min內(nèi)消化的淀粉部分為SDS,120 min內(nèi)未消化的淀粉部分為RS。

1.3.7 淀粉功能特性

稱取HBS(HBRS)0.5 g,置于預(yù)先稱重的離心管中,加入去離子水6 mL,混勻,在30 ℃水浴中保持30 min,每10 min渦旋5 s。離心(3 000×g,15 min),上清液轉(zhuǎn)移到恒重的培養(yǎng)皿中,在105 ℃干燥4 h[12]。稱取沉淀物質(zhì)量,并根據(jù)公式(2)和公式(3)計算淀粉的持水性和水溶性。

(2)

(3)

式中:sp,持水性,%;m1,沉淀質(zhì)量,g;m2,樣品質(zhì)量,g;m3,被溶解樣品質(zhì)量,g;sw,水溶性,%。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個樣品至少平行測定3次,所有實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。運(yùn)用SPSS 18.0軟件(SPSS Incorporatd,Chicago)進(jìn)行方差分析,并利用Tukey方法分析數(shù)據(jù)的顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 淀粉的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

2.1.1 X-射線衍射及相對結(jié)晶度

由圖1可知,HBS在15.15°、17.15°、18.19°、23.23°均具有衍射峰,為A型結(jié)晶結(jié)構(gòu)。與HBS相比,EB制備的HBS在17°處衍射峰的強(qiáng)度有所上升,在18°處的衍射峰強(qiáng)度下降,有類似B型結(jié)晶結(jié)構(gòu)。HC、HC-DH和EB-DH制備的HBS衍射峰基本消失,淀粉無定形區(qū)增加,整條曲線接近饅頭峰,說明HC、HC-DH和EB-DH處理能破壞HBS的結(jié)晶結(jié)構(gòu)和雙螺旋結(jié)構(gòu)。HC處理對HBS結(jié)構(gòu)改變的原因主要是在高溫高壓的環(huán)境中HBS原有的晶體結(jié)構(gòu)被破壞。淀粉顆粒由有序的結(jié)晶區(qū)和無序的無定形區(qū)組成,其中結(jié)晶區(qū)主要由支鏈淀粉起到骨架作用,其直鏈分支和長短不同的游離直鏈分子平行排列,通過氫鍵作用形成大致有規(guī)則的束狀體即為微晶束[13]。EB制備過程中,HBS微晶區(qū)的支鏈分支被普魯蘭酶酶解切斷,支鏈淀粉的支撐作用減弱,大量短直鏈呈游離狀態(tài)分布于淀粉顆粒中,從而降低了RC。結(jié)晶度是表征淀粉顆粒結(jié)晶結(jié)構(gòu)的一個重要指標(biāo),其指標(biāo)會影響淀粉的理化性質(zhì)和應(yīng)用[14]。HBS經(jīng)HC和EB處理后,其RC從29.05%分別降低至12.85%(HC)和10.11%(EB)。經(jīng)過HC-DH和EB-DH處理后,RC進(jìn)一步顯著降低,分別為4.75%(HC-DH)和3.59%(EB-DH)。表明HBS經(jīng)過不同方式處理后,其晶體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定型結(jié)構(gòu),從多晶狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)。

圖1 不同制備方法對HBS X-射線衍射圖譜及 相對結(jié)晶度的影響Fig.1 Effect of different preparation methods on the HBS X-ray diffraction spectrum and its relative crystallinity

2.1.2 傅立葉變換紅外光譜

由圖2可知,與HBS相比,HC-DH和EB-DH制備的HBRS在3 400～3 100 cm-1處的吸收峰向低波數(shù)方向遷移,并形成了更寬和更深的吸收峰,表明HBRS中短直鏈淀粉鏈由于分子間和分子內(nèi)相關(guān)的復(fù)雜振動拉伸而產(chǎn)生更多氫鍵,使分子間的結(jié)構(gòu)變得更加緊密,影響了淀粉顆粒對淀粉酶作用的敏感性,阻礙了淀粉酶水解,降低了HBS的回生值[15]。淀粉分子的短程有序性可由紅外光譜中1 047/1 022 cm-1吸收峰的吸光度比值來表征[16]。其中1 047/1 022比值越大,表明顆粒內(nèi)短程有序度越高。由圖3可知,HC和EB處理后的青稞淀粉樣品的1 047/1 022吸光度比值顯著降低(P<0.05),而再經(jīng)過DH處理后1 047/1 022比值又有所減小,說明青稞淀粉經(jīng)過

圖2 不同制備方法對HBS紅外圖譜的影響Fig.2 Effect of different preparation methods on the infrared mapping of HBS

圖3 不同制備方法對HBS紅外光譜中1 047/1 022 cm-1 吸光度的比值的影響Fig.3 Effect of different preparation methods on the ratio of the absorbance of 1 047/1 022 cm-1 in the infrared spectrum of HBS

HC-DH和EB-DH處理后,樣品的雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋,結(jié)晶度降低,該結(jié)論與XRD所得結(jié)論一致。

2.2 RVA

峰值黏度與谷值黏度之差即衰減值則反映了HBS(HBRS)的熱糊穩(wěn)定性,衰減值越大,則其熱糊穩(wěn)定性就越差[17]。由表1可知,HBS衰減值為1 766 cP。經(jīng)HC和EB處理的HBRS的峰值黏度顯著降低(P<0.05)。再經(jīng)過HC-DH和EB-DH處理后HBRS的衰減值有極顯著減小(P<0.05)。表明HC-DH和EB-DH可顯著提高HBS的熱糊穩(wěn)定性。

表1 不同制備方法對HBS糊化特性的影響Table 1 Effect of different preparation methods on the gelatinization characteristics of HBS

糊化溫度反映了淀粉糊化的難易程度,糊化溫度越高,淀粉糊化越困難[18]。HBS經(jīng)過不同方式處理后,糊化溫度顯著降低(P<0.05),表明HC、EB、HC-DH和EB-DH處理均能明顯改善HBS的糊化性能。

圖4反映了不同處理方法對HBS糊化特性的影響,結(jié)合表1可以較為細(xì)致地得出HBS經(jīng)過HC或EB處理后其糊化性能得到較大改善,而HC-DH和EB-DH處理對HBS糊化性能改善效果更為突出。

圖4 不同制備方法對HBS糊化特性的影響Fig.4 Effect of different preparation methods on the gelatinization characteristics of HBS

2.3 淀粉的顆粒形態(tài)觀察

如圖5所示,HBS顆粒形態(tài)呈現(xiàn)球形或橢圓形且表面光滑,無明顯裂痕。HC處理后,青稞淀粉顆粒之間發(fā)生聚集且表面比較粗糙,呈現(xiàn)不規(guī)則的鱗片狀,幾乎沒有完整的淀粉顆粒形狀。其原因可能是在HC過程中,HBS大部分發(fā)生糊化,顆粒吸水膨脹,導(dǎo)致體積增大而后破裂,失去原有晶體結(jié)構(gòu)[19]。DH處理后的淀粉,其原本顆粒結(jié)構(gòu)和性質(zhì)消失,淀粉顆粒相互連結(jié),且體積明顯增大,表面凹凸不規(guī)則,淀粉顆粒也出現(xiàn)了粘結(jié)現(xiàn)象。HC-DH和EB-DH處理時,可能由于DH處理的高溫環(huán)境使其水分蒸發(fā)至顆粒表面,促使HBS顆粒相互黏連,顆粒變大。當(dāng)結(jié)束DH過程后,溫度的降低使顆粒表面形成塌陷,出現(xiàn)凹坑,表現(xiàn)出不同強(qiáng)度的固態(tài)連接,表觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化,形成不規(guī)則堆積結(jié)構(gòu),出現(xiàn)大量塊狀物[20]。這些結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生與上文中XRD和紅外得出的處理前后晶體結(jié)構(gòu)和結(jié)晶度產(chǎn)生變化相對應(yīng)。在一定程度上揭示了HBS(HBRS)樣品顆粒形態(tài)的變化與其消化性之間的關(guān)聯(lián)。

a-HBS;b-HC HBRS;c-EB HBRS;d-HC-DH HBRS; e-EB-DH HBRS圖5 不同制備方法對HBS微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of different preparation method on the microstructure of HBS

2.4 淀粉體外消化率

由表2可知,糊化HBS中RDS、SDS和RS含量分別為85.45%、9.73%和4.81%。經(jīng)過HC處理后,RDS含量顯著減少(P<0.05),SDS與RS含量均顯著增加(P<0.05)[21]。這是由于HC處理的本質(zhì)是高溫高壓產(chǎn)生的直鏈分子在回生過程中進(jìn)行了重結(jié)晶,形成致密的抗酶解結(jié)構(gòu),而EB處理則是普魯蘭酶作用于α-1,6糖苷鍵而產(chǎn)生更多的直鏈淀粉[22]。HC和EB處理后HBS的消化率變?nèi)?。HC和EB與DH聯(lián)合處理可以降解淀粉分子,部分破壞原存在于天然淀粉中的螺旋、結(jié)晶和層狀結(jié)構(gòu)。DH處理后的HBS具有更高的抗酶水解性(RS增加)[23]。HC-DH和EB-DH處理可以在多個尺度上改變結(jié)構(gòu)來有效調(diào)節(jié)HBRS的消化率[24],并最終將部分RDS/SDS轉(zhuǎn)化為RS,HC-DH和EB-DH后,RDS和SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著減少,而與此同時RS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅提高。根據(jù)以上結(jié)果,可以得出HC-DH和EB-DH處理過程中的水熱效應(yīng)/酶作用會導(dǎo)致淀粉層次結(jié)構(gòu)被破壞,從而改變HBS(HBRS)消化和糊化特性,進(jìn)而在消化過程中表現(xiàn)出較高的抗酶水解能力和在糊化過程中顯示出較高的耐水熱效應(yīng)能力。

表2 糊化HBS(HBRS)體外消化率 單位:%

2.5 淀粉功能特性

如表3所示,HBS經(jīng)過HC、EB、HC-DH或EB-DH處理后,持水性顯著增加(P<0.05),可能是由于HC或EB處理使HBS結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞,并促進(jìn)淀粉和水之間的氫鍵相互作用,從而增加吸水指數(shù)[25]。HC-DH制備的HBRS的持水性略微增加,EB-DH處理的HBRS持水性有所減小,但均顯著高于HBS(P<0.05)。HBS的水溶性指數(shù)最低(0.42%),HC制備的HBRS水溶性指數(shù)最高(11.86%)。水溶性指數(shù)通常用作確定淀粉成分破壞程度的指標(biāo)。經(jīng)改性后HBS水溶性指標(biāo)明顯提高,表明HBS結(jié)構(gòu)在水熱效應(yīng)下進(jìn)一步被破壞。

表3 HBS(HBRS)持水性和水溶性 單位:%

3 結(jié)論

抗性淀粉在小腸中不被吸收和酶解,但能在大腸中被腸道菌群發(fā)酵,生成短鏈脂肪酸,因此具有調(diào)節(jié)血糖水平和改善腸道環(huán)境作用。本文從結(jié)構(gòu)和消化性等角度出發(fā)對HC或EB制備的抗性淀粉及HC-DH或EB-DH聯(lián)合制備的抗性淀粉改善機(jī)制進(jìn)行分析得出:HC-DH和EB-DH處理使HBS的相對結(jié)晶度減小,淀粉顆粒破裂,短程有序性、消化率和糊化溫度降低,糊化特性得到調(diào)節(jié)。此外,與HC和EB相比,聯(lián)合處理成功地提高了HBS的抗性淀粉含量。XRD與紅外結(jié)果表明了不同處理方法對HBS(HBRS)結(jié)構(gòu)方面的改變,其中HC-DH和EB-DH對HBS產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)破壞尤其明顯?？梢缘贸鯤BS經(jīng)過聯(lián)合處理后,其晶體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定型結(jié)構(gòu),從多晶狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)?？赡苷怯捎谠据^穩(wěn)定的晶體結(jié)構(gòu)被破壞和新結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生,從而使HC-DH和EB-DH處理后得到的HBRS對淀粉酶敏感性降低和更高的抗性淀粉含量。糊化特性和功能特性研究結(jié)果也佐證了HC-DH和EB-DH處理比單一的HC和EB處理能得到更優(yōu)質(zhì)的HBRS。本文的研究結(jié)果有助于我們從結(jié)構(gòu)的角度,通過與HC和EB對比更好地理解HC-DH和EB-DH處理的方法對HBS消化率、糊化特性和功能特性的影響,為后續(xù)更深入研究制備方法對HBRS構(gòu)效關(guān)系的影響、制備更優(yōu)質(zhì)的HBRS奠定基礎(chǔ)。