柳天一,張越,王靚,張宏建,張建華,陳旭升*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)

小白鏈霉菌(Streptomycesalbulus)是日本學(xué)者SHIMA和SAKAI于1977年從土壤中分離得到的[1]。目前,它主要作為ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)的工業(yè)生產(chǎn)菌被廣泛研究。ε-PL是由25～35個L-賴氨酸單體,在非核糖體肽合成酶催化作用下以α—COOH和ε—NH2縮合方式形成的一種天然抗菌肽,對革蘭氏陽性(G+)和革蘭氏陰性(G-)細(xì)菌、酵母、霉菌和病毒均具有很好的抑制作用[2-3]。目前,它作為一種天然食品防腐劑在日本、韓國、美國和中國等國家的食品工業(yè)中獲得應(yīng)用[4]。由于ε-PL能夠與乳酸鏈球菌素和納他霉素等天然食品防腐劑在抑菌譜、應(yīng)用范圍和產(chǎn)品特性上形成有效互補,故被認(rèn)為是推動天然食品防腐劑替代化學(xué)食品防腐劑的關(guān)鍵品種。

維持發(fā)酵環(huán)境pH值處于4.0左右是實現(xiàn)S.albulus大量積累ε-PL的重要前提。主要有兩方面原因:一是低pH條件能夠限制S.albulus的菌體生長而大量積累ATP,從而滿足ε-PL合成酶催化起始對ATP濃度的要求,以實現(xiàn)ε-PL合成順利啟動[5];二是低pH條件能夠抑制ε-PL降解酶活性,防止已積累的ε-PL被分解[6]。因此,對S.albulus發(fā)酵過程pH值進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控成為提高ε-PL產(chǎn)量的有效途徑。例如,KAHAR等[7]建立了分階段pH調(diào)控策略(pH 6.5→4.0),實現(xiàn)S.albulusS410的ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到48.3 g/L;CHEN等[8]開發(fā)了兩階段pH發(fā)酵工藝(pH 3.5→3.8),實現(xiàn)S.albulusM-Z18的ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到30.11 g/L;REN等[9]創(chuàng)建了pH沖擊策略(pH 6.0→3.0→3.8)使得S.albulusM-Z18的ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量提升至54.7 g/L。鄧玥等[10]提出了動態(tài)pH值調(diào)控策略(pH 5.5→3.0→3.8～4.2),實現(xiàn)S.albulusGS114的ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到60.2 g/L。然而,S.albulus的菌體生長最適pH值為6.0左右,由此形成ε-PL合成階段的酸性環(huán)境對小白鏈霉菌生長產(chǎn)生了低pH脅迫。王開方等[11]的研究發(fā)現(xiàn),S.albulusM-Z18在pH 2.5條件下,24 h內(nèi)菌體存活率降低80%以上;吳夢萍[12]也發(fā)現(xiàn)S.albulusWG-608在pH 3.6條件下,菌體干重和平均比生長速率較pH 4.3均有顯著下降。已有的研究表明,微生物處于酸脅迫條件下,往往會引起胞內(nèi)微環(huán)境變化,造成關(guān)鍵酶活力的降低、細(xì)胞膜和胞內(nèi)大分子的結(jié)構(gòu)變化,最終引起細(xì)胞凋亡[13]。因此,提高S.albulus的低pH耐受能力以減少低pH對S.albulus造成的損傷可能是提高其ε-PL合成能力的一種有效方法。

適應(yīng)性實驗室進(jìn)化(adaptive laboratory evolution,ALE)是在特定條件下對微生物進(jìn)行培養(yǎng),促使菌株完成適應(yīng)性自進(jìn)化,最后通過篩選獲得有益突變的方法[14]。該方法在改善微生物耐酸性能方面具有強大功效與廣泛應(yīng)用。例如,NARAYANAN等[15]利用ALE技術(shù)對S.cerevisiaeTMB3500菌株在低pH的培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng),顯著提高了釀酒酵母菌株在pH 5.0和pH 4.5時的生長性能。SHUI等[16]在適應(yīng)性進(jìn)化過程中通過逐漸增加乙酸的濃度,成功在7 g/L乙酸條件下使適應(yīng)性進(jìn)化菌株的細(xì)胞密度比出發(fā)菌株提高0.35～2.64。任喜東等[17]對淀粉產(chǎn)色鏈霉菌進(jìn)行了70 d的酸適應(yīng)性進(jìn)化,使得適應(yīng)性進(jìn)化菌株的菌體干重較出發(fā)菌株增加了60%。本文以1株ε-PL生產(chǎn)菌StreptomycesalbulusGS114為出發(fā)菌株,采用適應(yīng)性進(jìn)化策略,通過逐漸降低馴化pH值,實現(xiàn)S.albulusGS114低pH耐受性增強;再結(jié)合菌株篩選,獲得低pH耐受性能增強和ε-PL產(chǎn)量提高的突變菌株。最后,考察了不同pH值對最優(yōu)適應(yīng)性進(jìn)化菌株分批發(fā)酵影響,并評估了最優(yōu)適應(yīng)性進(jìn)化菌株補料-分批發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

StreptomycesalbulusGS114,由本實驗室選育和保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(貝特納)(g/L):葡萄糖 10,酵母粉 1,魚粉蛋白胨 2,pH 7.5。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 50,酵母粉 5,(NH4)2SO45,KH2PO41.36,K2HPO40.8,MgSO4·7H2O 0.5,ZnSO4·7H2O 0.04,FeSO4·7H2O 0.03,pH 6.8。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 60,酵母粉 10,(NH4)2SO410,KH2PO44,MgSO4·7H2O 0.5,ZnSO4·7H2O 0.04,FeSO4·7H2O 0.03,pH 6.8。

1.1.3 試劑和儀器

葡萄糖(優(yōu)級純),山東西王藥業(yè)有限公司;酵母粉,Oxoid公司;其他試劑(分析純),國藥化學(xué)試劑有限公司。

UV-2100分光光度計,優(yōu)尼科儀器有限公司;AB204-N分析天平,瑞士梅特勒公司;GNP-9160恒溫培養(yǎng)箱,上海光都儀器設(shè)備有限公司;高速冷凍離心機3K15,德國西格瑪公司;HYL-C組合式搖床,太倉市強樂設(shè)備有限公司;SBA-40C生物傳感分析儀,山東省科學(xué)院生物研究所;5 L發(fā)酵罐,上海保興生物設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng):挑取2～3環(huán)孢子接種至種子培養(yǎng)基,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。

搖瓶水平的ε-PL發(fā)酵:將培養(yǎng)好的種子液以體積分?jǐn)?shù)8%接種量接入裝有40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,30 ℃、200 r/min,培養(yǎng)72 h。

1.2.2 適應(yīng)性進(jìn)化

取生長24 h種子液,以8%的接種量分別轉(zhuǎn)接pH 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的M3G搖瓶,30 ℃,200 r/min,培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)前后取樣稀釋涂布,然后平板菌落計數(shù)。

將孢子接種至含有40 mL M3G培養(yǎng)基(pH 6.8)的250 mL搖瓶中,30 ℃,200 r/min培養(yǎng)24～26 h,將培養(yǎng)后的菌液按8%的接種量接種至pH 4.0的M3G培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min培養(yǎng)72 h,每隔12 h取樣,測定其菌體干重。

將以8%的接種量將培養(yǎng)24 h的S.albulusGS114種子液接種至初始pH 4.0的M3G培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)36 h,再以8%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的相同培養(yǎng)基中。在轉(zhuǎn)接過程中待其菌體量穩(wěn)定后,降低適應(yīng)性進(jìn)化pH,每次降低0.2,增加選擇壓力。在適應(yīng)性進(jìn)化的不同pH時期,挑選在pH 4.0的M3G固體平板上生長快速、產(chǎn)孢子能力強的菌株,即為耐酸能力提高的進(jìn)化菌株。

1.2.3 不同pH適應(yīng)性進(jìn)化菌株孢子耐酸能力評估

將不同pH適應(yīng)性進(jìn)化菌株的孢子,經(jīng)梯度稀釋(10-1、10-2、10-3)后,點涂于不同pH值(6.0、4.0、3.8、3.6)的貝特納平板上,30 ℃靜置培養(yǎng),觀測菌落生長情況。

1.2.4 不同pH適應(yīng)性進(jìn)化菌株發(fā)酵能力評價

取3 mL培養(yǎng)24 h的種子液接種到裝有40 mL YP培養(yǎng)基(初始pH 6.8)的250 mL錐形瓶中,置于搖床中30 ℃、200 r/min培養(yǎng)72 h,測定菌體干重,ε-PL產(chǎn)量。

1.2.5 不同pH對適應(yīng)性進(jìn)化菌株生產(chǎn)ε-PL的影響

將培養(yǎng)好的種子液以體積分?jǐn)?shù)8%接種量接入5 L發(fā)酵罐中,裝液量為3.5 L,溫度設(shè)置為30 ℃,初始轉(zhuǎn)速為200 r/min,溶氧設(shè)置為30%,轉(zhuǎn)速溶氧聯(lián)動控制。待pH分別自然下降至4.0、3.8、3.6時,用體積分?jǐn)?shù)12.5%的NH3·H2O分別維持pH恒定直至葡萄糖消耗完畢。

1.2.6 適應(yīng)性進(jìn)化菌株與出發(fā)菌株補料分批發(fā)酵過程分析

培養(yǎng)24 h的種子液以體積分?jǐn)?shù)8%接種量接入5 L寶興發(fā)酵罐中,裝液量為3.5 L,溫度設(shè)置為30 ℃,初始轉(zhuǎn)速為200 r/min,溶氧設(shè)置為30%,轉(zhuǎn)速溶氧聯(lián)動控制。待pH值自然下降至4.0時,用體積分?jǐn)?shù)12.5%的NH3·H2O分別維持pH恒定直至192 h發(fā)酵結(jié)束。當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度低于10 g/L時,根據(jù)葡萄糖的消耗速率設(shè)定補料速率,補加質(zhì)量濃度為750 g/L葡萄糖溶液,維持發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度在10 g/L左右直至發(fā)酵結(jié)束。與此同時,當(dāng)NH4+-N質(zhì)量濃度低于0.2 g/L時補加375 g/L (NH4)2SO4溶液,使NH4+-N質(zhì)量濃度維持在0.2～0.5 g/L,如此重復(fù)直至發(fā)酵結(jié)束。

1.2.7 發(fā)酵參數(shù)測定

葡萄糖濃度使用生物傳感分析儀進(jìn)行測定,樣品稀釋100倍,25 μL進(jìn)樣量進(jìn)行測定;NH4+-N濃度采用奈斯勒試劑比色法測定[18];ε-PL濃度采用甲基橙比色法[19];菌體干重(dry cell weight,DCW)測定參考汪澤等[20]的方法。ε-PL平均比合成速率按公式(1)計算:

(1)

式中:x,DCW,g/L;t,發(fā)酵時間,h;p,ε-PL產(chǎn)量,g/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 S.albulus GS114的低pH適應(yīng)性進(jìn)化

初始適應(yīng)性進(jìn)化pH值和轉(zhuǎn)接時間的選擇對適應(yīng)性進(jìn)化的成敗起著關(guān)鍵作用。為此,首先考察了不同起始pH值對S.albulusGS114存活率的影響,結(jié)果如圖1-a所示。S.albulusGS114在初始pH值為2.5和3.0的體系中活菌數(shù)隨著培養(yǎng)時間延長而明顯下降,在初始pH值為3.5和4.0的體系中存活率有少許增加并保持穩(wěn)定,而在初始pH值為4.5和5.0的體系中活菌數(shù)有顯著增加。由此可以看出,選擇初始pH值為3.5和4.0為適應(yīng)性進(jìn)化初始pH值較合適。然而,預(yù)實驗選擇pH 3.5作為初始適應(yīng)性進(jìn)化pH值的實驗周期太長(結(jié)果未給出),故選擇初始pH值4.0為最佳適應(yīng)性進(jìn)化初始pH值。其次,考察了S.albulusGS114在初始pH 4.0適應(yīng)性進(jìn)化體系中的生長曲線,結(jié)果如圖1-b所示。S.albulusGS114隨著培養(yǎng)時間延長,菌體干重一直處于下降趨勢,說明該pH并不適合菌體正常生長。另外,由于在24～36 h菌體干重降低幅度最大,具有適應(yīng)性進(jìn)化潛力,故選擇36 h為最佳轉(zhuǎn)接時間。在確定適應(yīng)性進(jìn)化條件后,開始采用逐級降低pH的策略對S.albulusGS114進(jìn)行低pH適應(yīng)性進(jìn)化,過程如圖1-c所示。整個適應(yīng)性進(jìn)化過程共進(jìn)行了連續(xù)62次轉(zhuǎn)接,歷時2 232 h(93 d),適應(yīng)性進(jìn)化pH值從4.0降低到3.6。當(dāng)適應(yīng)性進(jìn)化pH值,下降至3.4時,菌體生長延滯期嚴(yán)重延長甚至停止生長(結(jié)果未給出),導(dǎo)致適應(yīng)性進(jìn)化所付出的時間成本與收益極大的不平衡,因此適應(yīng)性進(jìn)化停止在pH 3.6。從圖1-c可以看出,pH 4.0適應(yīng)性進(jìn)化階段,出發(fā)菌株初始菌體干重為1.4 g/L,經(jīng)過14次轉(zhuǎn)接(504 h)后,菌體干重達(dá)到2.4 g/L;pH 3.8適應(yīng)性進(jìn)化階段,初始菌體干重為2.3 g/L,經(jīng)過18次轉(zhuǎn)接(648 h)后,菌體干重達(dá)到2.6 g/L;在pH 3.6適應(yīng)性進(jìn)化階段,由于pH值更低造成環(huán)境壓力增大,從pH 3.8中轉(zhuǎn)接的菌體干重逐漸降低,經(jīng)過5次轉(zhuǎn)接(180 h)后,菌體干重才逐漸增加,最終經(jīng)過31次轉(zhuǎn)接(1 116 h),菌體干重達(dá)到2.46 g/L。總體上來說,經(jīng)過逐級降低pH的適應(yīng)性進(jìn)化,實現(xiàn)了出發(fā)菌株的適應(yīng)性進(jìn)化pH值由4.0降低至3.6。

a-不同pH條件培養(yǎng)下菌落數(shù);b-菌體干重隨培養(yǎng)時間變化;c-菌體干重隨轉(zhuǎn)接次數(shù)變化圖1 適應(yīng)性進(jìn)化策略的設(shè)計與實施Fig.1 Design and implementation of adaptive evolution strategy

2.2 耐受低pH的ε-PL高產(chǎn)菌株篩選

本研究一方面要實現(xiàn)S.albulusGS114的低pH耐受性增加,另一方面要確保S.albulusGS114的ε-PL合成能力不下降甚至提高。因此,需要對各適應(yīng)性進(jìn)化階段的菌株進(jìn)行ε-PL合成能力的篩選,結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同適應(yīng)性進(jìn)化條件下ε-PL產(chǎn)量篩選結(jié)果Fig.2 Screening results of ε-PL yield under different adaptive evolution conditions

出發(fā)菌株ε-PL產(chǎn)量為2.27 g/L,在不同批次的適應(yīng)性進(jìn)化中均篩選到產(chǎn)ε-PL能力提高的菌株。pH 4.0,pH 3.8階段適應(yīng)性進(jìn)化篩選到的菌株ε-PL產(chǎn)量離散程度較大,pH 3.6階段適應(yīng)性進(jìn)化得到的菌株ε-PL產(chǎn)量較為集中。同時,隨著適應(yīng)性進(jìn)化pH值降低,低pH耐受菌株ε-PL產(chǎn)量的平均數(shù)和中位數(shù)均在下降,說明適應(yīng)性進(jìn)化一方面提高了菌株的低pH耐受性,另一方面卻造成了ε-PL合成能力的普遍下降。這可能是經(jīng)過低pH環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)化后的菌株在基本生理代謝與次級代謝產(chǎn)物之間權(quán)衡的結(jié)果。經(jīng)過大量篩選,最終確定pH 4.0適應(yīng)性進(jìn)化階段最優(yōu)菌株為S.albulusALE4.0,pH 3.8適應(yīng)性進(jìn)化階段最優(yōu)菌株為S.albulusALE3.8,pH 3.6適應(yīng)性進(jìn)化階段最優(yōu)菌株為S.albulusALE3.6。

2.3 適應(yīng)性進(jìn)化菌株的低pH耐受性能和ε-PL合成能力評價

為了評價適應(yīng)性進(jìn)化對S.albulus低pH耐受性的影響,將S.albulusALE4.0、S.albulusALE3.8、S.albulusALE3.6和出發(fā)菌株S.albulusGS114的孢子點接于不同pH的固體平板上(pH 6.0、4.0、3.8、3.6),以觀察它們的菌落生長情況,結(jié)果如圖3所示。在pH 6.0和pH 4.0的平板上,4個菌株的生長情況基本相同,菌落大小也基本一致;在pH 3.8和pH 3.6平板上,出發(fā)菌株與ALE4.0、ALE3.8菌株均只能在10-1稀釋倍數(shù)下生長,但ALE4.0和ALE3.8菌株的菌落較出發(fā)菌株的菌落大;而ALE3.6菌株可以在10-1、10-2稀釋倍數(shù)下生長,顯示出ALE3.6菌株的突出低pH耐受性。由此可以看出,經(jīng)過低pH適應(yīng)性進(jìn)化,ALE4.0和ALE3.8菌株的低pH耐受能力有一定提升,而ALE3.6菌株的低pH耐受能力得到顯著增強。

為了評價適應(yīng)性進(jìn)化菌株的ε-PL合成能力,4個菌株的搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖4所示。ALE3.6 菌株的ε-PL產(chǎn)量最高為(2.17±0.12) g/L,相較于出發(fā)菌株(1.84±0.11) g/L,ε-PL產(chǎn)量提升了17.9%。ALE4.0和ALE3.8菌株的ε-PL產(chǎn)量分別為(1.89±0.04)、(1.92±0.04) g/L,與出發(fā)菌株無顯著差異。在菌體量方面,ALE3.6的菌體干重最小,為(7.5±0.21) g/L,較出發(fā)菌株(9.0±0.42) g/L,菌體干重降低了16.7%;ALE4.0和ALE3.8菌體量分別為(8.74±0.02)、(9.45±0.07) g/L,與出發(fā)菌株(9.0±0.42) g/L無顯著差異。單位菌體ε-PL合成能力方面,ALE3.6菌株的單位菌體合成能力為0.289 g/g,較出發(fā)菌株GS114(0.204 g/g)提高了41.7%。ALE4.0和ALE3.8菌株的單位菌體合成能力分別為0.216 g/g、0.203 g/g,與出發(fā)菌株無顯著差異。綜上,選擇S.albulusALE3.6作為后續(xù)研究對象。

圖4 出發(fā)菌株與適應(yīng)性進(jìn)化菌株的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)ε-PL結(jié)果Fig.4 Fermentation results of starting strains and adaptive evolutionary strains for ε-PL production

2.4 不同發(fā)酵pH值對S.albulus ALE3.6分批發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的影響

pH值是影響S.albulus合成ε-PL的最重要因素。因此,在5 L發(fā)酵罐水平考察了不同pH值對S.albulusALE3.6分批發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的影響,結(jié)果如圖5所示。在恒定pH 4.0條件下,ALE3.6菌株的ε-PL產(chǎn)量為4.63 g/L、菌體干重為16.8 g/L,較出發(fā)菌株(ε-PL產(chǎn)量4.08 g/L、菌體干重19.5 g/L),分別提升了13.5%和降低了13.8%;在恒定pH 3.8條件下,ALE3.6菌株的ε-PL產(chǎn)量為6.14 g/L、菌體干重為11.8 g/L,較出發(fā)菌株(ε-PL產(chǎn)量5.64 g/L、菌體干重17.4 g/L),分別提升了8.9%和降低了32.2%;在恒定pH 3.6條件下,ALE3.6菌株ε-PL產(chǎn)量為7.2 g/L、菌體干重為14.7 g/L,較出發(fā)菌株(ε-PL產(chǎn)量7.8 g/L、菌體干重14.6 g/L)的產(chǎn)量降低了7.7%,而菌體干重并無差異。值得注意的是,在pH 4.0和pH 3.8條件下,ALE3.6菌株的顯著特點是單位菌體合成能力得到顯著提升,分別達(dá)到0.28、0.52 g/g,較出發(fā)菌株(0.21、0.32 g/g),分別提高了33.3%和62.5%;在恒定pH 3.6條件下,ALE3.6菌株的顯著特點是產(chǎn)率實現(xiàn)了提升,達(dá)到0.12 g/(L·h),較出發(fā)菌株的0.11 g/(L·h)提高了10%。同時,在恒定pH 3.6條件下,ALE3.6的葡萄糖消耗速率為0.92 g/(L·h),出發(fā)菌株的葡萄糖消耗速率為0.76 g/(L·h),提高了21%。由此可見,適應(yīng)性進(jìn)化菌株S.albulusALE3.6在不同pH條件下均較出發(fā)菌株表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。如圖5-d所示,就產(chǎn)物合成而言,pH越高ε-PL合成速率越高,ε-PL平均比合成速率在pH 4.0、3.8、3.6條件下分別為0.021、0.015、0.014 h-1。為了達(dá)到低菌體量高ε-PL產(chǎn)量的目的,選擇pH 4.0作為S.albulusALE3.6最優(yōu)發(fā)酵pH值。

2.5 S.albulus ALE3.6補料-分批發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL

補料-分批發(fā)酵是生產(chǎn)ε-PL的主要方式。為此,考察了適應(yīng)性進(jìn)化菌株S.albulusALE3.6和出發(fā)菌株S.albulusGS114在恒定pH 4.0條件下的補料-分批發(fā)酵過程,結(jié)果如圖6所示。

圖6-a顯示,出發(fā)菌株GS114在恒定pH 4.0條件下連續(xù)發(fā)酵192 h,菌體干重達(dá)到56.5 g/L、ε-PL產(chǎn)量為26.8 g/L;圖6-b顯示,適應(yīng)性進(jìn)化菌株S.albulusALE3.6在相同的發(fā)酵工藝條件下,實現(xiàn)菌體干重為39.8 g/L、ε-PL產(chǎn)量達(dá)到43.7 g/L。與出發(fā)菌株相比,S.albulusALE3.6的菌體干重降低了30%,但ε-PL產(chǎn)量提高了63%。另外,適應(yīng)性進(jìn)化菌株S.albulusALE3.6的單位菌體合成能力為1.1 g/g,較出發(fā)菌株(單位菌體合成能力為0.47 g/g)提升了134%。進(jìn)一步分析發(fā)酵過程參數(shù)發(fā)現(xiàn),ALE3.6在發(fā)酵過程中保持菌體干重緩慢增加,并在114 h達(dá)到穩(wěn)定,后續(xù)菌體干重基本不再增加;而出發(fā)菌株在72 h菌體干重達(dá)到穩(wěn)定,在120～140 h菌體干重又發(fā)生了明顯增長。菌體干重的增加會帶來發(fā)酵過程氧氣需求和碳源消耗的增加,這也是發(fā)酵過程中出發(fā)菌株GS114需要保持較高轉(zhuǎn)速和葡萄糖轉(zhuǎn)化率低的重要原因。對ε-PL變化的分析發(fā)現(xiàn)在72～120 h出發(fā)菌株GS114的ε-PL增長基本較為緩慢甚至停滯,在120～192 h開始大量合成,在整個發(fā)酵過程中,ε-PL平均比合成速率為0.004 h-1;適應(yīng)性進(jìn)化菌株S.albulusALE3.6在整個發(fā)酵周期內(nèi)基本保持相同的ε-PL增長速度,整個發(fā)酵過程ε-PL平均比合成速率為0.009 h-1,表明適應(yīng)性進(jìn)化菌株S.albulusALE3.6主要通過中期ε-PL的大量積累來達(dá)到增產(chǎn)的目的。因此,在恒定pH 4.0補料-分批條件下,適應(yīng)性進(jìn)化菌株S.albulusALE3.6菌株較出發(fā)菌株具有更高的ε-PL的合成能力和生產(chǎn)效率。

a-恒定pH 4.0分批發(fā)酵;b-恒定pH 3.8分批發(fā)酵;c-恒定pH 3.6分批發(fā)酵;d-ALE3.6菌株不同pH發(fā)酵比較圖5 不同發(fā)酵pH值對S.albulus ALE3.6分批發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的影響Fig.5 Effect of pH on ε-PL production in batch fermentation by S.albulus ALE3.6

a-GS114恒定pH 4.0補料分批發(fā)酵; b-ALE3.6恒定pH 4.0補料分批發(fā)酵圖6 不同菌株恒定pH 4.0補料分批發(fā)酵生產(chǎn)ε-PLFig.6 Production of ε-PL in fed-batch fermentation using constant pH 4.0 strategy by S.albulus GS114 and S.albulus ALE3.6

3 結(jié)論

ε-PL作為一種天然食品防腐劑,以其安全性高、抗菌譜廣、耐熱性能好的的優(yōu)勢正逐漸在食品工業(yè)得以應(yīng)用。然而,在ε-PL發(fā)酵生產(chǎn)過程中,S.albulus長時間遭受低pH脅迫,嚴(yán)重影響了其ε-PL生產(chǎn)效率,制約了ε-PL生產(chǎn)成本下降。本研究通過逐步降低馴化pH值的適應(yīng)性進(jìn)化策略,獲得了一株低pH耐受能力增強的ε-PL生產(chǎn)菌株S.albulusALE3.6,其最低耐受pH值為3.6,較出發(fā)菌株降低了0.4;同時,在搖瓶發(fā)酵條件下ε-PL產(chǎn)量達(dá)到(2.17±0.12)g/L,較出發(fā)菌株提高了17.9%。通過考察pH值對S.albulusALE3.6合成ε-PL的影響,發(fā)現(xiàn)pH 4.0是S.albulusALE3.6最優(yōu)發(fā)酵pH值。采用恒定pH 4.0補料分批發(fā)酵方式,實現(xiàn)S.albulusALE3.6發(fā)酵192 h的ε-PL產(chǎn)量達(dá)到43.7 g/L,較出發(fā)菌株提高了63%。本研究證實了適應(yīng)性進(jìn)化策略能夠有效提升S.albulus低pH耐受能力,并且增強S.albulus低pH耐受能力能夠提高其ε-PL合成能力。同時,適應(yīng)性進(jìn)化篩選到的低pH耐受型ε-PL生產(chǎn)菌株為S.albulus耐酸機制和增產(chǎn)機制的解析提供了優(yōu)良研究對象。下一步將通過組學(xué)方法將改良的表型與潛在的基因型和基因表達(dá)水平聯(lián)系起來,進(jìn)而揭示S.albulusALE3.6對酸脅迫反應(yīng)的潛在驅(qū)動因素。