劉暢,陸丹丹,浦軍平,張春枝,陳明*

1(大連工業(yè)大學 生物工程學院,遼寧 大連,116034)2(張家港市華昌藥業(yè)有限公司,江蘇 蘇州,215635)

L-谷氨酰胺是L-谷氨酸的γ-羥基酰胺化產(chǎn)物,是人類及其他哺乳動物體液中含量最豐富的一種游離氨基酸[1],對細胞增殖、保護腸道、減輕炎癥、增強免疫、調(diào)節(jié)相關(guān)疾病通路等具有重要生理功能[2-4]。L-谷氨酰胺廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品、飼料等領(lǐng)域[5-6],其市場需求量日益增加。因此,增加我國L-谷氨酰胺產(chǎn)量、提高其工業(yè)化生產(chǎn)水平具有重要意義。

微生物發(fā)酵法是L-谷氨酰胺工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法,具有成本低廉、質(zhì)量可控、適宜大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢。谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是其主要生產(chǎn)菌種[7],但目前仍存在發(fā)酵水平不夠高、糖酸轉(zhuǎn)化率低、發(fā)酵周期較長等制約工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)問題。白婧[8]利用枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶基因構(gòu)建重組谷氨酸棒桿菌,搖瓶發(fā)酵L-谷氨酰胺產(chǎn)量達32.5 g/L;王書平等[9]通過谷氨酸棒桿菌誘變,篩選L-谷氨酰胺高產(chǎn)菌株,搖瓶產(chǎn)量達33.54 g/L;郭春前等[10]通過優(yōu)化培養(yǎng)基組分,將L-谷氨酰胺搖瓶產(chǎn)量提高到41.0 g/L;江衍哲[11]對菌種進行基因改造,5 L發(fā)酵罐中L-谷氨酰胺產(chǎn)量達57.5 g/L。

谷氨酸棒桿菌生物合成L-谷氨酰胺代謝途徑見圖1:葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑(embden meyerhof pathway,EMP)生成丙酮酸,進入三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán),中間產(chǎn)物α-酮戊二酸經(jīng)谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,GDH)催化與NH4+反應(yīng)生成L-谷氨酸,進一步經(jīng)谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)催化與NH4+反應(yīng)生成L-谷氨酰胺,生成的L-谷氨酰胺可在谷氨酸合成酶(glutamate synthase, GOGAT)催化下與α-酮戊二酸反應(yīng)生成2分子L-谷氨酸?？梢?較高的GS活性、較低的GOGAT活性、充足的碳源(葡萄糖)、氮源(NH4+)和ATP供應(yīng),是谷氨酸棒桿菌大量合成并積累L-谷氨酰胺的必要條件[12],研究表明,谷氨酸棒桿菌生長最適pH值為7.0左右,GS最適pH為5.6左右,而GOGAT在pH值為7.0～8.0活性較強[8,13]。因此,發(fā)酵過程中分階段控制pH策略有利于前期菌體生長和后期L-谷氨酰胺積累。L-谷氨酰胺的碳骨架來源于葡萄糖,其胺基來源于NH4+,培養(yǎng)基中適宜的碳氮源比例有利于L-谷氨酰胺產(chǎn)量的提高[14];同時,在碳氮源充足的情況下,GS活性相較于氮源不足時更高,而GOGAT的活性則不受影響[15]。因此,在發(fā)酵過程中協(xié)同補加葡萄糖和(NH4)2SO4,不僅能保證發(fā)酵過程中碳氮源充足供應(yīng),而且還能提高GS活性。此外,充足的ATP則可通過改善O2供應(yīng)來實現(xiàn)。基于上述分析,本文在響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成的基礎(chǔ)上,在50 L發(fā)酵罐中采用兩階段控制pH的碳氮源協(xié)同補加策略,促進菌體高效合成L-谷氨酰胺,以期為L-谷氨酰胺的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供參考。

圖1 谷氨酸棒桿菌中L-谷氨酰胺生物合成途徑Fig.1 Schematic of L-glutamine biosynthetic pathway in C.glutamicum

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum),大連工業(yè)大學生物工程學院微生物菌種室保藏。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外可見分光光度計,島津企業(yè)管理(中國)有限公司;SPX-250C恒溫恒濕箱,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HYL-B往復式全溫搖瓶柜,太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司;TG16-WS臺式高速離心機,湘儀集團;50 L自動控制發(fā)酵罐,上海百侖生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面完全培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏15、蛋白胨10、酵母浸粉5、NaCl 5、瓊脂粉25,pH 7.0。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50、玉米漿55、尿素6、KH2PO41、K2HPO41、MgSO4·7H2O 0.5,pH 7.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖140、(NH4)2SO450、玉米漿20、KH2PO43.5、MgSO4·7H2O 0.6、MnSO4·H2O 0.01、ZnSO4·7H2O 0.01、CuSO4·5H2O 0.01、CaCO330,pH 7.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵

取生長良好的谷氨酸棒狀桿菌斜面菌種,挑取一環(huán),接種到裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,于32 ℃、110 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。按8%接種量將種子液接入裝有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,32 ℃、110 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)配方優(yōu)化

選擇發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖、(NH4)2SO4和玉米漿作為3個因素,以發(fā)酵72 h的L-谷氨酰胺產(chǎn)量為響應(yīng)值,采用Box-Behnken設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗,因素及水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗因素及水平Table 1 Factors and levels in Box-Behnken experiment

1.2.3 50 L發(fā)酵罐中L-谷氨酰胺發(fā)酵

1.2.3.1 控制pH 7.0的分批發(fā)酵

按總裝液量35 L配制發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌冷卻后,調(diào)pH 7.0,按照10%接種量接入種子液,100 r/min、32 ℃培養(yǎng),流加氨水控制發(fā)酵液pH 7.0,培養(yǎng)80 h,通氣量分階段控制(0～10 h,0.5 vvm;10～65 h,0.7 vvm;65～80 h,0.5 vvm),當接種后溶氧從100%降至10%時,設(shè)置溶氧關(guān)聯(lián)攪拌轉(zhuǎn)速,控制發(fā)酵液的溶氧10%～15%范圍。

1.2.3.2 兩階段控制pH的碳氮源協(xié)同補加發(fā)酵

按總裝液量35 L配制發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌冷卻后,調(diào)pH 7.0,按照10%接種量接入種子液,100 r/min、32 ℃培養(yǎng),采用兩階段控制pH:0～12 h流加氨水控制pH 7.0,12 h后控制pH≥5.6,培養(yǎng)52 h,通氣量分階段控制(0～4 h,0.5 vvm;4～32 h,1.1 vvm;32～52 h,0.5 vvm),當接種后溶氧從100%降至10%時,設(shè)置溶氧關(guān)聯(lián)攪拌轉(zhuǎn)速,控制發(fā)酵液的溶氧10%～15%范圍;在發(fā)酵過程的第24、36 h時分2次且每次補加2.5 L質(zhì)量濃度為500 g/L的葡萄糖溶液和1 L質(zhì)量濃度為300 g/L的(NH4)2SO4溶液。

1.2.4 菌體濃度測定

用0.25 mol/L的鹽酸將發(fā)酵液稀釋到適當倍數(shù)后于600 nm波長下測定吸光度。

1.2.5 殘?zhí)呛繙y定

采用斐林試劑滴定法。

1.2.6 (NH4)2SO4含量測定

采用靛酚藍比色法[16]。

1.2.7L-谷氨酰胺含量的測定

利用紙層析-色斑洗脫比色法測定L-谷氨酰胺含量[17],展開劑為苯酚-水(4∶1,體積比)。配制質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25、30、35、40 g/L的L-谷氨酰胺標準溶液,分別取1 μL點樣于濾紙進行層析展開。展開完成后烘干,噴上5 g/L茚三酮-丙酮溶液進行顯色。顯色后將L-谷氨酰胺顯色斑點剪下,裝入具塞試管,利用體積比V(0.1% CuSO4)∶V(75%乙醇)=2∶38的洗脫液進行洗脫,洗脫液體積為10 mL,洗脫液置于37 ℃水浴40 min,在波長520 nm的條件下測量吸光度,制作L-谷氨酰胺濃度標準曲線。

取1.5 mL發(fā)酵液于離心管中,4 000 r/min離心5 min,取1 μL上清液點樣于濾紙進行展開,進行上述相同顯色及洗脫操作,在波長520 nm的條件下測量吸光度,對照標準曲線計算相應(yīng)L-谷氨酰胺濃度。

1.2.8 發(fā)酵液pH值的測定

采用pH計測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Design Expert V 8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析,使用Origin 2018軟件進行方程擬合及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶條件下發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化

2.1.1 Box-Behnken試驗結(jié)果

利用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面試驗,L-谷氨酰胺發(fā)酵結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

2.1.2 方差分析

通過Design Expert V 8.0.6軟件分析得到L-谷氨酰胺產(chǎn)量的回歸方程如公式(1)所示:

Y=38.49-2.61A+1.23B+0.65C-0.037AB-0.56AC-0.41BC-9.17A2-2.72B2-2.08C2

(1)

用Box-Behnken設(shè)計構(gòu)建數(shù)學模型進行回歸方程的方差分析,所得結(jié)果如表3所示;3種因素交互對響應(yīng)值的影響所對應(yīng)的響應(yīng)面圖如圖2所示。由表3可知,本次設(shè)計所得模型F值為30.21,有較好的顯著性(P<0.000 1),失擬項不顯著(P=0.109 5>0.05),說明此方程回歸顯著。在該模型可信度分析中,方程的決定系數(shù)R2=0.974 9,說明所得到的L-谷氨酰胺含量的真實值與預(yù)測值之間有良好的擬合度,變異系數(shù)C·V%=4.25%,小于10%,表明該試驗穩(wěn)定性強,可用此模型來對3種物質(zhì)對L-谷氨酰胺產(chǎn)量的影響進行分析和預(yù)測;調(diào)整后的決定系數(shù)AdjR2=0.942 6,該模型具有較高的可信度。響應(yīng)值Y與A、A2、B2顯著性差異極顯著(P<0.01),與B、C2差異顯著(P<0.05),提示各試驗因素對L-谷氨酰胺產(chǎn)量的影響并非簡單的線性關(guān)系,根據(jù)回歸方程一次項系數(shù)的絕對值,可得出影響L-谷氨酰胺產(chǎn)量的主次因素為葡萄糖(A)>(NH4)2SO4(B)>玉米漿(C)。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression equation

2.1.3 最佳配方確定與檢驗

通過Design Expert V 8.0.6軟件分析,最適葡萄糖、(NH4)2SO4和玉米漿的添加量分別為167.05、61.08、30.78 g/L,此條件下L-谷氨酰胺的產(chǎn)量達最高值38.89 g/L。數(shù)值取整后各因素最適添加量為:葡萄糖167 g/L,(NH4)2SO461 g/L,玉米漿31 g/L。在此條件下重復3次搖瓶發(fā)酵試驗,L-谷氨酰胺平均產(chǎn)量為38.13 g/L,與理論預(yù)測值較為接近,模型模擬結(jié)果可信,L-谷氨酰胺搖瓶發(fā)酵水平較優(yōu)化前提高了34.12%。王霞[18]通過響應(yīng)面法將L-谷氨酰胺搖瓶發(fā)酵水平提高了18.0%,達到40.6 g/L;郭春前等[10]通過響應(yīng)面法優(yōu)化L-谷氨酰胺發(fā)酵培養(yǎng)基,產(chǎn)量提高了37.6%;結(jié)果表明響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基組成對于L-谷氨酰胺發(fā)酵水平的提高具有顯著效果。

2.2 利用50 L發(fā)酵罐進行L-谷氨酰胺發(fā)酵

2.2.1 控制pH 7.0的分批發(fā)酵

在50 L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵進程如圖3-a所示。在發(fā)酵前期,菌體處于延遲期,葡萄糖消耗慢;從10 h開始,菌體進入對數(shù)生長期,生長迅速,葡萄糖消耗量增大,發(fā)酵液中的L-谷氨酰胺開始積累;到發(fā)酵后期(65 h以后),菌體處于穩(wěn)定期,菌體量逐漸達到最大值,代謝產(chǎn)物大量積累,碳源被進一步被消耗;發(fā)酵至80 h時,L-谷氨酰胺的積累趨近最大值,此時L-谷氨酰胺產(chǎn)量達42.06 g/L,較搖瓶發(fā)酵提高了10.31%,按照實際發(fā)酵液體積37 L計算,糖酸轉(zhuǎn)化率為25.85%,生產(chǎn)強度為0.53 g/(L·h)。

a-發(fā)酵進程;b-菌體生長擬合曲線;c-底物消耗擬合曲線;d-產(chǎn)物生成擬合曲線圖3 50 L發(fā)酵罐中控制pH 7.0條件下谷氨酸棒桿菌分批發(fā)酵進程及動力學模型擬合曲線Fig.3 Batch fermentation process and fitted curve of kinetic models by C.glutamicum in 50 L fermenter with pH 7.0 control

選擇Logistic方程[19]對菌體生長進行非線性擬合,結(jié)果如圖3-b所示,其中R2為0.993 6,菌體生長動力學模型如公式(2)所示:

(2)

選擇Luedeking-Piret-Like方程對發(fā)酵液中葡萄糖消耗進行非線性擬合,結(jié)果如圖3-c所示,其中R2為0.994 4,底物消耗動力學模型如公式(3)所示:

(3)

選用Boltzman模型對產(chǎn)物L-谷氨酰胺生成進行非線性擬合,結(jié)果如圖3-d所示,其中R2為0.993 8,產(chǎn)物生成動力學模型如公式(4)所示:

(4)

基于對50 L發(fā)酵罐中控制pH值為7.0條件下L-谷氨酰胺發(fā)酵進程及菌體生長、底物消耗、產(chǎn)物生成動力學分析,可以看出,整個發(fā)酵過程中(0～80 h)谷氨酸棒桿菌處于較好生長態(tài)勢,說明pH值為7.0適合菌體生長,但從葡萄糖消耗和L-谷氨酰胺生成情況來看,葡萄糖代謝生成L-谷氨酰胺的效率并不高,L-谷氨酰胺產(chǎn)量、生產(chǎn)強度和糖酸轉(zhuǎn)化率較工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)水平還存在較大差距,這可能是由于控制pH值為7.0導致谷氨酸棒桿菌的GS活性較低所致;同時發(fā)現(xiàn),發(fā)酵前期菌體生長需要較高的溶氧,所設(shè)定的通氣量可能無法滿足菌體生長所需,而通過溶氧關(guān)聯(lián)攪拌則容易導致攪拌轉(zhuǎn)速過高,產(chǎn)生較大剪切力,不利于發(fā)酵初期菌體生長,容易導致菌體絮凝[20]。因此,調(diào)整發(fā)酵過程通氣量并采用分階段控制pH策略,結(jié)合碳氮源協(xié)同補加,可能有利于前期菌體生長和后期L-谷氨酰胺積累。

2.2.2 兩階段pH控制下的補料分批發(fā)酵結(jié)果

在50 L發(fā)酵罐中采用兩階段控制pH的碳氮源協(xié)同補加策略,發(fā)酵結(jié)果如圖4所示。相較于分批發(fā)酵,補料分批發(fā)酵過程中菌體生長的延遲期縮短,提前進入對數(shù)生長期,說明加大通氣量,保持適宜的攪拌轉(zhuǎn)速,有利于促進菌體的生長。培養(yǎng)12 h后控制發(fā)酵液pH≥5.6,此時菌體處于對數(shù)生長期,pH雖有所變化,但菌體仍保持較高生長速率;同時,葡萄糖和(NH4)2SO4的消耗速率增大,且L-谷氨酰胺產(chǎn)量快速上升,說明pH的改變有利于提高GS活性,促進了菌體利用碳源和氮源生成L-谷氨酰胺,并為碳氮源的補加創(chuàng)造了條件。在發(fā)酵的第24、36 h,分2次且每次補加2.5 L 500 g/L的葡萄糖溶液和1 L 300 g/L的(NH4)2SO4溶液,補料后發(fā)酵液中的葡萄糖與(NH4)2SO4質(zhì)量濃度比約為3∶1。在第24 h進行第一次補料時,菌體處于對數(shù)生長中后期,菌體生長速度減緩,L-谷氨酰胺的積累量在補料后的第8 h(即培養(yǎng)第32 h)即達到39.30 g/L;在36 h進行第2次補料前,L-谷氨酰胺產(chǎn)量已高于50 g/L,第2次補料后,菌體濃度基本保持穩(wěn)定,葡萄糖和(NH4)2SO4持續(xù)被消耗,產(chǎn)物繼續(xù)積累,但由于補料后發(fā)酵液體積增大,L-谷氨酰胺濃度增長速率降低;至52 h時,發(fā)酵液中葡萄糖和(NH4)2SO4濃度已處于較低水平,分別為8.53和8.91 g/L,結(jié)合50 L發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積已接近上限的考慮,不再進行補料,于52 h結(jié)束發(fā)酵。

圖4 50 L發(fā)酵罐中兩階段pH控制的碳氮源協(xié)同補加 條件下谷氨酸棒桿菌分批補料發(fā)酵Fig.4 Fed-batch fermentation process of C.glutamicum in 50 L fermenter under two-stage pH control combined with synergistic addition of carbon and nitrogen sources

在50 L發(fā)酵罐中基于兩階段控制pH的碳氮源協(xié)同補加策略,將發(fā)酵周期縮短至52 h,L-谷氨酰胺產(chǎn)量達68.01 g/L,按照實際發(fā)酵液體積42.50 L計算,糖酸轉(zhuǎn)化率達到33.93%,生產(chǎn)強度為1.31 g/(L·h),顯著高于控制pH 7.0的分批發(fā)酵結(jié)果,這是因為適宜的通氣量及攪拌轉(zhuǎn)速促進了菌體生長,同時兩階段控制pH策略提高了菌體的GS活性以及對碳氮源的底物利用速率,而且葡萄糖和(NH4)2SO4的協(xié)同補加為L-谷氨酰胺的生成提供了充足的原料,從而促進了谷氨酸棒桿菌高效合成L-谷氨酰胺。李爽等[21]于16 L發(fā)酵罐中進行補料分批發(fā)酵44 h后,L-谷氨酰胺的產(chǎn)量為52.2 g/L;呂青蘭[22]在改造谷氨酸棒桿菌并優(yōu)化發(fā)酵策略后,于5 L發(fā)酵罐中補料分批發(fā)酵66 h,達到33.5%的糖酸轉(zhuǎn)化率和1.35 g/(L·h)的生產(chǎn)強度。

3 結(jié)論

谷氨酸棒桿菌發(fā)酵法是目前工業(yè)化生產(chǎn)L-谷氨酰胺的主要方法,但存在發(fā)酵水平不夠高、糖酸轉(zhuǎn)化率低、發(fā)酵周期長等制約工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)問題。本研究利用一株谷氨酸棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-谷氨酰胺,采用響應(yīng)面法優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖、(NH4)2SO4和玉米漿含量,并利用50 L發(fā)酵罐探究了兩階段控制pH的碳氮源協(xié)同補加策略對發(fā)酵結(jié)果的影響。 結(jié)果表明,發(fā)酵前期(0～12 h)控制pH 7.0和增大通氣量有利于谷氨酸棒桿菌的菌體生長,而發(fā)酵中后期(12～52 h)控制pH 5.6有利于提高L-谷氨酰胺合成關(guān)鍵酶GS的活性,從而促進了菌體利用碳源和氮源合成并積累L-谷氨酰胺,并為碳氮源的補加創(chuàng)造了條件。發(fā)酵結(jié)果顯示,50 L發(fā)酵罐中采用兩階段pH控制的碳氮源協(xié)同補加策略,發(fā)酵周期縮短至52 h,L-谷氨酰胺產(chǎn)量達68.01 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率達33.93%,生產(chǎn)強度為1.31 g/(L·h),主要技術(shù)指標達到較高水平,對L-谷氨酰胺的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)具有重要參考價值。