蘇會吉 顏耿杰 陳含笑 班少群 黃小桃 韋艾凌, 毛德文 龍富立△

1.廣西中醫(yī)藥大學研究生院 (廣西 南寧, 530200) 2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院肝病二區(qū)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種受環(huán)境、代謝、基因、免疫和腸道微生態(tài)等多種因素和機制調(diào)控的復雜疾病,由于脂肪堆積過多導致肝實質(zhì)細胞脂肪變性,包括從單純性脂肪變性發(fā)展為脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化,甚至轉(zhuǎn)變?yōu)楦喂δ芩ソ吆透渭毎?HCC)的臨床病理綜合征[1]。NAFLD與代謝綜合征、2型糖尿病、肥胖和高血壓、心臟和腎臟疾病相關(guān),其有害影響正成為公共衛(wèi)生面臨的日益嚴峻的挑戰(zhàn)。脂肪變性是NAFLD的先決條件,雖是良性表現(xiàn),但20%～30%的患者會出現(xiàn)肝臟炎癥,而炎癥、肝細胞腫脹和不同程度的纖維化是NASH的病理特征,肝纖維化的嚴重程度可使NASH向HCC進展[2]。因此,控制NAFLD-NASH-HCC的發(fā)生發(fā)展具有重要的臨床意義。

NAFLD發(fā)病機制經(jīng)典的“二次打擊”理論中,各種原因引起的肝細胞胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)過多蓄積引起胰島素抵抗是第一次打擊,降低了肝臟的抗打擊能力。第二次打擊是由于活性氧(ROS)、脂多糖(LPS)、免疫系統(tǒng)分泌的一些細胞因子和脂肪組織增加,而引發(fā)一系列細胞毒性事件,導致肝臟炎癥過度反應[3]。由活性氧(ROS)介導的氧化應激(OS)可能在“二次打擊”中發(fā)揮重要作用,OS引起膜磷脂的過氧化并改變膜的滲透性,促進炎癥因子的釋放,刺激Kupper細胞(KOs)、肝星狀細胞和肝細胞誘導NAFLD進展,導致NASH壞死性炎癥和纖維化發(fā)展[4]。ROS和炎癥誘導的OS是導致肝細胞死亡、組織損傷的主要因素。

1 ROS及OS

ROS廣泛存在自然界中,是機體生理代謝的副產(chǎn)物,當受到外界環(huán)境刺激時也會產(chǎn)生,通常帶有氧原子或氧化基團,使得ROS具有強氧化性。常見的ROS有過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子自由基(O2-)。在細胞呼吸過程中,線粒體將電子轉(zhuǎn)移到氧氣中并產(chǎn)生ROS,若缺氧和有毒物質(zhì)累積可導致線粒體內(nèi)膜電子傳遞鏈(ETC)的氧化磷酸化線粒體ROS(mtROS)產(chǎn)生過多,ROS迅速釋放到細胞質(zhì)中導致細胞損傷[5]。線粒體Ca2+參與能量產(chǎn)生,Ca2+過載對線粒體功能損害,影響mtROS生成。過氧化物酶體中的ROS、活性氮(RNS)是由于D-氨基酸氧化酶和過氧化物酶體β氧化產(chǎn)生H2O2所致。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是ROS的細胞內(nèi)來源,ER氧化還原素1α和蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶的破壞誘導蛋白質(zhì)的錯誤折疊,產(chǎn)生ROS[6]。此外,細胞質(zhì)基質(zhì)和質(zhì)膜中的NADPH氧化酶(NOX)、黃嘌呤氧化酶、細胞色素P450(CYP)2E1、環(huán)加氧酶和脂氧合酶等酶也可產(chǎn)生ROS,尤其是H2O2。適量的ROS有助于正常的細胞生長、衰老的凋亡,但ROS含量超過一定限度就會打破正常生理平衡。脂質(zhì)代謝紊亂導致肝細胞中的脂肪堆積,從而觸發(fā)細胞器如線粒體、ER和NOX產(chǎn)生ROS。線粒體和微粒體中脂肪酸的β氧化增加在NAFLD中可產(chǎn)生更多的ROS。線粒體通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP,同時產(chǎn)生超氧化物歧化酶(SOD)。

OS是機體抗氧化劑系統(tǒng)無法清除ROS過量產(chǎn)生的毒性作用而導致DNA和組織損傷的過程。由內(nèi)外源條件下引起OS時,過量的ROS會觸發(fā)病理性氧化還原信號傳導,導致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的DNA受到損傷,甚至導致細胞衰老死亡。當脂毒性代謝物積聚在細胞內(nèi)時,它們可以通過解耦氧化磷酸化,誘導ROS產(chǎn)生介導OS,從而導致線粒體功能障礙,發(fā)生一系列肝臟細胞損害事件。在NASH發(fā)展過程中,肝臟OS的發(fā)生可能與不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化形成的高反應性醛產(chǎn)物和4-羥基-2-壬烯醛有關(guān),還可能是由于腸道微生物群相關(guān)的炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激所致[7]。OS誘導許多氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子和促炎遞質(zhì)的激活,如核因子kappa B(NF-κB)、早期生長反應-1和激活蛋白1、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素(IL)等,可導致肝臟炎癥,纖維化和細胞死亡。

2 OS促進NAFLD發(fā)生發(fā)展的機制

2.1 OS與肝脂肪變性 肝細胞中ROS的產(chǎn)生由線粒體ETC驅(qū)動,線粒體是重要的代謝和信號樞紐,負責生產(chǎn)超氧陰離子,并通過β-氧化、三羧酸循環(huán)、電子運輸和ATP合成等途徑維持肝細胞平衡[8]。ROS介導的OS直接干擾線粒體功能,影響肝細胞中的脂肪酸氧化、脂質(zhì)合成和蛋白質(zhì)合成。NAFLD患者中,β-游離脂肪酸攝入過多和ETC活性增加,導致ROS的釋放增加,大量ROS直接靶向線粒體,導致能量代謝減少、線粒體DNA過表達和線粒體功能障礙,引發(fā)胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥和肝細胞凋亡[9]。受損的線粒體無法代償脂肪酸的氧化代謝,mtROS使得膜電位紊亂,降低線粒體自噬的保護機制,促進細胞質(zhì)中脂肪的合成。而胰島素抵抗也會促進OS誘導脂肪變性。單純性肝脂肪變性可通過CYP2E1誘導引起細胞內(nèi)ROS上調(diào),增加ROS反過來又引起OS。

AMP活化蛋白激酶(AMPK)參與多種細胞代謝途徑的調(diào)節(jié)。高水平的ROS可激活AMPK參與代謝,AMPK通過抑制乙酰輔酶A羧化酶和轉(zhuǎn)錄因子[PPARα、PPARγ、甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)]等脂質(zhì)相關(guān)代謝酶的活性,減輕脂質(zhì)積累并促進脂肪酸氧化[10]。SREBP1c的上調(diào)與H2O2觸發(fā)的OS有直接關(guān)系,SREBP1c的過表達提高肝細胞中的ROS水平,增加脂質(zhì)合成,并激活NF-kB炎癥通路,促進肝脂肪變性[11]。細胞中的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD2)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPxs)參與脂肪酸代謝,SOD2是調(diào)節(jié)線粒體基質(zhì)中ROS代謝的關(guān)鍵成分,ROS被SOD2中和,轉(zhuǎn)化為活性較低的H2O2,而后CAT和GPx酶將其還原為水[12]。核因子紅細胞2相關(guān)因子2(NRF2)是一種抗氧化轉(zhuǎn)錄因子,可負調(diào)節(jié)ROS介導的OS。NRF2在細胞核中的表達增加會誘導抗氧化基因的表達,并抑制游離脂肪酸誘導的ROS產(chǎn)生。激活的NRF2抑制白色脂肪組織的脂質(zhì)積累,減少脂肪生成,進而誘發(fā)胰島素抵抗和葡萄糖不耐受,導致ob/ob小鼠的肝臟脂肪變性[13]。

2.2 OS與肝臟炎癥 脂肪變性后,肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)持續(xù)堆積刺激巨噬細胞釋放炎癥因子,引起肝臟的嚴重炎癥反應,導致NASH。肝巨噬細胞包括單核細胞衍生的巨噬細胞以及駐留的KCs。mtDNA從肝細胞中釋放出來并被巨噬細胞識別,釋放TNF-α、JNK、NF-κB及IL-6在內(nèi)的過量炎癥因子,并刺激cGAS-STING通路表達[14]。STING通路由mtDNA激活,并在肝臟和其他組織中發(fā)揮作用。NASH小鼠模型中,即使存在mtDNA誘導的KCs刺激,缺乏STING也會減輕肝脂肪變性、纖維化和核因子NF-κB依賴性炎癥[15]。mtDNA的釋放構(gòu)成損傷相關(guān)分子模式,是對肝細胞中ROS介導的OS引起的線粒體功能障礙的反應。有研究發(fā)現(xiàn)釋放到細胞質(zhì)中的mtDNA和氧化的mtDNA能夠進一步引起核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體的激活[16]。

當存在LPS或其他刺激時,KCs和其他巨噬細胞通過吞噬細胞氧化酶gp91phox或NOX2系統(tǒng)迅速釋放ROS,NOX2被激活后產(chǎn)生超氧化物,向硫氧還蛋白、蛋白激酶C、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶家族成員和NF-κB發(fā)送信號,加劇促炎癥因子的產(chǎn)生[17]。線粒體內(nèi)膜蛋白可增加質(zhì)子轉(zhuǎn)移以下調(diào)線粒體膜電位以減輕ROS介導OS的損傷。在NAFLD中,脂肪的積累導致肝臟中內(nèi)毒素/LPS水平的增加,誘導KCs的M1極化,線粒體內(nèi)膜蛋白被定向破壞,導致ROS過度產(chǎn)生,并激活MAPK和NF-κB通路介導炎癥促炎性細胞因子分泌[18]。KCs分泌的促炎細胞因子誘導中性粒細胞的浸潤和造血干細胞的激活,加劇了肝臟損傷,導致肝纖維化的進展。此外,炎癥應激和脂質(zhì)堆積在促炎癥IL、TGF-β等遞質(zhì)的幫助下,促進NAFLD進展。

2.3 OS與肝纖維化 肝纖維化是過量的細胞外基質(zhì)蛋白的積累,隨著時間的推移會導致瘢痕組織沉積并扭曲肝臟的結(jié)構(gòu),其特征在于肝星狀細胞(HSC)的活化[19]。持續(xù)的肝細胞損傷和炎癥反應導致HSCs的激活。ROS誘導的肝細胞凋亡誘導損傷相關(guān)分子模式的釋放,激活KCs并招募免疫細胞,從而增加細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生,導致HSC活化,并刺激膠原蛋白Ⅰ產(chǎn)生[20]。膠原蛋白Ⅰ是TGF-β驅(qū)動的纖維化的重要細胞內(nèi)信號傳導遞質(zhì),TGF-β是誘導造血干細胞活化的重要細胞因子。TGF-β參與傷口愈合和血管生成,過量的TGF-β從受損的肝細胞和促炎性KCs釋放,被造血干細胞上的TGF-βRI受體識別,并通過SMAD2/3信號途徑增加纖維化[21],此時磷酸化的SMAD2/3可激活NOX4表達。

NOX酶復合物和線粒體是內(nèi)源性ROS的主要生產(chǎn)者。NOX4減少可降低造血干細胞的活化,但不影響TGF-β1受體表達和SMAD2磷酸化,表明ROS由NOX4介導的TGF-β1和SMAD復合物的下游[22]。HSC活化的下調(diào)主要取決于NOX4的缺乏。除了NOX4,NOX1和NOX2也在造血干細胞中表達,NOX1或NOX2消耗可減少由四氯化碳和膽管結(jié)扎引起的炎癥和纖維化[23]。NOX4無需誘導細胞質(zhì)亞基形成活性酶來產(chǎn)生ROS,說明NOX4比NOX1和NOX2更快地產(chǎn)生ROS。NLRP3炎癥小體在HSCs中表達,并有助于HSCs的活化。一項研究發(fā)現(xiàn),NLRP3的清除下調(diào)了HSCs中ROS的產(chǎn)生以及纖維化標志物的mRNA和蛋白質(zhì)水平[24]。ROS誘導OS在TGF-β介導的造血干細胞纖維化中起重要作用。

2.4 OS與TCC 在膽堿缺乏高脂肪飲食誘導的NASH小鼠模型中,CD8+T和自然殺傷T細胞的激活加速肝臟腫瘤發(fā)生[25]。ROS可導致基因組中的點突變或損傷,抗氧化系統(tǒng)通過保護健康細胞有效預防癌變。OS在癌癥中的作用仍有爭議,ROS是腫瘤微環(huán)境的一部分,抗氧化系統(tǒng)可能同時發(fā)揮抗癌和促癌作用。研究顯示,硫氧還蛋白還原酶-1、谷胱甘肽還原酶和NRF2等氧化應激相關(guān)酶和受體作為HCC發(fā)生的主要參與者[26]。通過磷酸戊糖途徑增加NADPH氧化酶是抗癌細胞的一種新興的耐藥機制,間接證實OS的抗癌作用是腫瘤細胞對抗氧化損傷的適應性[27]。

NOX家族包括膜結(jié)合的酶復合物,代表細胞質(zhì)中的ROS生成者,NOXs通過從NADPH轉(zhuǎn)移電子穿過生物膜直接催化O2的產(chǎn)生,調(diào)節(jié)氧化還原敏感的信號傳導途徑[28]。NOXs產(chǎn)生ROS增加OS,而ROS是肝損傷的主要特征,持續(xù)性肝損傷與HCC預后不良及侵襲性有關(guān)。NOX衍生的ROS通過調(diào)控蛋白激酶C、JAK-STAT、MAPK和AKT通路參與腫瘤轉(zhuǎn)化的信號通路。一項研究表明,由NOX1介導的巨噬細胞中產(chǎn)生的ROS通過STAT3和ERK信號通路維持攜帶致癌基因的突變肝細胞的生存和生長,從而促進HCC的發(fā)展[29]。ROS介導的NOX2增加,HCC細胞可誘導巨噬細胞極化為M2耐受表型,促使癌癥增殖[30]。在HFD誘導的HCC發(fā)生過程中,NOX亞基p22phox在腫瘤前肝病灶中表達,鹽皮質(zhì)激素螺內(nèi)酯與β-糖基異槲皮苷聯(lián)合使用能夠通過降低p67phox表達和p22phox陽性的數(shù)量來預防這些脂肪變性誘導的癌前病變細胞[31]。

3 基于氧化應激的中醫(yī)藥干預治療

3.1 中藥單體及其成分 陳劉欣等[32]發(fā)現(xiàn)蛹蟲草多糖(CMPS)喂飼高脂飲食誘導模型組可增加肝臟抗氧化酶SOD活性,降低LPO含量,減輕肝臟脂肪變性,并且CMPS組肝臟中PPARα及ACOX1的mRNA和蛋白表達均上調(diào),表明CMPS有明顯的抗氧化功效,對NAFLD具有保護作用。郭潔等[33]發(fā)現(xiàn)廣藿香酮能降低高脂膳食誘導的NAFLD大鼠肝組織脂肪含量,降低血清中TG、LDL和TC水平,升高HDL水平,并顯著性升高SOD、GSH-Px活性,降低MDA水平。NAFLD小鼠模型中,表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)喂養(yǎng)小鼠的肝組織中SOD、GSH-Px、CAT活性升高了54.82%,MDA含量降低了86.06%,差異有統(tǒng)計學意義[34],說明EGCG對提示增強內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)功能具有重要意義。

3.2 中成藥 習曉麗等[35]選取60例NAFLD患者設(shè)置不同藥物治療組,觀察絞股藍總苷膠囊對氧化應激指標的影響,結(jié)果顯示SOD、GSH-Px、T-AOC水平升高,而MDA降低,表明其可保護肝細胞,改善NAFLD糖脂代謝紊亂,抑制氧化應激反應。在動物實驗中,OS損傷的NAFLD小鼠當使用飛利肝寧膠囊干預后,發(fā)現(xiàn)肝臟SOD活性增強、MDA含量有所降低,從而維持機體氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡,延緩NAFLD進展[36]。

3.3 中藥復方 實驗研究發(fā)現(xiàn)用調(diào)肝祛脂湯治療后,CGI-58水平顯著增加,而NLRP3炎性小體蛋白,IL-1β和TNF-α水平顯著下降,表明調(diào)肝祛脂湯通過調(diào)節(jié)CGI-58和NLRP3炎癥小體對NAFLD誘導的大鼠發(fā)揮了一定的保護作用[37]。張悅等[38]觀察理中湯干預NASH小鼠研究發(fā)現(xiàn),理中湯可通過上調(diào)肝組織中Keap1、Nrf2、HO-1的基因表達,改善Keap1/Nrf2/ARE信號通路相關(guān)蛋白表達,抑制炎癥因子的釋放,進而改善NASH大鼠肝功能、血脂,達到抗氧化應激的療效,阻斷NASH進展。彪雅寧等[39]使用當歸芍藥散治療NAFLD時,發(fā)現(xiàn)Keap1/Nrf2信號通路表達升高,血清和肝臟中SOD和GSH活性明顯升高,MDA含量明顯降低,活化肝脂肪變性減輕,說明當歸芍藥散防治NAFLD的機制與提高抗氧化能力相關(guān)。

4 總結(jié)與展望

NAFLD不再被認為是單純的肝脂肪性變,而是可進展為NASH、失代償期肝硬化甚至HCC的動態(tài)疾病,如何控制其發(fā)生、降低其危害,是我們亟需認真研究解決的重大課題。目前尚無特異性及有效的治療方法,發(fā)現(xiàn)預防或延緩NAFLD進展的方法已成為全球關(guān)注的焦點。氧化應激在肝脂肪變性發(fā)展階段扮演著至關(guān)重要的角色,開發(fā)新穎的治療靶點,有助于有針對性的個體化治療。中醫(yī)藥通過調(diào)控氧化應激途徑、調(diào)節(jié)能量平衡、抑制參與脂肪生成的關(guān)鍵酶,在減輕肝脂肪變性、改善纖維化方面已取得很好的臨床療效。中醫(yī)強調(diào)因人制宜、辨證論治,中藥單體及復方通過多途徑、多靶點發(fā)揮作用,雖成效有佳,但關(guān)于療效與個體之間的差異的關(guān)系尚未明了,還需深入探討各藥物在細胞內(nèi)外作用的代謝過程。