關(guān)鍵詞： 雞；Ⅱ型角蛋白基因家族；生物信息學(xué)分析；結(jié)構(gòu)與功能；共線性；進(jìn)化分析

中圖分類號： S831.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 06?0034?14

角蛋白中間絲（keratin intermediate filament，KIF） 蛋白家族，通常稱為角蛋白家族，是角蛋白超家族中的1 個(gè)亞型，角蛋白中間絲基因通常用KRTs 表示[1-2]。由于KRTs 編碼的肽鏈之間發(fā)生扭曲，呈α 螺旋構(gòu)象，且α 螺旋結(jié)構(gòu)之間含有大量的二硫鍵，使角蛋白具有穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，因此KIF 蛋白又稱為α-角蛋白[3]。α-角蛋白作為細(xì)胞骨架的主要成分，廣泛存在于脊椎動(dòng)物毛發(fā)、鱗片、指甲等皮膚附屬物中，能夠維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織穩(wěn)態(tài)[4-5]。在人類（Homo sapiens） 中，KIF 蛋白家族根據(jù)酸堿性可分為2 個(gè)亞家族：第1 個(gè)亞家族為酸性角蛋白（等電點(diǎn)為4.9～5.4），即人類的K9～K40，被概括稱為Ⅰ型角蛋白[6]；第2 個(gè)亞家族為中性和堿性角蛋白（等電點(diǎn)為6.5～8.5），即人類的K1～K8、K71～K86，被稱為Ⅱ型角蛋白。人類基因組中共包含54 個(gè)功能性角蛋白基因，分別編碼28 個(gè)Ⅰ型角蛋白和26 個(gè)Ⅱ型角蛋白[7]。

作為α-角蛋白家族的1 個(gè)亞型，Ⅱ型KRTs在哺乳動(dòng)物被毛的生長發(fā)育中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，也在非哺乳動(dòng)物如雞（Gallus gallus） 的羽毛毛囊倒刺脊和小枝的早期形成中發(fā)揮重要作用[8-9]。NG等[10]通過全基因組連鎖掃描分析發(fā)現(xiàn)：在Ⅱ型KRT 家族成員KRT75的保守區(qū)域有69 bp缺失，導(dǎo)致了雞的卷羽性狀。DONG 等[11]以卷羽麒麟雞為研究對象，未檢測到KRT75 基因存在69 bp 缺失，但發(fā)現(xiàn)該家族成員KRT75L4基因存在15bp缺失，可能導(dǎo)致雞的卷羽性狀。BAO 等[4]對牦牛KRT 家族基因的分析表明：KRTs 的表達(dá)與毛囊發(fā)育周期密切相關(guān)?？禃札圼12]對1 月齡與48 月齡的灘羊皮膚組織研究發(fā)現(xiàn)：KRT71基因在1月齡灘羊的皮膚組織中表達(dá)較高，揭示了KRT71 基因可能在灘羊幼年時(shí)期卷曲被毛表型的形成中發(fā)揮重要作用。

雞不僅在現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要作用，而且還是開展禽類性狀形成的分子基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)制研究的關(guān)鍵物種[13]。Ⅱ型KRT 基因家族已在多個(gè)物種中被系統(tǒng)地鑒定，該家族與鳥類羽毛的生長發(fā)育密切相關(guān)，但在雞上尚未得到充分研究。本研究通過對雞基因組數(shù)據(jù)中Ⅱ型KRT 基因家族進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)比較分析，全面解析雞中該家族成員的分子特征、進(jìn)化關(guān)系及其功能，研究結(jié)果將為深入研究雞Ⅱ型KRTs 調(diào)控羽毛生長發(fā)育的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1雞Ⅱ型KRT基因家族成員鑒定及基因序列分析

在NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下載雞基因組序列fasta 文件、基因組GFF 注釋信息文件（GCF_016699485.2） 和已報(bào)道的雞Ⅱ型KRTs 氨基酸序列。從InterPro 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/） 中下載Ⅱ型KRTs的隱馬可夫模型（PF16208）。采用TBtools 軟件[14]進(jìn)行BLAST 比對，獲取雞中所有可能的Ⅱ型KRTs 氨基酸序列， 并將其提交至BatchCD-Search 在線工具進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，交叉驗(yàn)證候選序列中Ⅱ型KRTs 結(jié)構(gòu)域和Filament 結(jié)構(gòu)域的存在，獲取結(jié)構(gòu)完整的雞Ⅱ型KRT 基因家族成員。從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載鑒定到的雞Ⅱ型KRTs的核苷酸序列， 使用ORF Finder 程序（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/） 通過開放閱讀框查找確定每條序列的編碼序列（coding sequence，CDS）。進(jìn)一步利用Lasergene 軟件包（DNAStarInc.，美國） 中的Editseq 分析基因的堿基組成和編碼區(qū)長度，并使用MegAlign 程序分析雞Ⅱ型KRT 家族基因序列的一致性。使用TBtools 軟件對雞Ⅱ型KRTs 轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行信息完整化處理，并使用在線軟件Gene Structure Display Server （http：//gsds.gao-ab.org/） 對每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)域結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。

1.2 雞Ⅱ型KRTs 染色體定位和共線性分析

利用TBtools 軟件提取基因組注釋文件中雞Ⅱ型KRT 家族基因的染色體位置信息，制作雞物種內(nèi)共線性分析圖，并對雞、火雞（Meleagrisgallopavo）、日本鵪鶉（Coturnix japonica）、孔雀（Pavo muticus）、野鴨（Anas platyrhynchos） 共5 個(gè)物種進(jìn)行種間共線性分析，探究雞Ⅱ型KRT 基因家族在這些物種間的進(jìn)化關(guān)系。

1.3 雞Ⅱ型KRT 家族蛋白理化性質(zhì)分析

利用ExPASy 網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測分析雞Ⅱ型KRTs 的氨基酸組成、相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏水性、不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)[15]。使用TMHMM-2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/） 預(yù)測基因家族蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)，并利用PSORT 在線網(wǎng)站（https：//www.genscript.com/psort.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位，預(yù)測蛋白質(zhì)的功能作用場所[16]。

1.4 雞Ⅱ型KRTs 保守基序和結(jié)構(gòu)域分析

通過MEME 在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/） 預(yù)測雞Ⅱ型KRTs 的保守基序[17]，選擇Classic mode 進(jìn)行搜索，設(shè)定10個(gè)保守基序，使用TBtools 軟件的Gene Structure" View 功能對預(yù)測的雞Ⅱ型KRTs 保守基序和結(jié)構(gòu)域進(jìn)行可視化。

1.5 Ⅱ型KRT家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

使用MEGA 6軟件中的ClustalW 程序?qū)﹁b定到的雞Ⅱ型KRTs氨基酸序列、NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載的26 條人和24 條小鼠（Mus musculus） 的Ⅱ型KRTs氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap 參數(shù)設(shè)置為1000次重復(fù)，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)。

1.6 雞Ⅱ型KRTs 結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測以及蛋白互作分析

利用SOPMA （http：//npsa-pbil.ibcp.fr/） 和SWISS-MODEL （http：//swissmodel.expasy.org/） 在線網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。在InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）中輸入蛋白質(zhì)序列，進(jìn)行蛋白質(zhì)功能和相關(guān)生物學(xué)信息的預(yù)測。采用STRING （http：//stringdb.org） 進(jìn)行蛋白互作分析[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞Ⅱ型KRT基因家族成員鑒定與基因序列

在雞的參考基因組數(shù)據(jù)中共鑒定出14 個(gè)Ⅱ型KRTs，其中KRT8、LOC107055419 和LOC-768978 基因具有2 個(gè)可變剪接異構(gòu)體，分別命名為KRT8.1 和KRT8.2，LOC107055419.2 和LOC10-7055419.1，LOC768978.1 和LOC768978.2。對該家族基因進(jìn)行堿基組成分析發(fā)現(xiàn)：雞Ⅱ型KRTs 編碼區(qū)的堿基組成相似（表1）。由表2 可知：雞Ⅱ型KRTs 編碼區(qū)序列的一致性在49.6%～100.0%之間，表明序列差異性較大。從基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的結(jié)構(gòu)來看，除LOC431300基因沒有3′非翻譯區(qū)（untranslatedregions，UTR） 外，其他基因均包含內(nèi)含子、CDS和完整的UTR，但數(shù)量、結(jié)構(gòu)和位置存在一定的可變性（圖1）。其中，KRT8.2 基因有10 個(gè)外顯子和9 個(gè)內(nèi)含子，LOC107055419.2基因有8 個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，LOC431300基因有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，其余基因均有9 個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。

2.2 雞Ⅱ型KRTs 染色體定位及共線性

由圖2 可知： 本研究鑒定出的14 個(gè)Ⅱ型KRTs 均分布在雞的第34 號染色體上，且該基因家族成員在染色體上的分布較為集中。通過對Ⅱ型KRTs 進(jìn)行物種內(nèi)和物種間的共線性分析發(fā)現(xiàn)：雞的14 個(gè)Ⅱ型KRTs 在整個(gè)基因組上沒有出現(xiàn)片段重復(fù)（無共線性）（圖3）；但雞的KRT75L1和LOC107055419.1 基因分別與火雞的LOC1049-10877和LOC104910878 基因之間存在片段重復(fù)，雞的LOC107055419.1基因與野鴨的LOC10180-0726基因之間存在片段重復(fù)，雞的KRT8.1 基因與日本鵪鶉KRT8.1基因之間存在片段重復(fù)，而雞與孔雀之間沒有發(fā)現(xiàn)基因的片段重復(fù)（圖4）。

2.3 雞Ⅱ型KRT家族蛋白氨基酸組成和理化特征

雞Ⅱ型KRTs 的氨基酸組成存在較大差異，其中甘氨酸的占比差異最大，KRT3蛋白的甘氨酸占比為26.80%，而LOC107055419.2 蛋白的甘氨酸占比僅為5.60% （表3）。對雞Ⅱ型KRTs 編碼的17 個(gè)蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果（表4） 顯示：KRT8.2 基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸數(shù)量最少（443 aa）、相對分子質(zhì)量最?。?9.85 ku）；而KRT3 基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸數(shù)量最多（709 aa）、相對分子質(zhì)量最大（70.13 ku）。雞Ⅱ型KRTs 的等電點(diǎn)為5.10～8.89，且均為不穩(wěn)定的親水蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示：有9 個(gè)KRTs 定位于細(xì)胞質(zhì)，8個(gè)KRTs 定位于細(xì)胞核。此外，除KRT6A 和KRT75 各有1 次跨膜外，其余成員均無跨膜結(jié)構(gòu)。

2.4 雞Ⅱ型KRTs 的保守基序和結(jié)構(gòu)域

由圖5 可知：在雞的Ⅱ型KRTs 氨基酸序列中共識別出10 個(gè)保守基序。除KRT8、LOC431-300、LOC107055419 和LOC107055419.2含有9個(gè)保守基序外，其余成員均含有10 個(gè)保守基序。

在系統(tǒng)發(fā)育樹中，同一分支內(nèi)的成員，其保守基序的數(shù)量和順序基本一致，而分支之間則略有差異。在雞Ⅱ型KRT家族蛋白中，KRT3蛋白僅含有1個(gè)Filament 保守結(jié)構(gòu)域；LOC431300 和LOC-107055419.2蛋白則含有1個(gè)Filament 和1 個(gè)Filamentsuperfamily 保守結(jié)構(gòu)域；其余蛋白均含有1 個(gè)Keratin_2_head 和1個(gè)Filament 保守結(jié)構(gòu)域。

2.5 Ⅱ型KRT 基因家族系統(tǒng)發(fā)育

由圖6 可知：雞、人和鼠的Ⅱ型KRT基因家族成員主要聚集在4 個(gè)大支中，雞的KRT71、KRT75L1 和KRT75L2 基因可能屬于古老基因，保守程度較高。LOC768978.1、LOC768978.2 和KRT75L4 位于同一分支，可能是KRT75L4 的同源基因；LOC112529929 基因與人和鼠的KRT4 基因在同一支上，預(yù)測LOC112529929 為KRT4 基因或其同源基因。相較于人和鼠，雞的Ⅱ型KRT基因家族成員數(shù)較少，表明該家族成員在雞中的丟失較為嚴(yán)重。

2.6 雞Ⅱ型KRTs的二級和三級結(jié)構(gòu)

由表5 可知：雞Ⅱ型KRTs 的二級結(jié)構(gòu)均包含α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲，其中，α-螺旋占比最高，其次是無規(guī)則卷曲，β-轉(zhuǎn)角占比最小。同源建模（表6） 顯示：雞Ⅱ型KRTs三維結(jié)構(gòu)與模板的一致度均高于75%，序列覆蓋率均高于70%；三級結(jié)構(gòu)中均存在明顯的α-螺旋（圖7），與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符。

2.7 雞Ⅱ型KRT基因家族成員的功能及蛋白互作

雞Ⅱ型KRTs主要參與角化（GO：0031424）、中間長絲組織生成（GO：0045109）、凋亡（GO：0006915） 等生物學(xué)過程，它們在調(diào)節(jié)表皮及其附屬物生長發(fā)育與分子活性方面具有重要功能，可能在羽毛的生長發(fā)育中發(fā)揮了重要作用（表7）。與雞Ⅱ型KRTs 相互作用的蛋白主要包括：KRT-17、KRT13、KRT40、KRT14、KRT24、CDH1、TP63、FAIM2、AQP5 等（圖8），這些蛋白主要參與以下生物學(xué)功能：形成和維護(hù)各種皮膚附屬物，維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和組織結(jié)構(gòu)，參與后期毛發(fā)分化，增強(qiáng)體外角蛋白中間絲的彈性，參與角質(zhì)化和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的細(xì)胞—細(xì)胞黏附、流動(dòng)性和增殖機(jī)制，調(diào)控上皮形態(tài)發(fā)生，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡，參與水和甘油等液體的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等。這些功能表明：雞Ⅱ型KRTs 不僅在皮膚和毛發(fā)的結(jié)構(gòu)維護(hù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，還在多種細(xì)胞和組織過程的調(diào)節(jié)中具有重要意義。

3討論

雞是中國主要的肉類來源之一，且其飼養(yǎng)量逐年增長。羽毛的顏色、色澤和形態(tài)是雞品種的重要外表特征，直接反映其生長和健康狀況，是決定優(yōu)質(zhì)雞經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要因素，因此，羽毛性狀越來越受到關(guān)注。作為脊椎動(dòng)物中最復(fù)雜的皮膚衍生物之一，羽毛的發(fā)育過程與α-角蛋白密切相關(guān)。大量研究表明：α-角蛋白在早期羽毛的發(fā)育中對其性狀和結(jié)構(gòu)的完整性具有重要作用[8， 10， 19]。在羽毛發(fā)育的早期階段，α-角蛋白存在于外皮和羽毛鞘中，但隨著羽毛的發(fā)育成熟，羽毛鞘中的α-角蛋白被β-角蛋白取代[8， 19-20]。Ⅱ型KRT 基因家族是α-角蛋白基因家族的1 個(gè)亞型，編碼的α-角蛋白在毛囊發(fā)育中具有重要作用，但在雞羽毛方面的研究仍不成熟。闡明雞Ⅱ型KRT 基因家族的分子特征、結(jié)構(gòu)及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，有助于深入理解Ⅱ型KRTs 對雞羽毛性狀形成的分子機(jī)制。

編碼Ⅰ型和Ⅱ型角蛋白的基因在哺乳動(dòng)物基因組中分別組織成緊湊的基因簇。在人類基因組中，除K18 基因外，Ⅰ型和Ⅱ型角蛋白基因分別聚集在17號和12號染色體的長臂上[21-22]。本研究采用生物信息學(xué)方法在雞中鑒定出14個(gè)Ⅱ型KRT 基因家族成員，它們均分布在雞的第34號染色體上，分布集中且類似于哺乳動(dòng)物的分布模式。在這些基因中，KRT8、LOC107055419和LOC768978基因均有2個(gè)可變剪接異構(gòu)體，共編碼17種蛋白質(zhì)。雞的Ⅱ型KRTs 核苷酸序列差異較大，但編碼區(qū)堿基組成相似；在轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)構(gòu)、保守基序、結(jié)構(gòu)域、二級和三級結(jié)構(gòu)等方面存在一定的可變性，但整體上一致性較高。對其編碼的17 種蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明：雞Ⅱ型KRTs 的氨基酸組成差異較大。在人中，Ⅰ型角蛋白為酸性，Ⅱ型角蛋白為中性和堿性[6]；然而，本研究發(fā)現(xiàn)：雞Ⅱ型角蛋白KRT7、KRT-75、KRT8.1、KRT8.2、LOC431300和LOC11252-9929的等電點(diǎn)均小于6.5，偏酸性，這可能是由于離子鍵、氫鍵和疏水鍵的差異導(dǎo)致蛋白質(zhì)的pH 值在雞與人類之間存在差異[23]。生物大分子的穩(wěn)定性會(huì)影響蛋白的功能、活性及調(diào)控特性[24]。本研究發(fā)現(xiàn)：雞Ⅱ型KRTs 的不穩(wěn)定性均大于40，表明它們是不穩(wěn)定蛋白，性質(zhì)容易發(fā)生變化，但具體原因仍需進(jìn)一步研究。此外，該家族基因編碼的蛋白均為親水蛋白，具有較強(qiáng)的可塑性，能夠通過選擇和進(jìn)化更快地適應(yīng)環(huán)境。雞Ⅱ型KRTs 的相對分子質(zhì)量最低為49.85 ku，這與已有研究結(jié)果[22]一致。

系統(tǒng)發(fā)育分析對于揭示物種間的進(jìn)化關(guān)系具有重要意義，位于同一進(jìn)化樹分支上的蛋白質(zhì)可能具有相似的結(jié)構(gòu)和功能[25-26]。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示：小鼠與人的進(jìn)化模式相似，但相較于人和鼠，雞Ⅱ型KRT 家族成員減少，可能是由于經(jīng)歷了更大的選擇壓力。本研究還表明：雞的KRT-71、KRT75L1 和KRT75L2 基因可能較為古老，與HO等[21]對兩棲類的研究結(jié)果不一致，他們發(fā)現(xiàn)：KRT8、KRT7、KRT6A、KRT6B 和KRT6C基因較為古老。與哺乳動(dòng)物相比，Ⅱ型角蛋白基因可能在雞的進(jìn)化過程中發(fā)揮了更大的作用。對絨山羊的研究表明：KRT5、KRT10 和KRT71 在卷毛中國棕褐色綿羊的生長期表達(dá)水平較高，揭示了KRT71基因與卷毛表型之間的遺傳關(guān)系[27]。BAO等[4]研究表明：Ⅱ型KRTs 在牦牛毛囊的不同發(fā)育時(shí)期具有不同的表達(dá)模式。對雞Ⅱ型KRT 家族的進(jìn)化分析有助于推測雞中相近基因的功能，為后續(xù)研究提供參考。

在生物進(jìn)化過程中，片段重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)有助于加速基因家族的擴(kuò)張，獲得新的基因功能，基因在重復(fù)過程中會(huì)發(fā)生遺傳變異，引起功能分歧，隨后經(jīng)純化選擇，這些功能得以保留[25]。雞種內(nèi)共線性分析結(jié)果顯示：Ⅱ型KRTs 沒有出現(xiàn)片段重復(fù)現(xiàn)象，但在與火雞、日本鵪鶉和野鴨的種間共線性分析中發(fā)現(xiàn)了片段重復(fù)，而雞與孔雀間未發(fā)現(xiàn)基因的片段重復(fù)。雞Ⅱ型KRT 家族蛋白包含F(xiàn)ilament、Filament superfamily 和Keratin_2_head保守結(jié)構(gòu)域，9個(gè)蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，8個(gè)蛋白定位于細(xì)胞核，除KRT6A 和KRT75 有1 次跨膜外，其余成員均無跨膜結(jié)構(gòu)。綜合分析表明：雞Ⅱ型KRTs 在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)共同調(diào)節(jié)表皮及其附屬物的生長發(fā)育和分子活性，可能在雞羽毛的生長發(fā)育和結(jié)構(gòu)完整性中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，在雞基因組數(shù)據(jù)中鑒定出14個(gè)Ⅱ型KRTs，這些基因均成簇分布在雞的第34號染色體上。雞Ⅱ型KRTs 在編碼區(qū)核苷酸組成和轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)構(gòu)上具有較高的一致性，但基因間序列差異較大。雞Ⅱ型KRTs 的氨基酸組成和等電點(diǎn)存在一定差異，但其他理化特征和結(jié)構(gòu)一致性較高。這些蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)共同發(fā)揮生物學(xué)功能。雞Ⅱ型KRT 基因家族成員較少，可能經(jīng)歷了更強(qiáng)的選擇壓力。雞的Ⅱ型KRTs 作為細(xì)胞骨架的主要組分，在羽毛結(jié)構(gòu)的完整性方面發(fā)揮重要的作用。

責(zé)任編輯：何謦成