關鍵詞： 丁酸梭菌；貯存穩(wěn)定性；制粒穩(wěn)定性；肉雞；腸道菌群

中圖分類號： S831.92 文獻標志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 06?0075?07

近年來，飼用益生菌在安全性、功能性及加工性方面的篩選、評估與應用，已成為畜禽養(yǎng)殖及飼料行業(yè)的熱點之一[1-2]。丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum） 為梭菌屬（Clostridium） 益生菌，因其優(yōu)良的安全性，成為人類醫(yī)學中最早應用的益生菌之一[3]，并于2008 年被列入《飼料添加劑品種目錄》[4]。隨著中國飼料行業(yè)“禁抗”政策的實施，丁酸梭菌在抑制畜禽腸道有害菌、調控腸道菌群等方面的益生功能逐漸被發(fā)掘[5-10]，這一機制是飼用丁酸梭菌制劑改善畜禽生產性能的重要途徑[11-16]。然而，現有的丁酸梭菌在肉雞養(yǎng)殖中的應用研究存在2 個主要問題：第一，丁酸梭菌在肉雞飼料中的添加劑量范圍較寬，從104～107 CFU/g（全價配合飼料） 不等[6-9]；第二，盡管大量研究表明飼用丁酸梭菌能顯著降低肉雞腸道大腸桿菌的數量[8-11]，但也有研究顯示其未能顯著抑制大腸桿菌[6， 15-16]。這導致丁酸梭菌在改善肉雞生長性能方面的研究結果并不一致。

國際益生菌與益生元科學聯(lián)合會于2014 年發(fā)布的《益生菌的科學共識》指出：只有當腸道中益生菌的數量足夠且處于活性狀態(tài)時，才能發(fā)揮其正常的益生功能[17]。由于大多數畜禽飼料需要制粒加工和貯存，因此，評估包括丁酸梭菌在內的益生菌飼料添加劑的穩(wěn)定性具有重要意義，這是研究其添加量及抑菌功能的基礎?；诖耍狙芯客ㄟ^動物試驗評估丁酸梭菌對肉雞生長性能和腸道菌群的影響，并對丁酸梭菌制劑的制粒及貯存穩(wěn)定性進行分析，以期為完善其應用技術提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

丁酸梭菌菌株從云南省西雙版納州西雙版納云嶺茶花雞產業(yè)發(fā)展有限公司茶花雞養(yǎng)殖場的糞便中分離獲得，并經16S rRNA 基因鑒定，編號為YNAU 5738。該菌株在云南師范大學制備成丁酸梭菌干粉制品（總菌數 7.05×109 CFU/g），并當天用于試驗組飼糧的配制。

1.2動物飼養(yǎng)試驗

1.2.1試驗設計

按照體質量一致的原則，將200 只健康的1 日齡愛拔益加（Arbor Acres，AA） 肉公雞分為2個處理組，每個組設10個重復，每個重復10只。對照組飼喂基礎飼糧；參考周琳[9]的研究，試驗組在基礎飼糧中添加丁酸梭菌制品1.42kg/t （丁酸梭菌添加量為1.00×10⁷ CFU/g 全價配合飼料）。

1.2.2試驗飼糧

基礎日糧參照《雞飼養(yǎng)標準》（NY/T33—2004）制定，其組成及營養(yǎng)水平見表1。基礎飼糧中不添加抗生素、其他飼用益生菌及抑菌性功能添加劑。兩組飼糧在82 ℃ 條件下制粒，并由昆明滇福飼料有限公司生產。

1.2.3飼養(yǎng)管理

試驗在云南農業(yè)大學附屬試驗雞場進行。所有試驗雞采用籠養(yǎng)，試驗期間自由采食和飲水，并保持24 h 光照。免疫程序按照雞場的標準進行，定期進行清掃和消毒。試驗周期為21 d。

1.3測定指標

1.3.1 生長性能測定

每個處理組以重復為單位，統(tǒng)計體質量、平均日增量、平均日采食量和料重比；以組為單位，計算死亡率。

1.3.2 腸道菌群檢測

21 日齡稱量質量后，每個處理組從10 籠中各挑選1 只雞屠宰（N=10）。取肉雞盲腸食糜樣本，采用平板計數法檢測大腸桿菌、乳酸桿菌和丁酸梭菌的總菌數。大腸桿菌使用伊紅美藍瓊脂檢測，乳酸桿菌使用乳酸桿菌選擇性瓊脂檢測[18]；丁酸梭菌使用胰蛋白胨—亞硫酸鹽—環(huán)絲氨酸（tryptone-sulfite-cycloserine，TSC） 基礎瓊脂檢測，具體步驟參考《飼料添加劑 丁酸梭菌》（T/CSWSL006—2019）[19]。

1.3.3丁酸梭菌對大腸桿菌抑制作用的體外評估

為了客觀反映腸道食糜中不同數量級丁酸梭菌對大腸桿菌的抑制作用，采用牛津杯抑菌法體外比較丁酸梭菌對不同密度大腸桿菌的抑菌效果。具體方法為：丁酸梭菌培養(yǎng)液的總菌數為2.5×10⁶ CFU/mL，按照丁酸梭菌與大腸桿菌K88為1.0∶1.0 和0.1∶1.0進行試驗，分別將大腸桿菌K88 涂布至密度為2.5×10⁶ 和2.5×10⁷ CFU/mL的平板上，再進行牛津杯抑菌試驗。通過測量抑菌圈直徑（diameter of inhibition zone，DIZ），比較丁酸梭菌對不同密度大腸桿菌的抑菌作用。

牛津杯抑菌試驗步驟及標準參考課題組前期報道[20]，簡述如下：依據實測的丁酸梭菌培養(yǎng)液總菌數（2.5×10⁶ CFU/mL），將LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24h的大腸桿菌K88 （菌株編號ATCC 25922） 密度稀釋至2.5×10⁶ 和2.5×10⁷ CFU/mL，隨后取每種密度的大腸桿菌培養(yǎng)液200μL 涂布于2個平板上。每個平板中放置2 個牛津杯，分別加入無菌蒸餾水（對照組） 和丁酸梭菌菌液（試驗組） 200 μL，于37.5 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h。使用游標卡尺測量DIZ，并根據DIZ 判定抑菌作用。判定標準為：DIZ=7.8 mm，為不敏感；7.8 mm12.0mm，為高敏感。

1.3.4 丁酸梭菌制品的制粒穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性評估

在試驗的第1天和第21天，現場采集試驗組顆粒料樣品，檢測當天的丁酸梭菌總菌數，以評估丁酸梭菌制品的制粒穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性。同時，在第1 天和第21天檢測丁酸梭菌干粉制品（留樣） 中的總菌數，以評估制品的貯存穩(wěn)定性。丁酸梭菌總菌數的檢測方法參照《飼料添加劑 丁酸梭菌》（T/CSWSL 006—2019）[19]。

1.4 數據處理與統(tǒng)計分析

除肉雞死亡率外，其他檢測指標的數據均采用獨立樣本t 檢驗進行分析。統(tǒng)計分析使用SAS9.2 軟件，Plt;0.05 表示差異顯著，0.05lt;Plt;0.10表示存在差異的趨勢。

2 結果與分析

2.1 飼糧添加丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響

由表2可知：與對照組相比，試驗組肉雞的平均日增量和平均采食量顯著增加（Plt;0.05），但料重比無顯著差異（Pgt;0.05）。對照組肉雞死亡率為3.00%，而試驗組未發(fā)生死亡。

2.2 飼糧添加丁酸梭菌對肉雞腸道菌群的影響

由表3 可知：試驗組肉雞盲腸食糜中的乳酸桿菌總菌數顯著高于對照組（Plt;0.05）；盡管試驗組盲腸食糜中的大腸桿菌總菌數呈下降趨勢（P=0.068），但差異未達到顯著水平；此外，試驗組肉雞盲腸食糜中丁酸梭菌的總菌數為2.82×10⁴ CFU/g（lg=4.45），而對照組盲腸食糜中丁酸梭菌的總菌數僅為5.01×10¹ CFU/g （lg=1.69）。

2.3 丁酸梭菌對大腸桿菌的抑菌作用

由表4 和圖1 可知：當丁酸梭菌與大腸桿菌K88 按1.0∶1.0 進行牛津杯體外抑菌試驗時，抑菌圈直徑（DIZ） 為12.14 mm，抑菌作用為高敏感； 當丁酸梭菌與大腸桿菌K88 的比例為0.1∶1.0 時，DIZ 值顯著降低至10.42 mm （Plt;0.05），抑菌作用為中敏感；無菌蒸餾水對大腸桿菌K88的抑制作用為不敏感（DIZ=7.80 mm）。

2.4 丁酸梭菌制品的制粒及貯存穩(wěn)定性

由圖2a 可知：與飼糧中添加的丁酸梭菌量（第0 天1.00×10⁷ CFU/g 全價配合飼料） 相比，試驗組第1 天制粒顆粒料中的丁酸梭菌總菌數降至5.57×10⁶ CFU/g， 顯著降低了44.13% （Plt;0.05）；顆粒料經21d 貯存后， 丁酸梭菌總菌數降至4.38×106 CFU/g，進一步降低了21.36% （Plt;0.05）。由圖2b可知：丁酸梭菌制品在第1 天的總菌數為7.05×10⁹ CFU/g；經過21d 貯存后，第21天的總菌數為5.29×10⁹ CFU/g，顯著下降了24.96%（Plt;0.05）。

3 討論

3.1 飼糧添加丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響

研究表明：肉雞飼糧中丁酸梭菌的添加量為104～106 CFU/g （全價配合飼料）。本研究參考周琳[9]和王成森[21]的報道，在試驗組飼糧中添加了1.00×10⁷ CFU/g 丁酸梭菌制品，結果顯示：與對照組相比，飼喂丁酸梭菌制品的試驗組肉雞平均日增量和平均日采食量分別顯著增加了5.74% 和7.14%，這與前人的研究結果[7-8]相符；且試驗組肉雞未發(fā)生死亡，表明飼喂丁酸梭菌有效降低了肉雞的死亡風險。這說明丁酸梭菌對肉雞的體質量、采食量、死亡率等生長性能指標有顯著的改善作用。此外，1～21 日齡試驗組肉雞的料重比與對照組無顯著差異，這與前人的研究結果[10， 13-14]一致。然而，也有研究表明：飼用丁酸梭菌可顯著降低肉雞的料重比。徐晨希[12]的研究顯示：飼用丁酸梭菌顯著降低了1～21 日齡AA 肉雞的料重比；鞠孜敬[22]的研究結果表明：與對照組相比，飼用丁酸梭菌（菌株編號：AQQF01000149）可改善1～30 日齡AA 肉雞的料重比；肖克權等[23]的研究也表明：飼用丁酸梭菌可顯著降低1～20日齡麻雞的料重比。

3.2 飼糧添加丁酸梭菌對肉雞腸道菌群的影響

乳酸桿菌是腸道主要有益菌群中的優(yōu)勢菌種，其在食糜中的總菌數增加被認為是肉雞腸道健康和生長性能改善的關鍵標志；相反，食糜中大腸桿菌的總菌數增加會對肉雞的腸道健康和生長性能產生負面影響[24-25]。與對照組相比，飼喂丁酸梭菌制品的試驗組肉雞盲腸食糜中乳酸桿菌的總菌數顯著增加，這與前人的研究結果[6， 8， 10-11， 16]一致。這一作用可能與丁酸梭菌分泌消化酶和增加腸道低聚糖類功能物質有關，從而進一步促進腸道乳酸菌等有益菌的增殖[2， 4-5]。

大量研究表明：飼用丁酸梭菌可顯著降低肉雞腸道有害菌大腸桿菌的數量，是維持腸道形態(tài)及降低料重比的重要機制之一[8， 11]。然而，本研究結果顯示：試驗組肉雞盲腸食糜中的大腸桿菌總菌數僅下降了12.90%，盡管存在一定的降低趨勢，但未達到顯著水平。戴晉軍等[15]研究發(fā)現：與對照組相比，飼糧中添加2×10⁶ CFU/g 丁酸梭菌未能顯著降低21 日齡Cobb肉雞盲腸食糜中的大腸桿菌數量，且對料重比也沒有改善作用。劉婷婷[6]在三黃雞的飼糧中添加1×10⁴ CFU/g 丁酸梭菌，未顯著降低21日齡小雞盲腸食糜中的大腸桿菌數量，且1～21日齡的料重比差異并不顯著。YANG 等[16]在嶺南黃雞的飼糧中添加1×10⁴ CFU/g丁酸梭菌，結果同樣未顯著降低21 日齡雞盲腸食糜中的大腸桿菌數量，也未提高1～21日齡小雞的平均日增量。推測丁酸梭菌作用效果不盡一致的原因包括以下2個方面。第一，丁酸梭菌的穩(wěn)定性差異。一般而言，芽孢桿菌屬的飼用益生菌具有較好的制粒和貯存穩(wěn)定性。制粒后，益生菌能在腸道中保持足夠的數量，從而發(fā)揮抑制腸道有害菌、分泌促生長物質等作用，進而穩(wěn)定地改善畜禽生產性能。相反，非芽孢桿菌屬的益生菌（如酵母菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌等） 在制粒和貯藏過程中穩(wěn)定性較差，若未進行穩(wěn)定性處理，可能會影響其在飼料中的直接應用[26-27]。目前，關于丁酸梭菌制劑的制粒和貯藏穩(wěn)定性報道較少。第二，丁酸梭菌菌株的抑菌性能差異。肖海蒂[28]評估了3 株丁酸梭菌（菌株編號分別為D-2、D-8、D-19） 對大腸桿菌的抑制作用，其中2 株表現為高敏感，1 株為中敏感。

3.3 丁酸梭菌對大腸桿菌的抑制作用及效果評估

在本研究中，鑒于試驗組肉雞盲腸食糜中丁酸梭菌的總菌數為2.82×10⁴ CFU/g、大腸桿菌總菌數為5.62×10⁵ CFU/g，丁酸梭菌的總菌數較大腸桿菌的總菌數低1 個數量級，因此，在體外牛津杯抑菌試驗中，將丁酸梭菌與大腸桿菌K88 的比例調整為1.0∶1.0 和0.1∶1.0，通過抑菌圈直徑（DIZ） 來評估腸道中丁酸梭菌的有效數量對大腸桿菌抑菌效果的差異。結果顯示：當丁酸梭菌與大腸桿菌K88 按1.0∶1.0 進行牛津杯體外抑菌試驗時，DIZ 為12.14 mm，表現為高敏感；而當丁酸梭菌與大腸桿菌K88 按0.1∶1.0 進行試驗時，DIZ 顯著減小至10.42 mm，抑菌效果降為中敏感。謝麗靜等[29]采用牛津杯法，在牛津杯中加入培養(yǎng)48 h 的丁酸梭菌上清液240 μL，結果顯示其對大腸桿菌（10⁶ CFU/mL） 的DIZ 為13.82 mm。費中杰[30]的研究表明：丁酸梭菌菌液200 μL 可對大腸桿菌（10⁶ CFU/mL） 表現出顯著的抑制作用。劉歡歡等[31]在抑菌試驗中加入丁酸梭菌菌液100 μL，結果顯示其對大腸桿菌的DIZ 為8 mm，未表現出抑制作用。盡管目前尚無丁酸梭菌與指示菌密度比例的相關報道，但以上結果表明：丁酸梭菌對大腸桿菌的抑制效果不僅與菌株特性相關，也受到丁酸梭菌密度（數量級） 的影響。這一結論為進一步分析丁酸梭菌制品的制粒及貯存穩(wěn)定性提供了科學依據。

3.4 丁酸梭菌制品的制粒及貯存穩(wěn)定性評估

本研究中，試驗組飼糧中丁酸梭菌制品的添加量為1.00×10⁷ CFU/g，即使考慮肉雞食糜高水分（約60%～85%） 的情況[32]，盲腸食糜丁酸梭菌總菌數應為10⁵～10⁶ CFU/g，顯然本研究試驗組肉雞腸道丁酸梭菌檢測值（2.82×10⁴ CFU/g） 偏低。課題組前期報道了在仔豬飼糧中添加穩(wěn)定性較好的飼用凝結芽孢桿菌1.00×10⁷ CFU/g，其盲腸食糜中可檢測到較高數量級的凝結芽孢桿菌（0.93×10⁶ CFU/g）[18]。鑒于此，本研究進一步評估了丁酸梭菌制品的制粒穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性，結果顯示：與制粒前相比，試驗組飼糧制粒后的丁酸梭菌總菌數降低了44.13%；顆粒料貯存21 d 后，丁酸梭菌總菌數進一步降低了21.36%。說明試驗所用的丁酸梭菌制品在制粒及貯存過程中損失較大，穩(wěn)定性較差。韋曉芳等[33]研究顯示：試驗組雞飼糧中添加丁酸梭菌5.00×10⁵ CFU/g，制粒后實測顆粒料中的丁酸梭菌總菌數為2.88×10⁵ CFU/g，減少了42.40%。王騰浩[34]報道：將丁酸梭菌（菌株編號：ZJU-F1） 在80～85 ℃ 水浴處理后，總菌數降低72.59%～80.00%。關青龍[35]的研究顯示：丁酸梭菌在90 ℃ 水浴處理15 min 后，總菌數損失為68.3%。賈麗楠等[36]報道：將丁酸梭菌制品在85 ℃ 水浴處理7.5 min 后，丁酸梭菌總菌數降低了53.65%。此外，本研究發(fā)現丁酸梭菌制品貯存21d后，總菌數降低了24.96%。以上分析表明：作為嚴格厭氧的丁酸梭菌，其制品易受到氧氣、溫度等因素的影響，導致制粒穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性較差。結合抑菌效果的差異，充分說明本研究的丁酸梭菌制劑存在較大的制粒和貯藏損失，并且在腸道中的數量級偏低，這在一定程度上影響了丁酸梭菌制劑對大腸桿菌的抑制效果。這一結論也揭示了當前丁酸梭菌在肉雞飼料中添加劑量過于寬泛的潛在原因。

4 結論

本研究所用丁酸梭菌對肉雞的生長性能和腸道菌群具有一定的改善作用。然而，制粒和貯存的穩(wěn)定性問題導致丁酸梭菌在肉雞腸道中的數量較低，進而影響了其對腸道大腸桿菌的抑制效果。因此，改善丁酸梭菌菌株的耐熱性及其制品的貯存性，是篩選和應用優(yōu)質丁酸梭菌飼料添加劑的重要方向之一。

責任編輯：何承剛