【目的】研究中華蜜蜂（Apis cerana cerana） 蜂群急造王臺過程中子代蜂王及其撫育工蜂的父系分布規(guī)律?！痉椒ā客ㄟ^人工操作使4 群（A～D） 中華蜜蜂失去蜂王，蜂群利用本群幼蟲急造王臺，并采集子代蜂王及其撫育工蜂樣本。采用微衛(wèi)星簡單重復(fù)序列（simple sequence" repeats，SSR） 分子標(biāo)記和毛細管電泳技術(shù)檢測樣本基因型，使用MateSoft 軟件判定父系歸屬，并通過卡方檢驗分析父系分布規(guī)律?！窘Y(jié)果】在4 個試驗群中，分別發(fā)現(xiàn)16～34個父系，各群產(chǎn)生的子代蜂王來自3～13個父系，占總父系數(shù)量的17.6%～38.2%；撫育工蜂幾乎遍布所有父系，卡方檢驗結(jié)果顯示：P_WA群=0.9456、P_WB群=0.0059、P_WC群=0.1454、P_WD群=0.7873；子代蜂王與其撫育工蜂之間的同一父系比例范圍為0%～20%?！窘Y(jié)論】在中華蜜蜂蜂群急造王臺過程中，子代蜂王主要來自少數(shù)父系，而撫育工蜂則幾乎來源于所有父系。子代蜂王與其撫育工蜂之間未表現(xiàn)出顯著的父系關(guān)聯(lián)。

關(guān)鍵詞： 中華蜜蜂；子代蜂王；撫育工蜂；父系；微衛(wèi)星分子標(biāo)記

中圖分類號： S891 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 06?0082?08

中華蜜蜂（Apis cerana cerana）， 簡稱為中蜂，是蜜蜂屬（Apis） 東方蜜蜂種下的1 個重要亞種。其蜂群為基本生存單位，具有明顯的“勞動分工”特征，體現(xiàn)了高度社會化的群居生活[1]。為了適應(yīng)這一生存和繁殖方式，中華蜜蜂采用獨特的多雄交尾機制[2]。1 只中蜂蜂王通常會與6～27只雄蜂交尾[3]，這種一雌多雄的交尾方式導(dǎo)致蜂群內(nèi)出現(xiàn)多個不同父系。同母同父的后代屬于同一父系，也稱為全同胞姐妹，親緣系數(shù)為0.75；同母異父的后代屬于不同父系，為半同胞姐妹，親緣系數(shù)為0.25。與單一或少數(shù)父系遺傳結(jié)構(gòu)相比，多個父系帶來的遺傳多樣性更有利于蜜蜂群體的生存和發(fā)展[4-6]。例如：蜂群中不同父系的工蜂對溫度的敏感閾值存在差異，當(dāng)蜂巢內(nèi)的溫度升高到一定值時，并非所有工蜂同時開始調(diào)節(jié)溫度，而是由特定父系的工蜂率先啟動“煽風(fēng)降溫”機制，調(diào)節(jié)蜂巢內(nèi)的溫度[4]，這有助于避免巢溫劇烈波動，以維持蜂巢內(nèi)溫度的相對穩(wěn)定。

蜂群中的不同父系個體之間也存在潛在的競爭。例如：當(dāng)蜂群意外失王或蜂王出現(xiàn)病、老、傷、殘等情況時，撫育工蜂必須盡快培育新的子代蜂王，否則整個蜂群將面臨滅亡的威脅。由于資源（如食物、空間、撫育工蜂數(shù)量等） 有限，且蜂群內(nèi)存在多個父系，選擇哪些幼蟲培育為新的蜂王變得復(fù)雜。此時，撫育工蜂面臨3 種選擇：第一是向親選擇[7-8]，即培育與自己屬于同一父系的全同胞姐妹幼蟲為子代蜂王；第二是向優(yōu)選擇，即以蜂群整體利益為主，不考慮親緣關(guān)系，選擇質(zhì)量最優(yōu)的幼蟲[9]，通常選擇3 日齡內(nèi)的小幼蟲作為候選對象[10]；第三是隨機選擇[11]。針對這一問題，前人以西方蜜蜂（A. mellifera） 為材料進行了大量研究。部分研究結(jié)果表明：蜂群在培育子代蜂王時確實存在向親選擇的現(xiàn)象[7-8， 12-13]；然而，另一些學(xué)者的研究結(jié)果則顯示：撫育工蜂與子代蜂王之間并未表現(xiàn)出顯著的同父系關(guān)系[14-16]，故不支持蜂群育王過程中“向親選擇”的觀點。最近的研究提出了“貴族父系”理論，認為蜂群中可能存在少數(shù)隱秘的貴族父系，這些父系的子代蜂王被選中的概率顯著高于其他父系[17-18]。因此，目前關(guān)于蜜蜂育王過程中子代蜂王及其撫育工蜂的父系分布規(guī)律尚未形成一致的學(xué)術(shù)觀點。

工蜂在撫育子代蜂王時的選擇標(biāo)準(zhǔn)至關(guān)重要，它直接決定了蜂群的未來命運。這不僅是社群生物學(xué)研究的重要科學(xué)問題，其研究結(jié)果也將為蜜蜂育種技術(shù)的發(fā)展提供關(guān)鍵的理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)有研究主要以西方蜜蜂為材料，采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記分辨蜜蜂個體的父系歸屬。本研究以中國本土的中華蜜蜂為試驗對象，采用急造王臺時的人工育王方法采集子代蜂王及其撫育工蜂樣本，并通過微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)進行基因分析，以判定其父系歸屬。研究結(jié)果將為進一步揭示蜜蜂社群在育王過程中的子代蜂王選育規(guī)律提供有力的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本研究于2019年6—8月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗蜂場進行。使用4 群中華蜜蜂（A、B、C、D），群勢為56足脾，蜜粉充足。使用囚王籠將蜂王囚禁于邊脾，18～24 h 后將帶有蠟質(zhì)王臺的育王框置于蜂箱中的脾位。4～5 h 后，選取2 日齡小幼蟲并將其移入蠟質(zhì)王臺內(nèi)，移蟲完成后立即將育王框放回原群進行撫育。24 h 后取出育王框，用鑷子采集伸進王臺內(nèi)的撫育工蜂并浸于無水乙醇中備用，每個王臺采集10只撫育工蜂，A、B、C、D 群分別采集到撫育工蜂40、169、45、30 只。72 h 后，將封蓋的王臺轉(zhuǎn)移至溫度為（34.5±0.1） ℃、濕度為75%±5% 的恒溫培養(yǎng)箱中培育，A、B、C、D 群共成功培育出子代蜂王4、17、5、3 只。剛出房的處女蜂王與之前采集的撫育工蜂對應(yīng)記錄并浸于無水乙醇中備用。

1.2 DNA提取

采用天根生化科技有限公司提供的血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒，對所有子代新蜂王及其對應(yīng)的撫育工蜂樣本進行全基因組DNA提取。

1.3 PCR 擴增及產(chǎn)物分型

PCR 引物為周丹銀等[19]研究中的4個微衛(wèi)星位點（表1），每對引物中的上游引物添加了6-Fam 熒光標(biāo)記，由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系包括：約40 ng/μL DNA模板2.0 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0.8 μL，5 U/μL Taq 酶（Takara） 0.2 μL，2.5 mmol/L dNTP1.6 μL，25 mmol/L MgCl2 1.2～1.6 μL，10×PCR 緩沖液（不含Mg2+） 2.0 μL， 加入超純水補足至20.0 μL。PCR 反應(yīng)在避光條件下進行，擴增條件為：95 ℃ 預(yù)加熱5 min，95 ℃ 變性1 min，68.6～70.5 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，循環(huán)32 次，最后72 ℃ 延伸5 min。PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海） 股份有限公司進行毛細管電泳分型。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用GeneMapper 3.7軟件對原始峰圖進行解析并生成Excel 格式數(shù)據(jù)，隨后人工校對形成分析數(shù)據(jù)。利用MateSoft V1.0軟件[20]推測母蜂王基因型，并根據(jù)母蜂王等位基因判定子代蜂王及其撫育工蜂的父系歸屬（當(dāng)個體與母蜂王在某微衛(wèi)星位點上的2個等位基因完全相同時，無法確定父系等位基因，MateSoft 將按“最少父系數(shù)”原則進行分析）。通過SigmaPlot 14.0軟件統(tǒng)計各試驗群蜜蜂樣本的父系分布情況并進行圖示。以隨機分布為零假設(shè)，使用R 語言V4.0.5對父系分布數(shù)據(jù)進行卡方檢驗。

2 結(jié)果與分析

從試驗蜂群中探測到的父系數(shù)量分別為：A 群17 個、B群34 個、C群27 個、D群16 個，符合前人研究[3]中記錄的父系數(shù)量范圍。

2.1子代蜂王的父系分布

4個試驗蜂群共成功培育出29 只子代蜂王，其中A群4只、B群17只、C群5只、D群3只。由圖1可知：所有試驗群的子代蜂王均來自多個父系，并大致平均分布在這些父系之間。卡方檢驗結(jié)果顯示：P_QA群=0.7788、P_QB群=0.982 9、P_QC群=0.896 4、P_QD群=1.0000，均呈現(xiàn)隨機分布態(tài)勢。然而，子代蜂王的父系僅占蜂群父系的部分。具體分布為：A群來自3個父系，占本群父系數(shù)量的17.6% （3/17）；B群來自13個父系，占本群父系數(shù)量的38.2% （13/34）；C群來自5 個父系，占本群父系數(shù)量的18.5% （5/27）；D 群來自3 個父系，占本群父系數(shù)量的18.8% （3/16）。

2.2 撫育工蜂的父系分布

4個試驗蜂群共采集到284 只撫育工蜂，其中A群40只、B群169只、C群45 只、D群30 只。由圖1 可知：撫育工蜂幾乎來自本群所有父系，但不同父系的分布頻率存在差異?？ǚ綑z驗結(jié)果顯示： P_WA群=0.9456、P_WB群=0.0059、P_WC群=0.1454、P_WD群=0.7873，除B群外，其他群體均呈隨機分布態(tài)勢。

2.3子代蜂王及其撫育工蜂的父系分布

對各試驗群的子代蜂王及其撫育工蜂的父系分布數(shù)據(jù)進行了綜合分析，結(jié)果（表2～5） 顯示：每只子代蜂王的10只（個別為9只） 撫育工蜂中，最多2只（20%）、最少0只（0%） 與其歸屬于同一父系。子代蜂王與其撫育工蜂之間未表現(xiàn)出顯著的全同胞關(guān)系，更傾向于隨機分布。

3 討論

對于以社群為生存基本單位的社會性昆蟲而言，蜂王（或蜂后） 的質(zhì)量直接關(guān)系到整個群體的命運。優(yōu)質(zhì)的蜂王（或蜂后） 能夠提高群體的群勢，增強抗逆性和抗病性，從而提高群體的生存適應(yīng)度[21]。在多父（母） 系遺傳背景下，哪些父（母） 系的個體更可能被選為子代新王（后）？而撫育者又來自哪些父（母） 系的成員？這是社群生物學(xué)中的重要科學(xué)問題。HALMITON 提出的內(nèi)涵適應(yīng)度學(xué)說認為：社群性生物的利他主義行為旨在增加其基因在后代中的頻率，因此，這種行為偏向于發(fā)生在親緣關(guān)系較近的家庭成員之間[22]。根據(jù)這一理論，社群中負責(zé)撫育任務(wù)的成員應(yīng)偏向于培養(yǎng)與自己有較高親緣關(guān)系的全同胞個體成為子代新王，以擴大自身等位基因在群體中的出現(xiàn)頻率，增加群體的內(nèi)涵適應(yīng)度，而在以蜜蜂[7-8， 12]、白蟻[23]等社會性昆蟲為試驗對象的研究中，確實發(fā)現(xiàn)了支持“向親選擇”理論的結(jié)果。研究者們還提出：昆蟲幾丁質(zhì)外殼中的碳氫化合物可能是介導(dǎo)個體間識別親疏遠近的線索[24-25]。然而，隨后逐漸有支持不同觀點的研究結(jié)果出現(xiàn)。CHLINE等[15]使用西方蜜蜂進行試驗時，發(fā)現(xiàn)撫育工蜂并不傾向于優(yōu)先照顧同父系的子代蜂王；GOODISMAN等[26]則發(fā)現(xiàn)胡蜂（Vespula maculifrons） 中不存在向親選擇；ZINCK 等[27]也指出：螞蟻（Ectatommatuberculatum） 工蟻在照顧蟻后時并未表現(xiàn)出向親選擇的行為。在本研究中，80%～100%的撫育工蜂與所撫育的子代蜂王歸屬于不同的父系，未表現(xiàn)出向親選擇的傾向，這一結(jié)果與前述研究[14-16]一致。

影響父系歸屬判定的因素主要包括以下3個方面。（1） 數(shù)據(jù)樣本量。1個王臺從被選定到封蓋前，平均接受約2 000 次撫育照顧[28]，包括飼喂、清理、溫控等，參與撫育的工蜂超過百只（群勢不同，數(shù)量有差異）。試驗中采集的撫育工蜂樣本有限，過度捕捉會顯著減少王臺的撫育照顧，進而影響子代蜂王的成活率，這可能導(dǎo)致某些父系未被采樣，進而影響研究結(jié)果的代表性。（2） 父系判定的技術(shù)和方法。早期研究使用等位酶[29-30]、腹部背板顏色[31-33]等作為父系標(biāo)記，精確度較低；隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微衛(wèi)星標(biāo)記已廣泛用于父系鑒定[34-36]，提高了精確度，但仍然存在長度趨同性[37]、無效等位基因等問題，可能導(dǎo)致父系誤判。（3） 實驗設(shè)計與操作。蜂群在分蜂、新老蜂王交替或母蜂王意外死亡等情況下都會建立王臺并培育子代蜂王，此時，蜂群所面臨的生存條件（如溫度、食物、群勢等） 差異較大，可能會影響蜂群選擇子代蜂王的標(biāo)準(zhǔn)和原則。因此，模擬蜂群分蜂的實驗設(shè)計[31， 36]和模擬母蜂王發(fā)生意外的實驗設(shè)計[8， 38]可能得出不同的結(jié)論。此外，在自然狀態(tài)下，蜂群育王通常在蜂巢內(nèi)黑暗且穩(wěn)定的巢溫條件下進行，而在試驗中，為了獲取撫育工蜂的行為數(shù)據(jù)，育王過程往往暴露于可見光和外界溫度下[16， 36， 39]，這可能對撫育工蜂的行為產(chǎn)生影響。一些實驗設(shè)計采用人工移蟲提供幼蟲[12， 14， 16， 40]，這限制了子代蜂王的候選父系；而另一些實驗則采用工蜂自然改造的王臺[13， 17-18]，進而導(dǎo)致父系歸屬判定產(chǎn)生差異。

一些學(xué)者提出蜜蜂可能遵循“向優(yōu)選擇”原則培育子代蜂王，因為選擇壓力要求蜂群中的蜂王必須足夠優(yōu)秀，需選出品質(zhì)優(yōu)良的卵或小幼蟲培育為子代蜂王，這一特性可能是進化賦予蜜蜂的生物學(xué)特點。盡管目前尚缺乏直接證據(jù)支持這一觀點，但前人的研究結(jié)果表明：子代蜂王通常只來源于少數(shù)幾個父系[17-18， 21]，因此，有學(xué)者提出蜂群中可能存在隱秘的貴族父系，這一現(xiàn)象被用來支持“向優(yōu)選擇”理論。該理論與本研究所發(fā)現(xiàn)的規(guī)律一致。此外，部分學(xué)者認為撫育工蜂的選擇標(biāo)準(zhǔn)更多是基于食物和營養(yǎng)，而非通過遺傳因素判斷幼蟲的優(yōu)良程度，因此，獲得更多營養(yǎng)的幼蟲可能更容易被培育為子代蜂王[9]。目前關(guān)于“向優(yōu)選擇”理論仍存在諸多未解的問題，包括：（1） 蜂群對“優(yōu)良”標(biāo)準(zhǔn)的具體定義；（2） 撫育工蜂如何感知并判斷卵或幼蟲是否優(yōu)良。

綜上所述，關(guān)于蜂群在多父系遺傳背景下如何選擇子代蜂王，仍是亟待進一步研究的科學(xué)問題。今后的研究應(yīng)在實驗技術(shù)上進行改進，以實現(xiàn)在不干擾子代蜂王培育過程的前提下，觀察并記錄工蜂的撫育行為，同時擴大撫育工蜂樣本的采集量。理論上，所有參與撫育子代蜂王的工蜂都應(yīng)當(dāng)進行觀察記錄，并獲取其父系歸屬數(shù)據(jù)。然而，現(xiàn)有的實驗技術(shù)或是在記錄觀察過程中干擾了蜂群的正常秩序，或是進行破壞性采樣，導(dǎo)致樣本個體的后續(xù)撫育行為無法被觀察記錄。開發(fā)一種能夠有效解決這些問題的技術(shù)方法，將對相關(guān)研究的深入突破起到至關(guān)重要的作用。

4結(jié)論

在中華蜜蜂蜂群急造王臺的過程中，子代蜂王主要來源于蜂群中的少數(shù)父系，而撫育工蜂則幾乎遍布于所有父系。子代蜂王與其對應(yīng)的撫育工蜂之間未表現(xiàn)出顯著的同父系關(guān)系。

責(zé)任編輯：何承剛