李兆龍 徐義策 李澤文 周潔

順鉑(cisplatin,CIS)是多種惡性腫瘤的一線化療藥物,可引起進(jìn)行性的、不可逆的和累積性的聽力損傷,這種耳毒性是限制其臨床應(yīng)用的重要原因[1]。目前尚無針對(duì)CIS耳毒性的有效預(yù)防措施,因此有必要尋找減輕或阻止CIS耳毒性的保護(hù)劑,以突破CIS化療的劑量限制。研究[2,3]表明,CIS可在耳蝸中蓄積并長期存在,誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞(cochlear hair cell,CHC)和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neuron,SGN)過度產(chǎn)生并積累活性氧(reactive oxygen species,ROS),導(dǎo)致細(xì)胞丟失或死亡,進(jìn)而損害聽力。中藥提取物紅景天苷(salidroside,SAL)具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、神經(jīng)保護(hù)等功效[4]。已證實(shí),SAL可改善氨基糖苷類藥物[5]及金屬錳[6]的耳毒性,推測(cè)其對(duì)CIS的耳毒性也有改善作用。CHC的支持功能和SGN的傳導(dǎo)功能依賴于細(xì)胞存活,是聽力維持的生理基礎(chǔ)[7]。環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)為重要的第二信使,可誘導(dǎo)蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)/cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein,CREB)信號(hào)通路激活,促進(jìn)下游抗凋亡蛋白(Bcl-2)和神經(jīng)保護(hù)因子(BDNF、NF)的表達(dá),預(yù)防細(xì)胞(包括神經(jīng)元)凋亡,有利于細(xì)胞存活[8,9]。然而,SAL對(duì)CIS耳毒性的改善作用是否與cAMP/PKA/CREB通路有關(guān)并不清楚。故本研究擬采用CIS處理離體耳蝸組織,觀察SAL干預(yù)對(duì)CIS所致CHC、SGN損傷和cAMP/PKA/CREB通路的影響,以探討SAL改善CIS耳毒性的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)新生2 d的C57BL/6小鼠50只,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心饋贈(zèng)。

1.2試劑和儀器 SAL(純度≥98%)購自Sigma公司;特異性cAMP抑制劑SQ22536、PKA抑制劑H-89購自MCE公司;神經(jīng)元β3-tubulin抗體、羊抗兔(Alexa Fluor 647或Alexa Fluo 488或HRP偶聯(lián))IgG抗體、DAPI、NF-M抗體購自CST公司;肌球蛋白(myosin7a,MYO7A)、BDNF抗體、ROS檢測(cè)CellROXTMDeep Green試劑盒購自Invitrogen公司;cAMP ELISA試劑盒、GAPDH抗體、PKA抗體、p-CREB抗體、CREB抗體、Bcl-2抗體購自Abcam公司;化學(xué)發(fā)光試劑購自Millipore公司;蛋白提取試劑購自上海生工公司;激光共聚焦顯微鏡購自奧林巴斯公司;電泳和轉(zhuǎn)膜設(shè)備購自BioRad公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1耳蝸基底膜的分離和培養(yǎng)[10]將新生2 d的C57BL/6小鼠斷頭處死,75%酒精消毒全身后,固定頭部并暴露雙側(cè)顳骨,解剖鏡下分離雙側(cè)聽泡置于Hank’s平衡液中,小心去除螺旋韌帶等,分離出條狀的耳蝸基底膜[含有內(nèi)毛細(xì)胞(IHC)、外毛細(xì)胞(OHC)及SGN]。將耳蝸基底膜(Corti器面朝上)平鋪在含有膠原蛋白的無血清BME培養(yǎng)液凝膠表面,輕壓固定,在培養(yǎng)箱中過夜(37℃,5%CO2)。次日,更換新鮮培養(yǎng)液并加入CIS或SAL進(jìn)行干預(yù)。

1.3.2分組及給藥 隨機(jī)數(shù)字法將耳蝸基底膜分為對(duì)照組(C組)、CIS組、SAL組、SAL+SQ22536(cAMP抑制劑)組和SAL+H-89(PKA抑制劑)組,每組20條。C組僅加入無血清BME培養(yǎng)液;CIS組在培養(yǎng)液中加入15 μmol/L CIS[11];SAL組在CIS組基礎(chǔ)上加入5 μmol/L SAL[7];SAL+SQ22536組在CIS組基礎(chǔ)上加入5 μmol/L SAL和5 μmol/L SQ22536;SAL+H-89組在CIS組基礎(chǔ)上加入5 μmol/L SAL和30 μmol/L H-89。在培養(yǎng)箱中孵育48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3免疫熒光染色 用4%多聚甲醛固定各組耳蝸基底膜(n=10,β3-tubulin、MYO7A各5條),用PBS、Triton X-100處理后,加入羊血清封閉45 min;滴加一抗兔抗小鼠神經(jīng)元β3-tubulin(1∶800)或兔抗小鼠MYO7A(1∶50)作用過夜、滴加二抗(Alexa Fluor 647偶聯(lián)抗兔IgG或Alexa Fluo 488偶聯(lián)抗兔IgG,稀釋比1∶500)避光作用2 h,并用DAPI(1∶1 000)核染色劑作用10 min,封片后在共聚焦顯微鏡下拍照。計(jì)數(shù)CHC(MYO7A標(biāo)記的完整細(xì)胞)和SGN(β3-tubulin標(biāo)記的完整細(xì)胞)數(shù)量。

1.3.4ROS含量檢測(cè) 多聚甲醛固定各組耳蝸基底膜(n=5),用PBS處理后,加入CellROXTMDeep Green工作液(綠色熒光)避光作用30 min,加入DAPI(1∶1 000)核染色劑作用10 min,封片后在共聚焦顯微鏡下拍照。用Image J分析綠色熒光強(qiáng)度,以評(píng)估耳蝸基底膜中ROS含量。

1.3.5cAMP含量檢測(cè) 將處理好的基底膜從凝膠表面小心剝離,用RIPA裂解液裂解各組耳蝸基底膜(n=5),離心上述裂解液,收集上清,按照指導(dǎo)書依次加入cAMP ELISA工作液,在酶標(biāo)儀讀取OD450nm,計(jì)算cAMP含量。

1.3.6Western blot檢測(cè) 收集1.3.5所得裂解液上清并用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。用SDS-PAGE凝膠電泳分離等量的蛋白樣品(30 μg),并轉(zhuǎn)移到PVDF膜;用封閉液(5%脫脂奶粉)封閉后,相繼加入一抗[GAPDH抗體(1∶2 000)、PKA抗體(1∶1 000)、p-CREB抗體(1∶500)、CREB抗體(1∶500)、Bcl-2抗體(1∶500)、BDNF抗體(1∶1 000)、NF-M抗體(1∶1 000)]、HRP標(biāo)記二抗(1∶3 000);用化學(xué)發(fā)光液顯影蛋白條帶并拍照。以GAPDH為內(nèi)參分析PKA等蛋白條帶相對(duì)灰度。

2 結(jié)果

2.1各組基底膜毛細(xì)胞免疫熒光染色觀察結(jié)果 C組耳蝸基底膜中可見三排OHC和單排IHC有序緊致排列,CHC形態(tài)規(guī)則;CIS組CHC排列混亂,分層不清楚,體積腫大;SAL組CHC排列及形態(tài)趨于規(guī)則;SAL+SQ22536組和SAL+H-89組CHC排列及形態(tài)較SAL組差(圖1)。與C組相比,CIS組CHC數(shù)量較少(P<0.05);與CIS組相比,SAL組CHC數(shù)量較多(P<0.05);與SAL組相比,SAL+SQ22536組和SAL+H-89組CHC數(shù)量較少(P<0.05)(表1),說明SAL可以減輕CIS引起的耳蝸毛細(xì)胞損傷。

圖1 各組基底膜免疫熒光染色觀察CHC形態(tài)

表1 各組CHC、SGN數(shù)量及ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度比較

2.2各組基底膜SGN免疫熒光染色觀察結(jié)果 C組耳蝸基底膜中可見密集分布的圓形或橢圓形的SGN,細(xì)胞質(zhì)、核染色均勻,可見大量由胞體延伸出的神經(jīng)突;CIS組個(gè)別SGN細(xì)胞核破碎,大量SGN的神經(jīng)突缺失;SAL組SGN形態(tài)趨于正常;SAL+SQ22536組和SAL+H-89組SGN形態(tài)較SAL組差(圖2)。與C組相比,CIS組SGN數(shù)量較少(P<0.05);與CIS組相比,SAL組SGN數(shù)量較多(P<0.05);與SAL組相比,SAL+SQ22536組和SAL+H-89組SGN數(shù)量較少(P<0.05)(表1),說明SAL可以減輕CIS引起的耳蝸SGN損傷。

圖2 各組基底膜免疫熒光染色觀察SGN形態(tài)

2.3各組ROS含量檢測(cè)結(jié)果 由表1可見,與C組相比,CIS組ROS含量較高(P<0.05);與CIS組相比,SAL組ROS含量較低(P<0.05);與SAL組相比,SAL+SQ22536組和SAL+H-89組ROS含量較高(P<0.05)(圖3、表1),說明SAL可改善GIS引起的氧化損傷。

圖3 CellROXTM Deep Green試劑盒檢測(cè)耳蝸基底膜ROS含量

2.4各組cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路檢測(cè)結(jié)果 由表2可見,與C組相比,CIS組cAMP含量、PKA蛋白及p-CREB/CREB水平較高(P<0.05);與CIS組相比,SAL組cAMP含量、PKA蛋白及p-CREB/CREB水平較高(P<0.05);與SAL組相比,SAL+SQ22536組cAMP含量、PKA蛋白及p-CREB/CREB水平較低(P<0.05),SAL+H-89組PKA蛋白及p-CREB/CREB水平較低(P<0.05)(圖4、表2),說明SAL激活了cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路。

表2 各組cAMP含量、PKA、p-CREB、CREB蛋白水平比較

圖4 Western blot檢測(cè)各組PKA、p-CREB、CREB蛋白水平

2.5各組BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 由表3可見,與C組相比,CIS組BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白水平較高(P<0.05);與CIS組相比,SAL組BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白水平較高(P<0.05);與SAL組相比,SAL+SQ22536組、SAL+H-89組BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白較低(P<0.05)(圖5、表3),說明SAL促進(jìn)了BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白的表達(dá)。

表3 各組BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白水平比較

圖5 Western blot檢測(cè)各組BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白水平

3 討論

據(jù)報(bào)道,約40%～80%的CIS化療患者會(huì)出現(xiàn)永久性聽力損傷[12]。本研究中,CIS組CHC和SGN數(shù)量顯著減少且排列混亂,大量SGN的神經(jīng)突缺失,同時(shí)ROS含量增加了3.8倍,這是因?yàn)槎拘运幬锟梢鸲伣M織中ROS/氮物質(zhì)的積累、線粒體功能障礙等,造成CHC和/或SGN損傷[3,13]。

中藥紅景天具有“扶正益本、補(bǔ)氣生血”等功效,SAL為其糖苷提取物,可通過抗焦亡、抗氧化、抗代謝應(yīng)激等對(duì)大腦[14]、耳[6]、肝臟[15]等產(chǎn)生保護(hù)作用。本研究中SAL的作用濃度為5 μmol/L,這是由于Ding等[5]通過一系列實(shí)驗(yàn)確定了5 μmol/L SAL預(yù)處理能顯著減輕錳誘導(dǎo)的耳毒性,故本實(shí)驗(yàn)中采用這一濃度。既往研究[3,13]已證實(shí),ROS在CIS所致聽神經(jīng)損害中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其水平增加最終導(dǎo)致CHC和SGN凋亡和死亡,抑制其可減輕CIS所致的聽神經(jīng)損害。本研究顯示,與CIS組相比,SAL組ROS含量降低了2.5倍,CHC和SGN數(shù)量和形態(tài)均明顯改善,表明SAL可以降低CIS誘導(dǎo)的CHC和SGN內(nèi)ROS含量,從而起到保護(hù)CHC和SGN的作用,緩解CIS引起的耳毒性。

cAMP/PKA/CREB通路的活化通過PKA介導(dǎo)的CREB磷酸化實(shí)現(xiàn),它作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)各種基因[16]。正常生理環(huán)境下,PKA以無活性的形式存在于細(xì)胞中;遇刺激時(shí),cAMP在細(xì)胞中積累增加,與調(diào)節(jié)亞基結(jié)合釋放出具有活性的PKA,催化CREB蛋白的Ser133發(fā)生磷酸化(p-CREB),p-CREB與BDNF、NF、Bcl-2等靶基因啟動(dòng)子區(qū)特定序列結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,提高細(xì)胞的抗凋亡能力和存活能力[8,9,16],是細(xì)胞損傷后啟動(dòng)的自我修復(fù)。BDNF和NF是重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子,有利于神經(jīng)元的生長、分化和存活,維持神經(jīng)元的功能和可塑性,是細(xì)胞應(yīng)對(duì)多種傷害性刺激的保護(hù)因子[17]。Bcl-2為重要的抗凋亡蛋白,通過阻止細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞存活[8]。本研究結(jié)果中,CIS組耳蝸基底膜中cAMP含量及PKA、p-CREB/CERB、BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白水平增多,可能因?yàn)镃IS產(chǎn)生的ROS等有害物質(zhì)激活了自我保護(hù)性cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路,但不足以抵抗CIS造成的CHC和SGN損傷。而SAL可以進(jìn)一步增加耳蝸基底膜中cAMP含量、PKA、p-CREB/CERB蛋白水平及下游靶蛋白BDNF、NF-M、Bcl-2的表達(dá),說明SAL的保護(hù)作用導(dǎo)致cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路進(jìn)一步活化,有助于減輕多種條件誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[18,19]。本研究還發(fā)現(xiàn),SAL的上述保護(hù)作用可被cAMP抑制劑SQ22536或PKA抑制劑H-89減弱,提示激活cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路可能是SAL改善CIS耳毒性的機(jī)制之一。

綜上所述,SAL可能通過cAMP/PKA/CREB通路促進(jìn)抗凋亡蛋白和神經(jīng)保護(hù)因子表達(dá),緩解CIS引起的CHC和SGN損傷,且SAL也具有抗癌活性[20],并可增強(qiáng)順鉑的抗癌作用[21],提示SAL可能可以作為預(yù)防CIS耳毒性的藥物。