高競逾 羅仁婧 阮標 江超武 劉卓慧 龍瑞清 梁秋林 張策 蘇路 李鵬

咽喉反流(laryngopharyngeal reflux,LPR)由于較高的發(fā)病率以及與一系列耳鼻咽喉科、呼吸內(nèi)科疾病的相關(guān)性而得到越來越多的重視[1,2]。研究證實LPR是咽喉部良性和惡性病變的危險因素之一[3,4]。大量研究發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶(pepsin)可能在聲帶息肉、任克水腫、聲帶白斑、喉癌等疾病的發(fā)病中起重要作用[5-7]。但聲帶良惡性病變中胃蛋白酶表達的差異仍然沒有明確的報道。本研究比較聲帶癌、聲帶息肉與健康人群間反流癥狀指數(shù)(reflux symptomindex,RSI)、反流體征評分(reflux finding score,RFS)、胃蛋白酶檢測試劑盒結(jié)果的差異,探討胃蛋白酶在聲帶良惡性疾病發(fā)病中的作用,為聲帶良惡性疾病的防治提供參考。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2020年5月至2021年12月就診于昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科的住院患者及健康志愿者共77例。分為聲帶息肉組、聲帶癌組以及對照組。患者在檢查前2周內(nèi)均未服用質(zhì)子泵抑制劑、胃動力藥物等。排除標準:①處于急性上呼吸道感染或此前有咽喉部、胃腸道手術(shù)史者;②有Zolling-Ellison綜合征、賁門失弛緩、賁門痙攣、食管狹窄及其他食管病變者;③此前一個月內(nèi)進行CPAP治療;④重大慢性疾病病史、精神疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病者;⑤中途發(fā)生嚴重癥狀,臨床判定需要進行干預(yù)者。所有研究對象均同意參與該項研究并簽署知情同意書,該項研究通過昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批[(2022)倫審L第130號]。

聲帶息肉組27例,入選標準:喉鏡檢查示聲帶息肉,經(jīng)保守治療(聲休、發(fā)聲訓練)無效,行支撐喉鏡下聲帶息肉取材活檢術(shù),且術(shù)后病理檢查結(jié)果提示聲帶息肉。聲帶癌組27例,入選標準:喉鏡檢查示聲帶腫物,且經(jīng)保守治療無效,行支撐喉鏡下聲帶腫物取材活檢術(shù),術(shù)后病理檢查結(jié)果提示聲帶鱗狀細胞癌;其中,原位癌8例,浸潤癌4例,鱗狀細胞癌15例(高分化6例,中-高分化1例,中分化7例,低分化1例)。對照組23例,入選標準:無明顯聲帶病變,無耳鼻喉科相關(guān)疾病,無胃腸道相關(guān)疾病。三組年齡及性別分布見表1。

表1 三組受試者臨床資料、RSI、RFS評分及Peptest檢查結(jié)果

1.2研究方法

1.2.1RSI和RFS評分 對聲帶息肉組、聲帶癌組、對照組由同一醫(yī)師行電子喉鏡檢查以及 RSI、RFS評分,RSI>13分和/或RFS>7分者為陽性;反之則為陰性。

1.2.2胃蛋白酶檢測試劑盒試驗 收取研究對象早餐后1 h的唾液對三組受試者行胃蛋白酶檢測試劑盒(Peptest)檢測,并用定量儀精確測定胃蛋白酶濃度。

1.2.3胃蛋白酶的免疫組化檢測 采用兩步法對聲帶息肉組、聲帶癌組標本行胃蛋白酶免疫組化染色,根據(jù)染色的深淺和范圍對研究對象進行咽喉反流的客觀評估。一抗:胃蛋白酶A多克隆抗體[(PA5-103156)賽默飛世爾科技公司(中國上海)];二抗:增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)(中國北京)。PBS代替一抗作為陰性對照,以胃底黏膜細胞的胃蛋白酶免疫染色結(jié)果為陽性對照。依據(jù)Formwitz評分方法,根據(jù)顯色程度與顯色細胞占比評分的乘積將顯色強度分為4級:0分為陰性,記0級;1～4分為弱陽性,記1級,5～8分為陽性記2級,9～12分為強陽性,記3級。

1.3統(tǒng)計學方法 運用SPSS25.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析,正態(tài)分布計量資料采用均數(shù)±標準差表示,多組間均數(shù)差異比較采用方差分析,兩組間均數(shù)差異比較采用Dunnett多重比較,兩組間等級資料差異比較采用秩和檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1三組RSI、RFS評分及Peptest檢查結(jié)果 由表1可見,經(jīng)方差分析及多重比較:三組RSI評分均數(shù)存在著統(tǒng)計學差異(F=4.457,P=0.015),對照組與聲帶息肉組(P=0.026)、聲帶癌組存在著統(tǒng)計學差異(P=0.04),聲帶息肉組與聲帶癌組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

三組RFS評分總體均數(shù)存在著統(tǒng)計學差異(F=37.534,P<0.001),對照組與聲帶息肉組(P<0.001)、聲帶癌組存在著統(tǒng)計學差異(P<0.001),聲帶息肉組與聲帶癌組存在著統(tǒng)計學差異(P=0.002)。

三組胃蛋白酶檢測試劑盒總體均數(shù)存在著統(tǒng)計學差異(F=3.435,P=0.037),對照組與聲帶息肉組(P=0.044)、聲帶癌組存在著統(tǒng)計學差異(P=0.045),聲帶息肉組與聲帶癌組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.2聲帶息肉組和聲帶癌組胃蛋白酶免疫組化結(jié)果 由表2可見,經(jīng)兩樣本秩和檢驗,聲帶息肉組和聲帶癌組胃蛋白酶免疫組化結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)(圖1)。

表2 聲帶息肉、聲帶癌組織中胃蛋白酶的表達(例)

圖1 喉部病變組織胃蛋白酶免疫組織化學染色圖像(免疫組化×400) a.陰性對照,聲帶息肉組織; b.陽性對照,胃底粘膜組織; c.弱陽性:聲帶息肉組織,少量淺棕色顯色; d.陽性,聲帶鱗狀細胞癌組織,顆粒狀棕色顯色; e.強陽性,聲帶鱗狀細胞癌組織,上皮層及基質(zhì)密集分布大量深褐色顆粒

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)LPR所致的胃內(nèi)容物反流至食管上括約肌以上被認為是引起聲帶病變的重要因素[8]。胃內(nèi)容物除胃酸、膽汁、胰酶和食糜外,還含有胃蛋白酶,它是一種必需的、最具侵襲性的蛋白酶[9,10]。當LPR發(fā)生時,只要咽喉部pH>5.0時,就會激活靜態(tài)胃蛋白酶[11]。與食管黏膜不同,喉和下咽黏膜缺乏會產(chǎn)生碳酸氫鹽來保護黏膜細胞的碳酸酐酶[12],自我保護能力相對較弱,即使是少量的胃內(nèi)容物反流,也會導致嚴重損傷,從而導致炎癥[10]。而反復的炎癥刺激導致咽喉上皮黏膜損傷,進一步增加其惡性轉(zhuǎn)化的風險。

本研究發(fā)現(xiàn)聲帶息肉組與聲帶癌組之間胃蛋白酶檢測試劑盒、RSI以及胃蛋白酶免疫組化結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但兩組間RFS結(jié)果有差異(P<0.05),提示聲帶息肉和聲帶癌的發(fā)生都與咽喉反流有關(guān),但其發(fā)病機制可能有所不同。咽喉反流所致的咽喉部損傷的諸多原因可分為兩方面[2,16]:一是直接損傷:胃十二指腸反流物胃酸、胃蛋白酶、胰酶、膽汁酸等對咽喉黏膜的直接刺激所導致的炎癥損傷,其中尤以胃蛋白酶對黏膜上皮的損傷最為嚴重;二是間接損傷:胃十二指腸反流物對食管遠端黏膜化學感受器的刺激引起迷走神經(jīng)反射,所致的咳嗽、清嗓等間接刺激所致的黏膜損傷。Wang等[17]研究表明LPR內(nèi)容物胃酸、胃蛋白酶所致的喉黏膜直接損傷是導致聲帶息肉的主要原因;而胡鴻敏等[3]通過病例對照研究發(fā)現(xiàn)LPR引起的清嗓可能是導致聲帶息肉的主要原因;Zou等[18]研究發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶可能通過促進免疫細胞聚集,增加局部細胞因子,促進炎癥反應(yīng),可能是導致聲帶息肉發(fā)病的新機制。本研究認為這兩方面的因素均參與了聲帶息肉的發(fā)生,但哪方面因素為主有待進一步研究;而聲帶癌則主要與咽喉反流所致的咽喉部直接損傷有關(guān)。這也可以解釋本研究中聲帶息肉組RSI量表評分略高于聲帶癌組,可能是由于間接損傷所致的咽喉部的這種反應(yīng)所致,例如咳嗽、清嗓等。

本研究中聲帶癌組RFS結(jié)果高于聲帶息肉組(P<0.05),提示聲帶癌組中咽喉黏膜的炎性反應(yīng)較重,可能與胃蛋白酶所致?lián)p傷較重有關(guān)。結(jié)合本研究胃蛋白酶免疫組化分析結(jié)果,提示胃蛋白酶在聲帶息肉和聲帶癌組中的含量較高,胃蛋白酶更可能通過直接作用于細胞漿而損傷喉黏膜上皮細胞。Ao等[19]研究發(fā)現(xiàn),高表達的 Glut-1 可能通過上調(diào)喉部 H+/K+-ATPase 的表達以重新激活吸收的胃蛋白酶,損傷喉黏膜,從而促進聲帶白斑向聲帶癌進展。Tina等[20]通過RNA測序鑒定胃蛋白酶失調(diào)通路和喉癌基因位點的差異,發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶激活喉癌相關(guān)的信號通路,可能是導致喉癌發(fā)生的新機制。Johnston等[21]研究發(fā)現(xiàn)在胃蛋白酶的刺激下喉上皮細胞miRNA水平出現(xiàn)顯著變化;在暴露于非酸性胃蛋白酶的喉上皮細胞中,miRNA表達顯著失調(diào),并表現(xiàn)出相應(yīng)的靶癌蛋白Ras表達增加。Ras表達增加與細胞增殖增加相關(guān),在喉癌中觀察到Ras表達異常[22]。上述機制可能在胃蛋白酶所致的聲帶黏膜損傷中起重要作用,最終導致聲帶癌的發(fā)生。

綜上所述,胃蛋白酶可能是聲帶息肉、聲帶癌的致病因素之一,但發(fā)病機制可能有所不同。本研究也存在局限性,由于考慮到倫理因素,未取正常人群的聲帶組織作為對照組進行研究。在聲帶良惡性疾病的防治過程中,如何抑制胃蛋白酶的作用將是未來研究重方向之一。