摘要：【目的】探究斜紋夜蛾5齡幼蟲對蔗糖的味覺行為和電生理反應(yīng)，并用胍丁胺活性依賴標(biāo)記神經(jīng)元的方法標(biāo)記斜紋夜蛾幼蟲側(cè)栓錐味覺感受器的蔗糖敏感神經(jīng)元，為鱗翅目昆蟲幼蟲味覺神經(jīng)元的功能和活動模式研究提供參考。【方法】采用行為試驗(yàn)雙選法研究斜紋夜蛾5齡幼蟲對不同濃度蔗糖（10、25、50和100 mmol/L）的行為反應(yīng)；采用電生理頂端記錄技術(shù)研究斜紋夜蛾5齡幼蟲栓錐感受器對胍丁胺（20 mmol/L）和不同濃度蔗糖（1、10、50和100 mmol/L）的電生理反應(yīng)，以2 mmol/L KCl溶液為對照；采用胍丁胺活性依賴標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記蔗糖敏感神經(jīng)元在側(cè)栓錐感受器中的分布?！窘Y(jié)果】10和25 mmol/L蔗糖對斜紋夜蛾幼蟲取食行為無顯著刺激作用（Pgt;0.05，下同），50和100 mmol/L蔗糖均能極顯著刺激幼蟲取食（Plt;0.001，下同）；斜紋夜蛾幼蟲的側(cè)栓錐感受器中有蔗糖敏感神經(jīng)元，且對50 mmol/L蔗糖的電生理反應(yīng)極顯著強(qiáng)于對照，幼蟲的側(cè)栓錐感受器對50 mmol/L蔗糖的反應(yīng)極顯著強(qiáng)于中栓錐感受器；幼蟲側(cè)栓錐感受器對1、10、50和100 mmol/L蔗糖的反應(yīng)強(qiáng)烈且與對照均存在極顯著差異，但反應(yīng)的峰值出現(xiàn)在50 mmol/L蔗糖。斜紋夜蛾幼蟲中栓錐感受器對50 mmol/L蔗糖的反應(yīng)與對照無顯著差異。斜紋夜蛾幼蟲側(cè)栓錐感受器對胍丁胺溶液的電生理反應(yīng)與對照無顯著差異；胍丁胺活性依賴標(biāo)記技術(shù)能標(biāo)記側(cè)栓錐感受器中的蔗糖敏感神經(jīng)元?！窘Y(jié)論】蔗糖對斜紋夜蛾幼蟲具有顯著的取食誘導(dǎo)效應(yīng)。斜紋夜蛾幼蟲中栓錐感受器中未發(fā)現(xiàn)對蔗糖敏感的神經(jīng)元，而其側(cè)栓錐感受器中檢測到1個蔗糖敏感神經(jīng)元。通過胍丁胺活性依賴標(biāo)記技術(shù)可將鱗翅目昆蟲幼蟲側(cè)栓錐感受器中的蔗糖敏感神經(jīng)元進(jìn)行標(biāo)記，使其在顯微鏡下直觀可見。

關(guān)鍵詞：斜紋夜蛾；蔗糖敏感神經(jīng)元；胍丁胺活性依賴標(biāo)記；電生理頂端記錄

中圖分類號：S433.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）11-3199-11Gustatory behavior and electrophysiological responses to sucrose in fifth instar larvae of Spodoptera litura and activity-dependent labeling of sucrose-sensitive neurons in lateral styloconic sensilla

ZHOUDong-sheng，SHIYong，LONGJiu-mei*，LIHong-qi，ZHAOBen-zhen，

ZHAOChen，CHEN Fu

（College of Resources and Environment，Zunyi Normal University，Zunyi，Guizhou" 563006，China）

Abstract：【Objective】To investigate the gustatory behavior and electrophysiological responses of fifth instar larvae of Spodoptera litura to sucrose，and to label the sucrose-sensitive neurons in the lateral styloconic sensilla using agmatine activity-dependent neuron labeling，which could provide reference for the study of function and activity pattern of gusta‐tory neurons in larva of Lepidoptera.【Method】The behavioral responses of fifth instar larvae to sucrose at different con‐centrations（10，25，50 and 100 mmol/L）were studied by double selection method. The electrophysiological responses to agmatine（20 mmol/L）and sucrose at different concentrations（1，10，50 and 100 mmol/L）of fifth instar larvae of Spodoptera litura lateral styloconic sensilla were studied by electrophysiological apical recording technique，and 2 mmol/L KCl solution was as control. The distribution of sucrose-sensitive neurons in lateral styloconic sensilla was marked by agmatine activity-dependent labeling technique【.Result】Sucrose at concentrations of 10 and 25 mmol/L had no significant stimulatory effect on larval feeding behavior（Pgt;0.05，the same below）. However，sucrose at concentrations of 50 and 100 mmol/L extremely significantly stimulated larval feeding behavior（Plt;0.001，the same below）. Lateral styloconic sensilla of Spodoptera litura contained sucrose-sensitive neurons，and the electrophysiological responses to 50 mmol/L sucrose were extremely significantly stronger than the control. The response intensity of sucrose-sensitive neuronsin la-

teral styloconic sensilla of larvae was extremely significantly stronger than that in the medial styloconic sensilla. The lateral styloconic sensilla of larvae exhibited strong responses to 1，10，50 and 100 mmol/L sucrose，with extremely sig‐

nificant differences among these concentrations compared with control，peaking at 50 mmol/L sucrose. There was no significant difference in the response of medial styloconic sensilla to 50 mmol/L sucrose. There was no significant dif‐

ference in the electrophysiological response of lateral styloconic sensilla of the lateral Spodoptera litura to agmatine solu‐

tion. Agmatine activity-dependent labeling technique could be used to label sucrose-sensitive neurons in lateral stylo‐

conic sensilla.【Conclusion】Sucrose exhibits significant feeding-stimulatory effect on Spodoptera litura larvae. However，no sucrose-sensitive neurons have been identified in the medial sensilla styloconica of Spodoptera litura larvae，whereas a single sucrose-sensitive neuron is present in the lateral styloconic sensilla. Using agmatine activity-dependent labeling，the sucrose-sensitive neurons in the lateral sensilla styloconica of Lepidopteran larvae can be effectively labeled，enabling clear visualization under a microscope.

Key words：Spodoptera litura；sucrose-sensitive neurons；agmatine activity-dependent labeling；electrophysiologi‐cal tip recording

Foundation items：Guizhou Science and Technology Plan Project（QKHJC-ZK〔2024〕Yiban 691）；Zunyi Normal University Doctoral Fund Projec（tZunshi BS〔2023〕17）

0 引言

【研究意義】斜紋夜蛾（Spodoptera litura）隸屬于鱗翅目夜蛾科斜紋夜蛾屬（田藝帆等，2024），是一種世界性多食性害蟲，主要分布于亞洲和大洋洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)。其幼蟲主要以豆科植物為食，如煙草、豆類和蔬菜等，也會攻擊棉花和水稻等作物。其危害主要表現(xiàn)為幼蟲在作物上大量取食，導(dǎo)致作物減產(chǎn)、死亡，嚴(yán)重時甚至造成作物絕收（Gupta et al.，2005）。昆蟲和植物構(gòu)成陸地生物群落中至關(guān)重要的組成部分（Wang and van Loon，2023）。在植物光合作用的主要代謝產(chǎn)物中，蔗糖、葡萄糖和果糖等占據(jù)了重要地位（武菊平等，2022）。對于絕大多數(shù)鱗翅目昆蟲來說，這些糖類物質(zhì)是強(qiáng)烈的取食刺激物。蔗糖作為取食刺激物，在昆蟲取食過程中起著至關(guān)重要的作用，甚至在大多數(shù)情況下是唯一的刺激物。蔗糖敏感神經(jīng)元在昆蟲的味覺感受中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對昆蟲的生存和行為決策，如食物攝取和尋找適宜的產(chǎn)卵場所具有重要影響。因此，研究昆蟲幼蟲對蔗糖的反應(yīng)，通過活性標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記味覺栓錐感受器中的蔗糖敏感神經(jīng)元，深入了解其解剖學(xué)特征和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的組織和連接方式，可揭示昆蟲幼蟲味覺系統(tǒng)的工作機(jī)制和行為決策的基礎(chǔ)，為害蟲防治和生態(tài)保護(hù)提供新思路?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物葉片中的糖類濃度通常在10～50 mmol/L，相應(yīng)地，大多數(shù)昆蟲幼蟲味覺細(xì)胞感知糖類濃度的最大范圍在10～100 mmol/L，糖敏感神經(jīng)元的感受閾值約為0.1～1.0 mmol/L（Schoonhoven and van Loon，2002）。這種生理特性使得昆蟲能夠?qū)μ穷惍a(chǎn)生準(zhǔn)確的感知，幫助其找到植物并更好地生存。以往的研究表明，絕大多數(shù)鱗翅目昆蟲具有專門的味覺細(xì)胞感知植物中的糖類，這些味覺細(xì)胞被稱為糖細(xì)胞或糖敏感神經(jīng)元。鱗翅目昆蟲幼蟲的栓錐感受器中通常含有1個或2個糖敏感神經(jīng)元（Schoonhoven and van Loon，2002）。大多數(shù)鱗翅目昆蟲具有敏感的蔗糖感受神經(jīng)元，蔗糖在幼蟲取食行為中起著關(guān)鍵作用。蔗糖相較于其他糖類物質(zhì)如葡萄糖和果糖，其取食誘導(dǎo)效應(yīng)尤為突出（張佳佳，2022；Zhang et al.，2024）。蔗糖在昆蟲取食過程中的作用不可或缺，直接影響昆蟲對營養(yǎng)的獲取及其生理活動（Ai et al.，2022；Aidlin et al.，2023）。多項(xiàng)研究表明，昆蟲的取食行為與其外周神經(jīng)系統(tǒng)對糖的信息輸入密切相關(guān)。植食性昆蟲的1個或多個口器感受器中的味覺感受神經(jīng)元（GSNs）對糖類（通常包括蔗糖）產(chǎn)生反應(yīng)（Chapman，2003）。在鱗翅目昆蟲中，成蟲在觸角（Popescu et al.，2013）、跗節(jié)（Zhang et al.，2010）和喙（Faucheux，2013）的接觸化學(xué)感受器中也具有對糖類敏感的GSNs；而幼蟲常在上顎側(cè)或中部的栓錐感受器中具有對糖類敏感的GSNs（Schoonhoven and van Loon，2002；Martin and Shields，2012）。在神經(jīng)元的活性標(biāo)記方面，前期有研究用放射性標(biāo)記的2-脫氧葡萄糖來進(jìn)行活性標(biāo)記，但此方法的復(fù)雜性和處理要求限制了其應(yīng)用范圍，相比之下，神經(jīng)生物素作為活動標(biāo)記物更具靈活性和潛力（Bausenwein and Fischbach，1992）。有研究使用神經(jīng)生物素來標(biāo)記蚊子觸角嗅覺受體神經(jīng)元的活動（Anton et al.，2003；Anton and Rospars，2004），這種方法雖然有效，但仍未能完全解決神經(jīng)激活與標(biāo)記之間的關(guān)系。后續(xù)研究者利用胍丁胺活性依賴標(biāo)記法嘗試解決此問題。胍丁胺活性依賴標(biāo)記神經(jīng)元的方法通過刺激物質(zhì)打開神經(jīng)元膜上的離子通道，使胍丁胺進(jìn)入并累積，從而實(shí)現(xiàn)對個體受刺激受體神經(jīng)元的標(biāo)記。使用特定抗體和熒光染料，可在激光共聚焦顯微鏡下觀察這些標(biāo)記的神經(jīng)元，已成功用于繪制光感受器、嗅覺和味覺上皮中神經(jīng)元的反應(yīng)圖（Michel et al.，1999；Sakata et al.，2003）。van Loon等（2009）首次將胍丁胺活性依賴標(biāo)記法成功地應(yīng)用于昆蟲外周神經(jīng)系統(tǒng)，標(biāo)記了大菜粉蝶（Pieris brassicae）幼蟲栓錐感受器的糖敏感神經(jīng)元?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】將神經(jīng)元活動和取食行為聯(lián)系起來直觀地顯示神經(jīng)元的活動是一個有趣的研究方向，但到目前為止，斜紋夜蛾幼蟲的蔗糖敏感神經(jīng)元尚未被成功標(biāo)記?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用行為試驗(yàn)和電生理試驗(yàn)方法探究斜紋夜蛾幼蟲栓錐感受器中蔗糖敏感神經(jīng)元的活動，并用胍丁胺活性依賴標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記該神經(jīng)元，從而直觀觀察其形態(tài)和結(jié)構(gòu)，以深入了解蔗糖敏感神經(jīng)元的解剖學(xué)特征，并將其與取食行為和神經(jīng)元電生理活動相聯(lián)系，為研究鱗翅目昆蟲幼蟲味覺神經(jīng)元的功能和活動模式提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

斜紋夜蛾個體通過實(shí)驗(yàn)室傳代飼養(yǎng)方法進(jìn)行培育。飼養(yǎng)條件：溫度（27±1）℃，相對濕度65%～70%，光周期L∶D=14 h∶10 h。當(dāng)斜紋夜蛾幼蟲達(dá)到3齡階段后，將其轉(zhuǎn)移到塑料制的養(yǎng)蟲管中進(jìn)行單獨(dú)飼養(yǎng)，每管僅放置1頭幼蟲，并在管內(nèi)提供人工飼料。為確保幼蟲的生活環(huán)境，使用棉花塞住管口。成蟲則安置在網(wǎng)籠中，并以10%蜂蜜水作為食物來源進(jìn)行飼養(yǎng)。所有用于行為試驗(yàn)和電生理試驗(yàn)的幼蟲均通過人工飼料飼養(yǎng)至5齡階段。行為試驗(yàn)：將處于4齡階段末蛻皮期的幼蟲從養(yǎng)蟲管中取出并單獨(dú)放置于空管中，待其完成蛻皮至5齡后進(jìn)行約8 h饑餓處理（Tang et al.，2006）。電生理試驗(yàn)：選用5齡初期的幼蟲，即蛻皮后24～48 h內(nèi)的個體，于試驗(yàn)前進(jìn)行

2 h饑餓處理（van Loon and Schoonhoven，1999）。

1.2 人工飼料制備

人工飼料配方成分分為3組，A組：26 g麥胚粉、51.3 g豆粉、56 g鷹嘴豆粉、31.6 g干酵母粉、15.2 g酪蛋白、1.8 g尼泊金甲酯、1.3 g山梨酸和100 mL蒸餾水；B組：3.2 g抗壞血酸、0.5 g膽固醇、1片復(fù)合維生素片（磨碎）、1顆維生素E膠囊、1 mL蓖麻油、0.25 g鏈霉素硫酸鹽和1 mL甲醛溶液；C組：由13 g 瓊脂粉和520 mL蒸餾水組成。制備步驟：將A組的所有成分放入湯鍋中混合均勻；在另一個湯鍋中加入C組的所有成分，用電磁爐加熱并不斷攪拌至沸騰，約10 min；將煮開的C組溶液倒入A組的湯鍋中，攪拌均勻；待混合物溫度降至40 ℃以下時，加入B組的所有成分，攪拌均勻后倒入已滅菌的飼料盒；趁熱輕輕晃動飼料盒使表面平整，待飼料在室溫下冷卻后，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 供試化合物

山羊抗兔IgG購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，蔗糖、胍丁胺、兔抗胍丁胺、普通山羊血清和碘化丙啶等其他試劑均購自默沙東中國有限公司。所有供試化合物的純度均gt;97%。用于行為試驗(yàn)的化合物先溶解于蒸餾水中，然后再溶解于2%吐溫-80溶液，并以2%吐溫-80為對照；用于電生理試驗(yàn)的化合物溶解于2 mmol/L KCl溶液，并以2 mmol/L KCl溶液為對照。

1.4 行為試驗(yàn)方法

行為試驗(yàn)采用雙選法（介質(zhì)為葉碟）（Zhou et al.，2021）進(jìn)行。將辣椒葉片用打孔器制成直徑為1 cm的葉碟，葉碟面積為78.5 mm2。將5μL的化合物溶液均勻涂布在辣椒葉碟的正反面，將葉碟本身重量計(jì)算在內(nèi)，使蔗糖在葉碟上的終濃度為10、25、50和100 mmol/L。涂完后的葉碟在室溫下晾20min。對照使用相同的方法處理。處理葉碟和對照葉碟交替放置于培養(yǎng)皿的內(nèi)部邊緣。把饑餓后的斜紋夜蛾5齡幼蟲放置于培養(yǎng)皿中央，培養(yǎng)皿底部墊有1張潤濕濾紙。試驗(yàn)在25 ℃室溫下進(jìn)行，當(dāng)50%的對照葉碟或處理葉碟被取食完后，剩下的葉碟通過平板掃描儀進(jìn)行電子掃描。葉碟面積的量化使用 Scion Image for Windows v.4.03（Scion 公司，美國）。通過將葉碟的剩余面積從3個作為縮小對照的葉碟平均面積中扣除，計(jì)算出被食面積（Messchendorp et al.，1996）。

1.5 電生理試驗(yàn)方法

電生理頂端記錄技術(shù)被廣泛應(yīng)用于記錄鱗翅目幼蟲栓錐感受器對不同化合物的神經(jīng)反應(yīng)，該技術(shù)是單感器記錄技術(shù)（SSR）的一種。操作步驟：選擇供試幼蟲并切下其頭部，將參比電極（銀電極）的一端插入頭部，同時盡量使下顎伸展，以便暴露出栓錐感受器；參比電極的另一端連接至前置放大器（Taste Probe DTP-1，Syntech公司，荷蘭），前置放大器進(jìn)一步連接至電生理信號處理系統(tǒng)（IDAC-4，Syntech公司，荷蘭）；用于刺激的溶液被注入尖端直徑約為30μm的玻璃電極（記錄電極）中，并固定在微動操作儀上；當(dāng)玻璃電極中的溶液與幼蟲的栓錐感受器接觸時，溶液通過栓錐感受器頂端進(jìn)入感受器內(nèi)部，與味覺神經(jīng)元接觸；味覺神經(jīng)元的反應(yīng)信號經(jīng)過前置放大器放大后，傳輸至電生理信號處理系統(tǒng)，并通過Autospike v.3.7處理成可識別的電生理脈沖信號。味覺神經(jīng)元脈沖反應(yīng)的計(jì)數(shù)在刺激開始后至60 s內(nèi)進(jìn)行。神經(jīng)元脈沖信號計(jì)數(shù)由操作者在Autospike軟件輔助下進(jìn)行視覺計(jì)數(shù)。本研究采用電生理頂端記錄技術(shù)測試斜紋夜蛾5齡幼蟲栓錐感受器對胍丁胺和不同濃度蔗糖（1、10、50和100mmol/L）的電生理反應(yīng)。

1.6 胍丁胺活性依賴標(biāo)記方法及結(jié)果觀察

胍丁胺活性依賴標(biāo)記步驟：將50 mmol/L蔗糖溶于20 mmol/L胍丁胺，并進(jìn)一步溶解于100 mmol/L 磷酸緩沖液中，調(diào)節(jié)pH至7.2作為處理溶液，同時以僅含蔗糖（50 mmol/L）的溶液作為對照；使用處理溶液和對照溶液在電生理儀器上分別刺激斜紋夜蛾幼蟲的栓錐感受器，每次刺激30 s，共刺激120次，持續(xù)60 min；切下幼蟲頭部，在磷酸鹽平衡生理鹽水（PBS）中潤洗5 min；在顯微鏡下，從外額葉上切下栓錐感受器組織，用含1%戊二醛和2%甲醛的100 mmol/L 磷酸緩沖液固定4 h，并在4 ℃的PBS溶液中過夜保存；依次在70%乙醇中潤洗15 min、90%乙醇中潤洗15 min、庚烷中潤洗20 s、90%乙醇中潤洗15 min、70%乙醇中潤洗15 min，最后在PBS中潤洗15 min，并用PBS沖洗4次，每次5 min；室溫下用0.5 mg/mL PBS膠原酶孵育60 min，并在PBS-T（PBS加5% Tri‐ton）中潤洗3次，每次10 min，將組織轉(zhuǎn)入小管中；在含有10%普通山羊血清的PBS-T溶液（PBS-T-NGS）中孵育1 h后，室溫下用含有0.5%兔抗胍丁胺抗體的PBS-T-NGS溶液孵育24 h；用PBS-T沖洗6次，每次30 min，總計(jì)3 h；室溫下用含有0.5%山羊抗兔IgG和0.5%碘化丙啶的PBS-T-NGS溶液孵育2 h，再用PBS-T溶液潤洗3次，每次10min；分別用70%、90%、100%、100%和100%的乙醇脫水，每次10min，并在二甲苯中處理30 s；將組織轉(zhuǎn)移至載玻片上，平整放置并蓋上蓋玻片，水平放置于黑暗中至少24 h；在激光共聚焦顯微鏡下成像并觀察。斜紋夜蛾幼蟲味覺感受器和胍丁胺活性標(biāo)記結(jié)果使用重慶中顯光電儀器有限公司的體視顯微鏡（型號ZSA300T）和卡爾蔡司光學(xué)（中國）有限公司的激光共聚焦顯微鏡（型號LSM510）進(jìn)行觀察、拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用配對t檢驗(yàn)對比斜紋夜蛾幼蟲對不同濃度蔗糖和對照的味覺行為反應(yīng)；使用非配對t檢驗(yàn)對比斜紋夜蛾幼蟲對胍丁胺和對照的電生理反應(yīng)，以及混合溶液（20 mmol/L胍丁胺+50 mmol/L蔗糖）和50 mmol/L蔗糖的電生理反應(yīng)。使用單因素方差分析（One-way ANOVA）分析側(cè)栓錐感受器對不同濃度蔗糖和對照電生理反應(yīng)的差異顯著性；使用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）分析側(cè)栓錐感受器和中栓錐感受器對50 mmol/L蔗糖和對照電生理反應(yīng)的差異顯著性。所有數(shù)據(jù)分析均在GraphPad Prism 10中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖行為試驗(yàn)

如圖1所示，10和25 mmol/L蔗糖處理對斜紋夜蛾5齡幼蟲取食無顯著影響（Pgt;0.05，下同）（圖1-A和圖1-B）；50和100 mmol/L蔗糖處理均能極顯著刺激幼蟲取食（Plt;0.001，下同）（圖1-C 和圖1-D）。

2.2 幼蟲側(cè)栓錐感受器和中栓錐感受器對蔗糖的電生理反應(yīng)

如圖2所示，與對照相比，斜紋夜蛾幼蟲的側(cè)栓錐感受器對50 mmol/L蔗糖反應(yīng)強(qiáng)烈且與對照存在極顯著差異；中栓錐感受器對50 mmol/L蔗糖反應(yīng)與對照相比無顯著差異。說明側(cè)栓錐感受器中存在蔗糖敏感神經(jīng)元，而中栓錐感受器中無蔗糖敏感神經(jīng)元；同時，斜紋夜蛾幼蟲的側(cè)栓錐感受器對蔗糖的反應(yīng)強(qiáng)度極顯著強(qiáng)于中栓錐感受器。

2.3 斜紋夜蛾幼蟲側(cè)栓錐感受器對蔗糖濃度梯度的電生理反應(yīng)

如圖3所示，與對照相比，斜紋夜蛾幼蟲的側(cè)栓錐感受器對1、10、50和100 mmol/L蔗糖反應(yīng)強(qiáng)烈且均存在極顯著差異。1 mmol/L蔗糖就能引發(fā)側(cè)栓錐感受器強(qiáng)烈的電生理反應(yīng)，說明側(cè)栓錐感受器蔗糖敏感神經(jīng)元對蔗糖反應(yīng)濃度閾值較低，且反應(yīng)隨著蔗糖濃度的升高而增強(qiáng)，反應(yīng)峰值出現(xiàn)在50 mmol/L蔗糖。

2.4 幼蟲側(cè)栓錐感受器對胍丁胺和胍丁胺與蔗糖混合溶液的電生理反應(yīng)

與對照相比，斜紋夜蛾幼蟲的側(cè)栓錐感受器對胍丁胺反應(yīng)無顯著差異。說明胍丁胺不能引發(fā)側(cè)栓錐感受器的反應(yīng)，側(cè)栓錐感受器中無胍丁胺敏感神經(jīng)元（圖4-A）。如圖4-B所示，胍丁胺與蔗糖混合溶液也能引發(fā)斜紋夜蛾幼蟲側(cè)栓錐感受器強(qiáng)烈的電生理反應(yīng)，但斜紋夜蛾幼蟲的側(cè)栓錐感受器對混合溶液的反應(yīng)與50 mmol/L蔗糖處理相比無顯著差異。

2.5 幼蟲側(cè)栓錐感受器的電生理反應(yīng)信號

從圖5電生理反應(yīng)信號可清楚地看到，斜紋夜蛾幼蟲側(cè)栓錐感受器對對照沒有反應(yīng)，對20 mmol/L 胍丁胺反應(yīng)很小，與對照無明顯差異，說明電生理反應(yīng)中斜紋夜蛾幼蟲側(cè)栓錐感受器中無胍丁胺敏感神經(jīng)元，與圖4-A的結(jié)果一致；從電生理反應(yīng)信號還可看到，斜紋夜蛾幼蟲側(cè)栓錐感受器對50 mmol/L蔗糖反應(yīng)十分劇烈，且從反應(yīng)的模式來判斷，只有1個神經(jīng)元對蔗糖起反應(yīng)，即是蔗糖敏感神經(jīng)元；另外，從電生理信號也可看到，斜紋夜蛾幼蟲的側(cè)栓錐感受器也只有1個神經(jīng)元對胍丁胺與蔗糖混合溶液反應(yīng)，從信號反應(yīng)模式判斷，起作用的神經(jīng)元就是蔗糖敏感神經(jīng)元。說明胍丁胺與蔗糖混合溶液激發(fā)斜紋夜蛾幼蟲側(cè)栓錐反應(yīng)的味覺神經(jīng)元即是蔗糖敏感神經(jīng)元。

2.6 胍丁胺活性依賴標(biāo)記斜紋夜蛾5齡幼蟲側(cè)栓錐感受器中的蔗糖敏感神經(jīng)元

體視顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，栓錐感受器位于斜紋夜蛾的口器旁，呈細(xì)長的錐形，基部較粗，向尖端逐漸變細(xì)（圖6-A）。圖6-B為活性依賴標(biāo)記的對照結(jié)果，圖6-C為斜紋夜蛾5齡幼蟲側(cè)栓錐感受器中蔗糖敏感神經(jīng)元的胍丁胺活性依賴標(biāo)記結(jié)果，可以清楚地看到該神經(jīng)元從栓錐感受器往下延伸到樹突、味覺細(xì)胞體和軸突的分布。結(jié)果表明斜紋夜蛾側(cè)栓錐感受器中有且只有1個蔗糖敏感神經(jīng)元對蔗糖起反應(yīng)。

3 討論

昆蟲與植物的相互關(guān)系在生物學(xué)中占據(jù)著獨(dú)特而豐富的研究領(lǐng)域（欽俊德和王琛柱，2001）。取食行為是昆蟲賴以生存的基本行為，對其生長、發(fā)育與繁殖具有至關(guān)重要的作用。深入研究昆蟲的取食行為對于理解其生命史、生態(tài)適應(yīng)和種群動態(tài)具有重要意義（孫龍龍等，2023）。蔗糖在昆蟲取食過程中的作用不可或缺，直接影響其營養(yǎng)獲取和生理活動（Ai et al.，2022；Aidlin et al.，2023）。因此，研究昆蟲對蔗糖的行為和電生理反應(yīng)十分必要。

不同種類的糖類可激活味覺敏感神經(jīng)元上不同類型的味覺受體（GRs），從而影響昆蟲的進(jìn)食行為（Agnihotri et al.，2016）。幼蟲口器（主要是栓錐感受器）的味覺敏感神經(jīng)元可因糖致敏化而被激活，從而引發(fā)取食反應(yīng)（Popescu et al.，2013）。最近的一項(xiàng)研究表明，蔗糖能顯著促進(jìn)棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）幼蟲的取食行為，這種取食行為與側(cè)栓錐感受器中的蔗糖敏感神經(jīng)元密切相關(guān)，該神經(jīng)元對蔗糖高度敏感，對果糖的反應(yīng)相對來說低很多（Zhang et al.，2024）。本研究在斜紋夜蛾幼蟲上有類似的結(jié)果，50和100 mmol/L蔗糖可以極顯著刺激幼蟲的取食行為，幼蟲側(cè)栓錐感受器內(nèi)的蔗糖敏感神經(jīng)元能被較低濃度的蔗糖（1 mmol/L）所激發(fā)，從而引發(fā)對蔗糖的取食反應(yīng)。本研究的電生理反應(yīng)結(jié)果能很好地解釋斜紋夜蛾幼蟲對蔗糖的行為反應(yīng)，即一定濃度的蔗糖（50和100 mmol/L）極顯著促進(jìn)了幼蟲的取食行為，這主要是通過幼蟲側(cè)栓錐感受器中的蔗糖敏感神經(jīng)元對蔗糖的味覺感受實(shí)現(xiàn)。有些糖敏感神經(jīng)元并不會只對1種糖起反應(yīng)。如蔗糖和葡萄糖在煙草潛葉蛾（Phthorimaea operculella）幼蟲的攝食行為中扮演重要角色，這是因?yàn)橛紫x口器上的感受器對上述2種糖類均具有高度敏感的電生理學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致幼蟲對其表現(xiàn)出強(qiáng)烈的攝食偏好（Mu et al.，2003）。因此，本研究中的蔗糖敏感神經(jīng)元是否還對其他糖類起反應(yīng)還有待進(jìn)一步探討。

昆蟲通過口器、觸角、胸足、翅和產(chǎn)卵器等多種味覺器官感知外界環(huán)境中的味覺信息，從而對其生存和行為產(chǎn)生重要影響（Vosshall and Stocker，2007；Agnihotri et al.，2016；楊科和王琛柱，2023）。幼蟲的味覺感受器尤其值得關(guān)注，特別是幼蟲外額葉上的4個栓錐感受器，其通過檢測食物中的化學(xué)成分，幫助幼蟲辨別和選擇適宜的食物資源，從而影響其攝食效率和營養(yǎng)獲取。栓錐感受器在鱗翅目幼蟲的取食行為中發(fā)揮關(guān)鍵作用，有助于理解昆蟲取食行為的神經(jīng)機(jī)制和化學(xué)感受過程（Schoonhoven and van Loon，2002）。前人對41種昆蟲栓錐感受器的比較研究表明，栓錐感受器在不同物種間的外觀變化很小，形態(tài)上是非常保守的一類感受器（Grimes and Neunzig，1986）。本研究中的斜紋夜蛾幼蟲栓錐感受器在解剖形態(tài)上也顯示出這一特點(diǎn)。每個栓錐感受器內(nèi)含有5個雙極神經(jīng)元，其中1個神經(jīng)元起機(jī)械附著作用，其余4個為味覺敏感神經(jīng)元。這些神經(jīng)元的樹突延伸至接近感受器的尖端，并在接觸化學(xué)物質(zhì)后產(chǎn)生反應(yīng)，而其軸突則延伸進(jìn)入大腦，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相連（Schoonhoven and van Loon，2002）。本研究的胍丁胺活性標(biāo)記結(jié)果清楚地顯示了蔗糖敏感神經(jīng)元的樹突延伸至側(cè)栓錐感受器的頂端，后接神經(jīng)元細(xì)胞體，軸突則向后延伸進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。斜紋夜蛾幼蟲的側(cè)栓錐感受器中，4個味覺神經(jīng)元分別是糖敏感神經(jīng)元、鹽敏感神經(jīng)元、取食抑制素神經(jīng)元和水敏神經(jīng)元（Hirao et al.，1992）。本研究的電生理結(jié)果也驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)，顯示側(cè)栓錐感受器中只有1個蔗糖敏感神經(jīng)元。同時，胍丁胺活性依賴標(biāo)記結(jié)果也清晰地反映了這一點(diǎn)：斜紋夜蛾幼蟲對蔗糖的味覺感受從側(cè)栓錐味覺感受器中蔗糖敏感神經(jīng)元的樹突接收信號，然后傳到細(xì)胞體，再到軸突傳向中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

SSR是一種先進(jìn)的昆蟲細(xì)胞外電生理技術(shù)，能精確測量昆蟲單個感受器對各種刺激物的電生理反應(yīng)，幫助研究者揭示感受器對信息化合物的特異性響應(yīng)及其在昆蟲行為和生態(tài)適應(yīng)中的具體作用（唐加菜等，2022）。本研究所用電生理頂端記錄技術(shù)是SSR的一種，結(jié)果顯示，斜紋夜蛾幼蟲的側(cè)栓錐感受器有對蔗糖敏感的味覺神經(jīng)元，其對蔗糖的濃度梯度反應(yīng)表明，在比較低的閾值（1 mmol/L）蔗糖就能引發(fā)側(cè)栓錐感受器的強(qiáng)烈反應(yīng)，隨著濃度的增大，反應(yīng)也隨之增強(qiáng)，在濃度50 mmol/L時達(dá)到峰值。而中栓錐感受器對蔗糖的反應(yīng)很低，可以認(rèn)為不存在對蔗糖敏感的神經(jīng)元，但不能排除中栓錐感受器中有對其他糖類敏感的神經(jīng)元。如有研究表明，斜紋夜蛾幼蟲中栓錐感受器中有對果糖敏感的味覺神經(jīng)元（Hirao et al.，1992）。本研究選擇側(cè)栓錐感受器進(jìn)行標(biāo)記也正是基于上述理由。本研究表明，神經(jīng)元胍丁胺活性依賴標(biāo)記結(jié)果不僅能與神經(jīng)元電生理反應(yīng)信號相互印證，還能與側(cè)栓錐感受器對蔗糖的神經(jīng)元電生理反應(yīng)結(jié)果相互佐證。

近期研究表明，棉鈴蟲幼蟲和成蟲的糖敏感神經(jīng)元對蔗糖的反應(yīng)強(qiáng)度及敏感性存在顯著差異，幼蟲對蔗糖的敏感性是成蟲的100～1000倍（Zhang et al.，2024）。本研究也發(fā)現(xiàn)斜紋夜蛾幼蟲側(cè)栓錐感受器中存在高敏感性的蔗糖敏感神經(jīng)元，但成蟲的反應(yīng)情況仍需進(jìn)一步探討。昆蟲對糖感受的本質(zhì)應(yīng)深入到相關(guān)受體研究。果蠅（Drosophila melanogas‐ter）的多種糖類GRs參與了糖的感知，不同的糖感覺神經(jīng)元中會表達(dá)不同的GRs（Kwon et al.，2011；Mishra et al.，2013；Freeman et al.，2014；Fujii et al.，2015；Maier et al.，2021），而鱗翅目昆蟲如家蠶（Bombyx mori）、棉鈴蟲、小菜蛾（Plutella xylostella）和斜紋夜蛾等的相關(guān)研究表明其果糖受體對果糖具有特異性（Xu et al.，2012；Jiang et al.，2015；Liu et al.，2019，2020；Morinaga et al.，2022）。BmGr4在家蠶中可作為蔗糖和葡萄糖受體來感知相關(guān)糖類（Mang et al.，2022）。而棉鈴蟲幼蟲主要使用Gr10 檢測植物組織中的低濃度蔗糖，成蟲主要使用Gr6 檢測含有高濃度蔗糖在內(nèi)的多種糖類（Zhang et al.，2024）。本研究斜紋夜蛾幼蟲側(cè)栓錐感受器中的蔗糖敏感神經(jīng)元能感知低濃度的蔗糖，是否也與棉鈴蟲一樣Gr10受體參與對蔗糖的感知還有待進(jìn)一步研究。

斜紋夜蛾的糖敏感神經(jīng)元此前尚未被標(biāo)記并直觀觀察過。本研究首次以多食性昆蟲斜紋夜蛾為模型標(biāo)記了其側(cè)栓錐感受器的蔗糖敏感神經(jīng)元。前期有研究者使用1%神經(jīng)生物素溶液標(biāo)記未受損的感受器中的受體神經(jīng)元，以定量分析蚊子大腦中嗅覺受體神經(jīng)元末梢分支的位置以及神經(jīng)元的投射和連接（Anton et al.，2003；Anton and Rospars，2004）。但該操作方法較復(fù)雜，成本較高，且未解決神經(jīng)激活與標(biāo)記之間一一對應(yīng)的關(guān)系，并不適合使用在昆蟲幼蟲味覺敏感神經(jīng)元的標(biāo)記中。本研究中，胍丁胺活性依賴標(biāo)記結(jié)果與刺激過程中獲得的電生理反應(yīng)結(jié)果能很好地吻合。20 mmol/L胍丁胺與50 mmol/L 蔗糖的混合物確定能激發(fā)側(cè)栓錐感受器的強(qiáng)烈反應(yīng)，結(jié)合電生理反應(yīng)和電生理信號來看，20 mmol/L 胍丁胺與50 mmol/L蔗糖的混合物激發(fā)反應(yīng)的是側(cè)栓錐感受器中的蔗糖敏感神經(jīng)元。側(cè)栓錐感受器中的蔗糖敏感神經(jīng)元被這種方法標(biāo)記，而且清楚地顯示有且僅有1個蔗糖敏感神經(jīng)元。表明胍丁胺可作為鱗翅目昆蟲的栓錐感受器活動依賴性的標(biāo)記物使用，因此這一技術(shù)具有應(yīng)用于標(biāo)記味覺感受器中其他類型神經(jīng)元的潛力，如抑制素神經(jīng)元和肌醇神經(jīng)元等。胍丁胺活性依賴標(biāo)記的優(yōu)勢還在于可確定多神經(jīng)元電生理記錄中參與的確切神經(jīng)元數(shù)量，并追蹤這些神經(jīng)元投射到大腦的路徑，在本研究中，清晰可見蔗糖敏感神經(jīng)元的軸突也被標(biāo)記。有研究者使用血清素（5-羥色胺）免疫組織化學(xué)方法對棉鈴蟲幼蟲咽下神經(jīng)節(jié)（SOG）進(jìn)行了染色和分區(qū)，將其劃分為32個小區(qū)，并將中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）內(nèi)的神經(jīng)元分為5類，結(jié)果顯示，不同功能的神經(jīng)元在CNS內(nèi)的空間投射存在顯著差異，但某些不同功能神經(jīng)元的投射區(qū)域也有重疊現(xiàn)象（Tang et al.，2019）。本研究雖然可以清晰看到蔗糖敏感神經(jīng)元的軸突，但并未成功追蹤到神經(jīng)元在SOG的分布及在CNS的空間投射，下一步有可能結(jié)合血清素染色方法來實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)。

盡管胍丁胺活性依賴標(biāo)記方法在本研究中顯示出良好的應(yīng)用前景，但實(shí)際操作中需注意樣品制備、標(biāo)記步驟和染色過程的精確性，以避免誤差。此外，該方法目前僅在胍丁胺和刺激物質(zhì)（如蔗糖）同時存在的特定條件下有效，可能限制其普遍適用性。

4 結(jié)論

蔗糖能顯著刺激斜紋夜蛾幼蟲取食。斜紋夜蛾幼蟲的中栓錐感受器中無蔗糖敏感神經(jīng)元。側(cè)栓錐感受器中存在1個蔗糖敏感神經(jīng)元，但無胍丁胺敏感神經(jīng)元。斜紋夜蛾幼蟲對蔗糖的取食與側(cè)栓錐感受器中的蔗糖敏感神經(jīng)元的反應(yīng)密切相關(guān)。利用胍丁胺活性依賴標(biāo)記技術(shù)可以標(biāo)記鱗翅目昆蟲幼蟲的側(cè)栓錐感受器中的蔗糖敏感神經(jīng)元，使其在顯微鏡下直觀可見。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）