摘要：【目的】通過對(duì)A型塞內(nèi)卡病毒（SVA）廣西分離株全基因組特征進(jìn)行深入分析，了解其病原特征和分子流行病學(xué)特點(diǎn)，為有效防止疫情暴發(fā)和流行提供理論依據(jù)?！痉椒ā繉?duì)2020年采集自廣西的病料進(jìn)行病毒分離，通過RT-PCR檢測(cè)和間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）進(jìn)行鑒定。對(duì)SVA分離株全基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增和測(cè)序后，采用Lasergene 7.1拼接序列，使用MegAlign將SVA分離株全基因組序列與國(guó)內(nèi)外不同年份的55株SVA代表毒株進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 11.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。【結(jié)果】經(jīng)鑒定分離到1株SVA，命名為SVA/CH-GX01-2020株。SVA/CH-GX01-2020株基因組全長(zhǎng)為7250 bp，開放閱讀框（ORF）編碼2181個(gè)氨基酸殘基。與國(guó)內(nèi)外不同年份的55株SVA代表毒株進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，SVA/CH-GX01-2020株與國(guó)內(nèi)外SVA分離株全基因組的核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列的相似性分別為93.3%～98.7%和97.3%～99.6%，其中，與美國(guó)經(jīng)典毒株SVV-001和ATCC PTA-5343全基因組相似性較低。遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，SVA/CH-GX01-2020株與美國(guó)經(jīng)典毒株SVV-001和ATCC PTA-5343親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與大多數(shù)中國(guó)分離株聚在同一分支，親緣關(guān)系較近，與廣西分離株SVA/GX/CH/2018親緣關(guān)系非常近。進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，與美國(guó)經(jīng)典毒株SVV-001、中國(guó)首株分離株CH-01-2015、廣西分離株SVA/GX/CH/2018相比， SVA/CH-GX01-2020株氨基酸突變位點(diǎn)主要集中在非結(jié)構(gòu)蛋白3D區(qū)域，在結(jié)構(gòu)蛋白VP4和非結(jié)構(gòu)蛋白2A區(qū)域相對(duì)保守?！窘Y(jié)論】SVA/CH-GX01-2020株具有其獨(dú)特的遺傳變異特點(diǎn)，不同地域的SVA毒株親緣關(guān)系遠(yuǎn)近程度不同， 臨床流行毒株具有遺傳多樣性，應(yīng)加強(qiáng)疫情監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。

關(guān)鍵詞：A型塞內(nèi)卡病毒；病毒分離；系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹；基因組特征；遺傳變異

中圖分類號(hào)：S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2024）11-3453-10

Whole genomic characteristics of Senecavirus A strainSVA/CH-GX01-2020

WANG Rui-min1， SHI Kai-chuang2*， FENG Shu-ping2， YIN Yan-wen2，LONG Feng2， LU Wen-jun2， QU Su-jie2

（1Guangxi Buffalo Research Institute， Nanning， Guangxi 530001， China； 2Guangxi Center for Animal Disease Controland Prevention， Nanning， Guangxi 530001， China）

Abstract：【Objective】To study the pathogenic characteristics and molecular epidemiological features of Senecavirus A （SVA） through in-depth analysis of the whole genome characteristics of the Guangxi isolated strain， which provided theoretical basis for the effective prevention of outbreaks and epidemics of the disease. 【Method】The virus was isolated from the suspected clinical sample collected from Guangxi in 2020， and identified by RT-PCR detection and indirect im‐munofluorescence assay （IFA）. After segmental amplification and sequencing of SVA strain whole genome， the se‐quences were spliced using Lasergene 7.1. Then， the whole genome sequence of SVA isolate was compared with 55 repre‐sentative SVA strains of different years at home and abroad using MegAlign， and a phylogenetic tree was constructedusing MEGA 11.0.【 Result】One SVA strain was isolated， identified， and named strain SVA/CH-GX01-2020. The genome of strain SVA/CH-GX01-2020 was 7250 bp in length and the open reading frame（ ORF） encoded 2181 amino acid resi‐dues. Compared with 55 representative SVA strains from home and abroad in different years， the similarities of nucleotide sequence and deduced amino acid sequence between SVA/CH-GX01-2020 strain and the other strains from home and abroad were 93.3%-98.7% and 97.3%-99.6% respectively. Among them， the SVA/CH-GX01-2020 strain had the lowest genomic similarity with the American classical strains SVV-001 and ATCC PTA-5343. Genetic evolution analysis showed that SVA/CH-GX01-2020 strain had distant genetic relationship with SVV-001 strain and ATCC PTA-5343 strain from America， located in the same branch with most isolates from China， and was very closely related to the Guangxi isolate SVA/GX/CH/2018. Amino acid sequence analysis revealed that， compared with the American classical SVA strain SVV-001， the first Chinese isolate CH-01-2015， and the Guangxi isolate SVA/GX/CH/2018， the amino acid mutation sites in the SVA/CH-GX01-2020 strain were mainly concentrated in non-structural protein 3D region， it was relatively conserved in the structural protein VP4 and non-structural protein 2A regions.【 Conclusion】The SVA/CH-GX01-2020 strain has its own unique genetic variation characteristics. The SVA strains from different geographical areas show different degrees of genetic relationship， indicating genetic diversity of the clinical strains， so surveillances and epidemiological investiga‐tions should be strengthened.

Key words： Senecavirus A； virus isolation； phylogenetic tree； genomic characteristics； genetic variation

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31772748）；Guangxi Key Research and Develop‐ment Plan Projec（t Guike AB21238003）； Guangxi Agricultural Science and Technology Self-financing Projec（t Z201954， Z202031）

0 引言

【研究意義】A型塞內(nèi)卡病毒（Senecavirus A，SVA）是一種新發(fā)的豬源病毒，又名塞內(nèi)加谷病毒（Seneca valley virus，SVV），屬于小RNA病毒科（Pi-cornaviridae）塞內(nèi)卡病毒屬（Senecavirus），是一種無囊膜的單股正鏈RNA病毒（Segalés et al.，2017）。SVA基因組全長(zhǎng)約7.2 kb，包括5'端非編碼區(qū)（5'- UTR）、開放閱讀框（ORF）、3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）（Hales et al.，2008）。豬感染SVA后通常表現(xiàn)為體溫升高、厭食、跛行，鼻吻和蹄部冠狀帶出現(xiàn)水皰或潰瘍等，偶爾伴有腹瀉癥狀，7日齡以內(nèi)的新生小豬感染后死亡率高達(dá)30%～70%（Segalés et al.，2017； Liu et al.，2020）。SVA感染與豬水皰?。⊿wine vesicular disease，SVD）、豬原發(fā)性水皰?。≒orcine idiopathic vesicular disease，PIVD）、水皰性口炎（Vesicular sto‐matitis，VS）、豬水皰疹（Vesicular exanthema of swine，VES）等豬傳染性疫病的癥狀和病變極為相似，臨床上難以區(qū)分，必須借助實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)行鑒別（Canning et al.，2016；Leme et al.，2017）。SVA在我國(guó)多地已有報(bào)道，但目前我國(guó)尚無商品化疫苗，因此，只有對(duì)臨床流行毒株進(jìn)行深入研究，掌握其病原特征和流行特點(diǎn)，才能更有效地阻止疫情的暴發(fā)和流行，降低損失?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】2002年，SVA偶然在美國(guó)塞內(nèi)卡河州立公園附近的實(shí)驗(yàn)室被發(fā)現(xiàn)，從人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞（PER.C6）中分離獲得，命名為SVV-001株（Reddy et al.，2007）；2007年，美國(guó)首次報(bào)道在從加拿大進(jìn)口的豬群中分離到該病毒（Pasma et al.，2008），此后SVA陸續(xù)被美國(guó)（Singh etal.，2012）、巴西（Vannucci et al.，2015）、哥倫比亞（Sun et al.，2017）、泰國(guó)（Saeng-Chuto et al.，2018）、越南（Arzt et al.，2019）等許多國(guó)家報(bào)道。趙曉亞等（2016）報(bào)道2015年首次從我國(guó)廣東豬群分離到SVA（命名為CH-01-2015株），湖北（Qian et al.，2016）、黑龍江（Wang et al.，2017）、河南和福建（Zhu et al.，2017）等省份也相繼報(bào)道，此后SVA還蔓延到其他省份，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失（Liu et al.，2020）。SVA早在2002年就已出現(xiàn)，前期主要作為溶瘤病毒在腫瘤治療領(lǐng)域有相關(guān)研究，至2014年NCBI僅發(fā)布了3條SVA全基因組序列，表明此前對(duì)該病毒的危害性認(rèn)識(shí)不夠。2015年后，SVA陸續(xù)在全球各國(guó)豬場(chǎng)中被發(fā)現(xiàn)，該病毒與口蹄疫病毒等存在混合感染情況，且病毒間難以通過臨床癥狀進(jìn)行區(qū)分，給各地豬場(chǎng)帶來巨大損失，SVA作為一種新型豬病毒引起了廣大學(xué)者重視。至今NCBI僅有數(shù)百余株SVA全基因組序列，對(duì)病毒致病機(jī)制和治療藥物的研究均處于初步階段?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，在我國(guó)多地已有豬群感染SVA的報(bào)道，但針對(duì)該病毒的研究相對(duì)較少。2020年在廣西發(fā)現(xiàn)疑似SVA感染豬，而對(duì)廣西SVA分子流行病學(xué)和毒株遺傳變異特點(diǎn)的研究甚少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對(duì)2020年采集自廣西的病料進(jìn)行病毒分離，經(jīng)鑒定后對(duì)SVA分離株進(jìn)行全基因組測(cè)序，掌握其特征并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，了解該毒株的病原特征和分子流行病學(xué)特點(diǎn)，為有效防止疫情暴發(fā)和流行提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

臨床病料采集自2020年廣西疑似病豬的肝臟、脾臟和肺臟等組織。乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK-21）由溫州大學(xué)病毒學(xué)研究所提供；2×Taq PCR Master Mix和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、TaKaRa LA PCR Kit Ver.2.1和pMD18-T載體均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自蘇州天隆生物科技有限公司；豬睪丸傳代細(xì)胞（ST）和豬抗SVA多抗均由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供；FITC標(biāo)記兔抗豬多抗購(gòu)自上海博耀生物科技有限公司。

1. 2 病毒的分離與RT-PCR檢測(cè)

取病料樣品，將肝臟、脾臟和肺臟等組織剪碎并研磨，加入含雙抗的PBS，制成病毒混懸液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，接種至BHK-21細(xì)胞，盲傳至第6代，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞作為陰性對(duì)照，培養(yǎng)48 h后觀察細(xì)胞病變情況。收集病變細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，分裝后于-70 ℃保存?zhèn)溆?。按試劑盒說明提取病毒核酸，根據(jù)NCBI已發(fā)布的SVA經(jīng)典毒株SVV-001全基因組序列（GenBank登錄號(hào)：DQ641257.1）設(shè)計(jì)1對(duì)檢測(cè)引物（SVA-F：5'-CTACTTCAAACCAGGAACAC T-3'；SVA-R：5'-ACAAGGCCCTCCATCT-3'），產(chǎn)物長(zhǎng)度157 bp。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：Taq DNA聚合酶12.5 μL，25 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2.5 μL，無酶水補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，58.4 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1. 3 病毒的間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）鑒定

將ST細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%時(shí)，接種100.0 μL病毒液，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。棄培養(yǎng)液，用PBST（pH 7.2）洗滌3次，用預(yù)冷的4%多聚甲醛室溫固定1 h。用PBST洗滌3次，用1% Triton X-100室溫通透1 h。用PBST洗滌3次，用5% BSA室溫封閉2 h。用PBST洗滌3次，加入豬抗SVA多抗（一抗）4 ℃孵育過夜。用PBST洗滌3次，加入FITC標(biāo)記兔抗豬多抗（二抗）37 ℃避光孵育1 h。用PBST洗滌3次，用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

1. 4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI已發(fā)布的SVV-001毒株全基因組序列（GenBank登錄號(hào)：DQ641257.1），設(shè)計(jì)6對(duì)擴(kuò)增區(qū)域互相重疊的特異性引物（表1），用于擴(kuò)增SVA分離株全基因組序列，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1. 5 SVA分離株全基因組的分段擴(kuò)增及測(cè)序

將SVA分離株接種至BHK-21細(xì)胞，盲傳3代后取細(xì)胞上清液，按DNA/RNA提取試劑盒說明提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：2×Taq PCR Master Mix 25.0 μL，25 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板10.0 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 120 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)目的片段后使用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過夜培養(yǎng)。選取陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液經(jīng)PCR驗(yàn)證、酶切鑒定正確后，送至寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序。

1. 6 SVA分離株全基因組序列分析

采用Lasergene 7.1對(duì)各片段序列進(jìn)行拼接，獲得SVA分離株全基因組核苷酸序列；并與國(guó)內(nèi)外SVA代表毒株（表2）的全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，使用MegAlign進(jìn)行核苷酸序列及推導(dǎo)氨基酸序列相似性分析?；赟VA全基因組核苷酸序列相似性，利用MEGA 11.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病毒的分離與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

取病料樣品剪碎并研磨，加入含雙抗的PBS，即為病毒混懸液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，接種至BHK-21細(xì)胞，盲傳至第6代，培養(yǎng)48 h后觀察發(fā)現(xiàn)典型細(xì)胞病變，其表現(xiàn)為 BHK-21 細(xì)胞變圓、皺縮，并發(fā)生脫落（圖1-A），而陰性對(duì)照 BHK-21 細(xì)胞成纖維狀貼壁生長(zhǎng)（圖1-B）。采用RT-PCR對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增的目的片段大小與預(yù)期一致，病料樣品檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性（圖1-C）。

2. 2 病毒的IFA鑒定結(jié)果

將病毒接種至ST細(xì)胞，進(jìn)行IFA鑒定。經(jīng)固定、通透和封閉后，分別加入一抗和二抗孵育。結(jié)果如圖2-A所示，接種病毒的細(xì)胞產(chǎn)生特異性熒光，而未接種病毒的陰性對(duì)照細(xì)胞則沒有出現(xiàn)熒光（圖2-B）。上述結(jié)果表明，分離病毒為SVA，將其命名為SVA/CH-GX01-2020株。

2. 3 SVA/CH-GX01-2020株全基因組的分段擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果

利用表1中的特異性引物對(duì)SVA/CH-GX01-2020株全基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增，獲得6個(gè)與預(yù)期大小一致的擴(kuò)增片段，大小分別為415、1993、1950、1654、1885和586 bp（圖3）。目的片段經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序和拼接后，獲得SVA/CH-GX01-2020株全基因組序列，全長(zhǎng)為7250 bp。SVA/CH-GX01-2020株基因組的結(jié)構(gòu)如表3所示，自5'端到3'端，第1～650位堿基（650 bp）為5'-UTR，第651～7196位堿基（6546 bp）為ORF，第7197～7250位堿基（54 bp）為3'-UTR；ORF編碼2181個(gè)氨基酸殘基。

2. 4 SVA/CH-GX01-2020株全基因組序列相似性分析結(jié)果

將獲得的SVA/CH-GX01-2020株全基因組序列與國(guó)內(nèi)外不同年份的55株SVA代表毒株序列進(jìn)行比對(duì)，使用MegAlign進(jìn)行核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列相似性分析，結(jié)果見表4。SVA/CH-GX01-2020株與國(guó)內(nèi)外不同SVA分離株全基因組的核苷酸序列及氨基酸序列相似性分別為93.3%～98.7%和97.3%～99.6%。SVA/CH-GX01-2020株與美國(guó)分離株的核苷酸序列及氨基酸序列相似性分別為93.3%～98.2%和97.6%～99.6%，其中，與美國(guó)經(jīng)典毒株SVV-001相似性較低，核苷酸序列及氨基酸序列相似性分別為93.4%和97.6%，與美國(guó)毒株ATCC PTA-5343相似最低，核苷酸序列及氨基酸序列相似性分別為93.3%和97.6%。SVA/CH-GX01-2020株與中國(guó)分離株的核苷酸序列及氨基酸序列相似性分別為96.0%～98.7%和97.3%～99.6%。SVA/CH-GX01-2020株與中國(guó)毒株CH-GDMZ-2019核苷酸序列相似性最高（98.7%），而氨基酸序列則與中國(guó)毒株AH01-CH-2016、SDta/2018和美國(guó)毒株USA/IA40380/2015、USA/GBI29/2015相似性最高，均為99.6%。此外，SVA/CH-GX01-2020株與中國(guó)毒株CH-02-2015的氨基酸序列相似性最低（97.3%）。

2. 5 SVA/CH-GX01-2020株全基因組遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

基于SVA/CH-GX01-2020株與55株SVA代表毒株全基因組核苷酸序列相似性，利用MEGA 11.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果見圖4。SVA/CH-GX01-2020株與包括中國(guó)首株分離株CH-01-2015在內(nèi)的大多數(shù)中國(guó)毒株聚在同一分支，親緣關(guān)系較近，而與美國(guó)經(jīng)典毒株SVV-001和ATCC PTA-5343親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；在同樣來自廣西的毒株中，SVA/CH-GX01-2020株與SVA/GX/CH/2018株的親緣關(guān)系比CH-GX-01-2019株更近。

2. 6 SVA/CH-GX01-2020株全基因組氨基酸序列分析結(jié)果

SVA基因組包含5'-UTR、ORF和3'-UTR，其中ORF編碼2181個(gè)氨基酸殘基，分為4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（VP4、VP2、VP3和VP1）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）。利用MegAlign對(duì)SVA/CH-GX01-2020株與美國(guó)經(jīng)典毒株SVV-001、中國(guó)首株分離株CH-01-2015和廣西分離株SVA/GX/CH/2018氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果（表5）發(fā)現(xiàn)，相較于SVV-001株，SVA/CH-GX01-2020株有54個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，突變位點(diǎn)主要集中在VP3和3D區(qū)域，其次是VP1、3A和3C區(qū)域；與CH-01-2015株相比，SVA/CH-GX01-2020株有27個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，突變主要集中在非結(jié)構(gòu)蛋白3A和3D區(qū)域；相較于SVA/GX/CH/2018株，SVA/CH-GX01-2020株僅有19個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，主要集中在3D區(qū)域，而VP4和2A區(qū)域相對(duì)保守。表明SVA/CH-GX01-2020株在VP4和2A區(qū)域相對(duì)保守，在非結(jié)構(gòu)蛋白3D區(qū)域存在氨基酸變異，具有其獨(dú)特的遺傳變異特點(diǎn)。

3 討論

2002年研究人員發(fā)現(xiàn)SVA，2007年美國(guó)首次報(bào)道從發(fā)生水皰性疾病的豬群中分離到SVA，但此后至2014年底，該病毒僅在北美國(guó)家有報(bào)道（Pasma et al.，2008；Singh et al.，2012）。2015年后，巴西、中國(guó)和泰國(guó)等其他國(guó)家相繼暴發(fā)由SVA引起的豬水皰性疾?。╒annucci et al.，2015；趙曉亞等，2016； Saeng-Chuto et al.，2018），呈快速蔓延之勢(shì)。尤其是感染SVA的新生仔豬死亡率較高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失（Zhu et al.，2017）。趙曉亞等（2016）報(bào)道，2015年3月，我國(guó)廣東多個(gè)豬場(chǎng)相繼發(fā)生水皰性疾病，豬口鼻和蹄部出現(xiàn)水皰狀，并伴有仔豬急性死亡現(xiàn)象，從病料中分離到我國(guó)首株SVA毒株；此后，我國(guó)許多省份也相續(xù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)SVA（Liu et al.，2020）。近年來，SVA在世界各主要養(yǎng)豬國(guó)家發(fā)生和流行，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成極大危害。

本研究從廣西疑似SVA感染豬的病料中分離到SVA/CH-GX01-2020株，并通過克隆、測(cè)序和拼接獲得了全基因組序列。通過全基因組序列相似性分析

發(fā)現(xiàn)，SVA/CH-GX01-2020株與美國(guó)分離株的核苷酸序列及氨基酸序列相似性分別為93.3%～98.2%和97.6%～99.6%，與中國(guó)分離株的核苷酸序列及氨基酸序列相似性分別為96.0%～98.7%和97.3%～99.6%。其中，SVA/CH-GX01-2020株與美國(guó)經(jīng)典毒株SVV-001和ATCC PTA-5343相似性較低，全基因組核苷酸序列、氨基酸序列相似性分別為93.4%、97.6%和93.3%、97.6%；與中國(guó)分離株CH-GDMZ-2019株全基因組核苷酸序列相似性最高（98.7%），而氨基酸序列相似性則與中國(guó)毒株AH01-CH-2016和SDta/2018、美國(guó)毒株USA/IA40380/2015和USA/GBI29/2015相似性最高，均為99.6%。Sun等（2018）從廣東獲得的17株SVA分離株基因組核苷酸序列相似性為96.5%～99.8%，與46株中國(guó)分離株基因組核苷酸序列相似性為95.7%～100%，與美國(guó)經(jīng)典毒株SVV-001及ATCC PTA-5343基因組核苷酸序列相似性分別為93.5%～94.1%和93.1%～94.0%。李寧等（2021）從河南分離獲得CH-HNCY-2019株，其全基因組核苷酸序列與中國(guó)分離株相似性較高（95.9%～99.0%），與美國(guó)分離株相似性較低（93.3%～98.1%）。而鄭敏等（2022）分離獲得的SVA/HN/2020株與中國(guó)2016年分離株HB/CH/2016和2017年分離株GD-04/2017相似性較高（99.7%和98.5%），而與中國(guó)2018—2020年分離株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說明SVA在不斷變異。此外，Peng等（2020）報(bào)道從四川分離到SVA重組毒株，表明臨床流行毒株的復(fù)雜性增加，給疾病防控帶來了新的挑戰(zhàn)。

本研究基于SVA全基因組核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)中國(guó)毒株較聚集，親緣關(guān)系較近，SVA/CH-GX01-2020株與美國(guó)經(jīng)典毒株SVV-001和ATCC PTA-5343親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與中國(guó)首株分離株CH-01-2015親緣關(guān)系較近，與廣西分離株SVA/GX/CH/2018親緣關(guān)系非常近。胡東波等（2019）對(duì)從河南分離的CH-HNXC株VP1基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，CH-HNXC株與此前報(bào)道的2017年河南和福建分離株位于較近的進(jìn)化分支中，與加拿大和泰國(guó)分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。Wang等（2020）報(bào)道，分離自廣西的SVA CH-GX-01-2018株與美國(guó)經(jīng)典毒株SVV-001遺傳距離較遠(yuǎn)，與2017年廣東分離株處于同一分支，表明廣西分離株可能由廣東分離株演變而來。馬雪青等（2023）通過對(duì)SVA的VP1基因核苷酸序列相似性分析發(fā)現(xiàn)，HBWH/1/2018株與2017年中國(guó)分離株HN01/2017及2016年美國(guó)分離株 USA/IL Purdue 43/2016 和 USA/IN Pur‐due 1581/2016 親緣關(guān)系較近，與美國(guó)分離株SVV-001親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。王晨（2023）從重慶分離到SVA/CH-CQ株，發(fā)現(xiàn)其與美國(guó)USA-IL-Purdue-4914-26株和巴西SVA/BRA/GO3/2015株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與四川HS-01株親緣關(guān)系最近。因此，推測(cè)SVA毒株處于不斷遺傳變異之中，相近的親緣關(guān)系與較近的地理位置和相近的時(shí)間點(diǎn)有密切關(guān)聯(lián)，中國(guó)分離株與美國(guó)分離株間可能存在交叉?zhèn)鞑?。Zhao等（2022）通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹和中介鄰接（Median-joining，MJ）網(wǎng)絡(luò)圖，對(duì)全球SVA進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明SVA在不同國(guó)家間存在交叉?zhèn)鞑デ也皇艿乩砦恢孟拗?，特別是中國(guó)和美國(guó)間存在交叉

傳播。

SVA基因組全長(zhǎng)約7.2 kb，包含1個(gè)獨(dú)特的ORF，所編碼的多聚蛋白遵循標(biāo)準(zhǔn)的L-4-3-4小RNA病毒結(jié)構(gòu)（Hales et al.，2008），由L、P1、P2和P3區(qū)域組成，P1可裂解為VP0、VP1和VP3蛋白（VP0在其組裝過程中進(jìn)一步裂解為VP2和VP4），P2裂解為2A、2B和2C蛋白，P3裂解成3A、3B、3C和3D蛋白。韓宇等（2020）對(duì)SVA/CH/ZZ/2016株與SVV-001株VP1蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)共有10個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，并推測(cè)這些位點(diǎn)可能會(huì)增強(qiáng)SVA的致病性；李寧等（2021）通過對(duì)CH-HNCY-2019株與國(guó)內(nèi)外分離株進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CH-HNCY-2019株的VP1和VP3蛋白均存在多位點(diǎn)突變。本研究中，與美國(guó)經(jīng)典毒株SVV-001、中國(guó)分離株CH-01-2015和廣西分離株SVA/GX/CH/2018相比，SVA/CH-GX01-2020株在VP4和2A區(qū)域相對(duì)保守，在非結(jié)構(gòu)蛋白3D區(qū)域存在氨基酸變異，具有其獨(dú)特的遺傳變異特點(diǎn)。表明SVA流行毒株具有遺傳多樣性，不同毒株的遺傳變異特點(diǎn)存在差異。

4 結(jié)論

SVA/CH-GX01-2020株具有其獨(dú)特的遺傳變異特點(diǎn)，不同地域的SVA毒株親緣關(guān)系遠(yuǎn)近程度不同，臨床流行毒株具有遺傳多樣性，應(yīng)加強(qiáng)疫情監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。

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（責(zé)任編輯 劉可丹）