摘要：【目的】對引起湖北省荊州市太湖養(yǎng)殖基地寬體金線蛭急性死亡的病原菌進行分離鑒定，并分析其生物學特性，為病害防治提供理論依據，促進寬體金線蛭養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。【方法】從患病寬體金線蛭病變組織中分離細菌并進行人工感染試驗，通過形態(tài)學觀察、生理生化特性鑒定、16S rRNA序列分析、多位點序列分型（MLST）等方法確定其分類地位。同時，通過PCR檢測分離菌株的毒力基因和耐藥基因攜帶情況，采用紙片擴散法測定其藥物敏感性，并進行中藥抑菌試驗?！窘Y果】從患病的寬體金線蛭病變組織中分離到菌株W23，人工感染試驗結果表明分離菌株W23具有較高致病性，通過形態(tài)學觀察和生理生化特性鑒定初步判斷其為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii），16S rRNA序列分析結果表明，分離菌株W23與維氏氣單胞菌參考菌株具有高度相似性，并在系統(tǒng)發(fā)育進化樹中與其聚為一支。毒力基因和耐藥基因檢測結果表明，分離菌株W23攜帶whiB3、Fla、Act、Lip、Aer、Ela共6種毒力基因和blaTEM、tetA、qnrS共3種耐藥基因。此外，分離菌株W23具有生物被膜形成能力，對數生長期為接種后5～9 h。藥敏試驗結果表明，分離菌株W23對多黏菌素B、四環(huán)素和氧氟沙星等10種抗生素敏感，對頭孢氨芐和復方新諾明2種抗生素中度敏感，對苯唑西林、青霉素和頭孢唑林等7種抗生素具有耐藥性。中藥抑菌試驗結果表明，烏梅、五倍子、五味子和蘇木對分離菌株W23有明顯抑制效果。【結論】維氏氣單胞菌是引起湖北省荊州市太湖養(yǎng)殖基地寬體金線蛭急性死亡的病原菌，其攜帶6種毒力基因和3種耐藥基因，具有較高的致病性。在寬體金線蛭養(yǎng)殖過程中可選用烏梅、五倍子、五味子和蘇木對維氏氣單胞菌感染引起的疾病進行防治。

關鍵詞：寬體金線蛭；維氏氣單胞菌；毒力基因；藥物治療；多位點序列分型

中圖分類號：S947.9 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2024）11-3474-13

Isolation， identification and biological characteristics of Aeromonas veronii from Whitmania pigra

ZHU Lin， QIN Xiao-man， LIU Feng， SU Ying-bing*

（College of Animal Science and Technology， Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434023， China）

Abstract：【Objective】To isolate， identify and analyze the biological characteristics of the pathogenic bacteria causing acute death of Whitmania pigra in Taihu breeding base of Jingzhou， Hubei， which could provide theoretical basis for di-sease prevention and control of W. pigra and promote the healthy development of the breeding industry.【 Method】Patho‐genic bacteria were isolated and identified from diseased W. pigra. The classification status of the isolated bacteria was de‐termined through morphological observation， physiological and biochemical characteristics analysis， 16S rRNA sequence identification and multilocus sequence typing（ MLST）. PCR amplification was conducted to identify the presence of viru‐lence genes and drug resistance genes. Drug sensitivity tests were performed using the disk diffusion method to assess the drug resistance， and Chinese herbal medicines bacteriostatic test was conducted. 【Result】The results showed that the strain W23 isolated from the edematous parts of W. pigra had high pathogenicity in artificial infection test， and was identi‐fied as Aeromonas veronii through morphological observation and physiological and biochemical characteristics analysis. The 16S rRNA sequence identification results indicated that strain W23 had the highest similarity to Aeromonas veroniireference strain and clustered with it in the phylogenetic tree. Detection of virulence genes and drug resistance genes re‐vealed that strain W23 carried 6 virulence genes （whiB3， Fla， Act， Lip， Aer， Ela） and 3 drug resistance genes （bla‐TEM， tetA， qnrS）. The isolated strain W23 had biofilm formation ability， and the logarithmic growth period was 5-9 h af‐ter inoculation. Drug sensitivity tests showed that strain W23 was sensitive to 10 antibiotics， such as polymyxin B， tetra‐cycline and ofloxacin， moderately sensitive to cefalexin and compound sulfamethoxazole， but resistant to 7 antibiotics， including oxacillin， penicillin and cefazolin. The results of antibacterial test in traditional Chinese medicine showed that Prunus mume， Galla chinensis， Schisandra chinensis， Caesalpinia sappan had obvious inhibitory effects on the isolated strain W23.【 Conclusion】A. veronii is the pathogenic bacterium causing ascites disease in W. pigra in the Taihu breeding base in Jingzhou， Hubei. It carries 6 virulence genes and 3 drug resistance genes， it has high pathogenicity. In the process of W. pigra culture， P. mume， G. chinensis， S. chinensis， C. sappan can be used to prevent and control the disease caused by A. veronii infection.

Key words： Whitmania pigra； Aeromonas veronii； virulence genes； drug therapy； multilocus sequence typing

Foundation items： Youth Science Fund Project of National Natural Science Foundation of China（32002252）；Hubei Modern Agricultural Industry Technology System Projec（t 2021Z22023）

0 引言

【研究意義】寬體金線蛭（Whitmania pigra）又名馬蛭、寬身金線蛭和寬身螞蟥，隸屬于黃蛭科金線蛭屬，養(yǎng)殖分布范圍較廣（吳雷明等，2019）。寬體金線蛭是一種傳統(tǒng)中藥材，可用于治療血瘀閉經和跌打損傷等疾病，而在現代醫(yī)學研究中發(fā)現其具有抗腫瘤、誘導癌細胞凋亡及防止腫瘤轉移等潛力（喬丹等，2022）。然而，隨著環(huán)境污染和人為過度捕撈的加劇，寬體金線蛭的野生資源數量逐漸減少，人工養(yǎng)殖成為主要供應來源。但在養(yǎng)殖過程中，寬體金線蛭常因各種疾病導致死亡，其中維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）引發(fā)的病害較為突出且傳染性強，若不及時控制，將引發(fā)大規(guī)模疫情，嚴重影響寬體金線蛭養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展?！厩叭搜芯窟M展】氣單胞菌屬是一類革蘭氏陰性、兼性厭氧桿菌，廣泛分布于海水、淡水和土壤等自然環(huán)境中（王興麗等，2016）。作為條件致病菌，氣單胞菌能感染人類、陸生動物和魚類并引發(fā)多種疾?。≧an et al.，2018）。其中，維氏氣單胞菌是一種人畜共患的傳染病病原菌（康元環(huán)等，2018），能感染魚類、蝦類和龜類等水生動物，并導致腸炎、腹水和出血等癥狀（賈俊鵬等，2018）。近年來，維氏氣單胞菌在水產動物中引發(fā)的病害受到廣泛關注，大量研究報道了該菌對黃鱔（Monopterus albus）（陳紅蓮等，2014）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）（王興麗等，2016）、臺灣泥鰍（Paramisgurnus dabrya‐nus ssp. Taiwan）（徐先棟等，2018）、紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）（郭雷鋒，2022）、大口黑鱸（Microp‐terus salmoides）（雷寧等，2022）、草魚（Ctenopharyn‐godon idella）（元麗花，2022）等多種水產動物的致病性。除維氏氣單胞菌外，其他氣單胞菌屬細菌也對水產動物中具有致病性，異常嗜糖氣單胞菌（Aeromo‐nas allosaccharophila）被報道為寬體金線蛭的致病菌（邵貴燕，2023），熒光假單胞菌（Pseudomonas fluo‐rescens）（王淑嫻等，2022）、嗜水氣單胞菌（Aeromo‐nas hydrophila）（張曉君等，2006）等也是水產動物常見的致病菌。關于維氏氣單胞菌感染寬體金線蛭的報道較少，王海華等（2023）報道維氏氣單胞菌是引起寬體金線蛭水腫病的病原菌?！颈狙芯壳腥朦c】湖北省荊州市太湖養(yǎng)殖基地寬體金線蛭暴發(fā)疾病并出現急性死亡，疑似維氏氣單胞菌感染，而目前關于維氏氣單胞菌對寬體金線蛭致病性的研究鮮有報道，且對于不同養(yǎng)殖環(huán)境下菌株的毒力和藥物敏感性差異缺乏深入研究，特別是關于寬體金線蛭源維氏氣單胞菌的毒力基因和耐藥基因研究尚無報道。【擬解決的關鍵問題】從患病寬體金線蛭病變組織中分離細菌并進行人工感染試驗，通過形態(tài)學觀察、生理生化特性鑒定、16S rRNA序列分析、多位點序列分型（MLST）等方法確定其分類地位，進行毒力基因檢測、耐藥基因檢測、藥敏試驗和中藥抑菌試驗，分析其生物學特性，為病害防治提供理論依據，促進寬體金線蛭養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

患病寬體金線蛭樣本采集于湖北省荊州市太湖養(yǎng)殖基地。LB培養(yǎng)基購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；PCR Master Mix和DL2000 DNA Marker均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；革蘭氏染色試劑盒、藥敏紙片和細菌生化鑒定管均購自杭州濱和微生物試劑有限公司；18種中藥購自北京同仁堂股份有限公司。

主要儀器設備：SW-CJ-ID超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；Nexus PCR儀（Eppendorf公司）；SHZ-82全溫振蕩培養(yǎng)箱（北京海富達科技有限公司）；SPX-80恒溫培養(yǎng)箱（紹興市蘇珀儀器有限公司）。

1. 2 細菌分離與純化

用75%酒精對寬體金線蛭進行體表消毒，無菌環(huán)境下進行解剖，分別從患病寬體金線蛭的水腫、結節(jié)部位分離細菌，在LB培養(yǎng)基上28 ℃靜置培養(yǎng)12～24 h，挑取優(yōu)勢菌落重復劃線培養(yǎng)以獲得純化菌株，于-80 ℃用80%甘油保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 人工感染試驗

選取300條體表無損傷、經檢測不攜帶相關病原菌的寬體金線蛭（體質量5.0±0.8 g、體長9.00±0.67 cm）暫養(yǎng)2周，隨機分為5組，每組20條，設3個重復，放入直徑20 cm、高10 cm的玻璃水瓶內。4個試驗組分別在寬體金線蛭背部肌肉注射1×108、1×107、1×106和1×105 CFU/mL分離菌株菌液，對照組注射0.9%生理鹽水，注射量均為每條0.1 mL，攻毒后連續(xù)觀察8 d，攻毒期間水溫保持在 28～30 ℃，不充氧不投喂（董靖等，2018）。待試驗組寬體金線蛭發(fā)病后與自然發(fā)病癥狀進行對比，解剖并按1.2方法再次分離鑒定病原菌。采用GraphPad Prism 9.5.1繪制生存曲線。

1. 4 組織載菌量測定和組織切片制作

在進行人工感染試驗2 d后，無菌采集1×108 CFU/mL菌液濃度試驗組5條寬體金線蛭的腸道和肌肉組織，將肌肉組織稱重后放入PBS中研磨，稀釋后涂布于LB固體培養(yǎng)基，統(tǒng)計菌落數并計算組織載菌量，組織載菌量=菌落數×稀釋倍數/組織重量。采集對照組5條寬體金線蛭的腸道和肌肉組織，與試驗組寬體金線蛭病變組織一起送至武漢賽維爾生物科技有限公司進行切片制作。

1. 5 分離菌株鑒定

1. 5. 1 形態(tài)學觀察及革蘭氏染色 取分離菌株菌液進行劃線培養(yǎng)，觀察單個菌落的大小、形狀、邊緣、質地和透明度等形態(tài)特征。進行革蘭氏染色后，用油鏡觀察。

1. 5. 2 生理生化特性鑒定 將分離菌株接種于細菌生化鑒定管中，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結果。

1. 5. 3 分子生物學鑒定 利用通用引物（表1）對分離菌株的16S rRNA序列進行PCR擴增，將符合預期的擴增產物送至武漢擎科生物科技有限公司測序。利用BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）進行序列比對分析。同時，從GenBank已公布的維氏氣單胞菌菌株序列中篩選與分離菌株序列具有較高相似性的序列，采用MEGA 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 5. 4 MLST鑒定 參照Maiden等（1998）提出的MLST方法，根據Martino等（2011）報道的6個氣單胞菌屬管家基因gyrB、groL、gltA、metG、ppsA、recA引物（表1），對分離菌株基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物測序后上傳至PubMLST（https：//pubmlst.org/）獲取等位基因編號，以確定分離菌株的序列型（ST）；并采用GrapeTree分組聚類分析維氏氣單胞菌ST型與分離菌株ST型的進化關系（張明洋等，2020）。

1. 6 毒力基因與耐藥基因檢測

1. 6. 1 毒力基因檢測 根據已報道的維氏氣單胞菌毒力基因引物（表1）（Sen and Rodgers，2004；Nawaz et al.，2010；Deng et al.，2014；Králová et al.，2016），采用PCR檢測Ast、Aer、Lip、Fla、Act、Ela、fbpC、kasB、fbpA、kasA、pup、whiB3共12種毒力基因。

1. 6. 2 耐藥基因檢測 設計β-內酰胺類耐藥基因（blaTEM、blaCTX-M）、四環(huán)素類耐藥基因（tetA、tetC、tetM）、磺胺類耐藥基因（sul1）和喹諾酮類耐藥基因（qnrA、qnrS）引物（表1），采用PCR檢測8種耐藥基因。所有引物均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 7 生物學特性測定

1. 7. 1 生物被膜形成能力測定 參照Wu等（2013）、項明源（2020）的方法進行分離菌株生物被膜形成能力測定。將純化后的菌液培養(yǎng)至對數期，取200 μL菌液分別接種于4塊96孔微量滴定板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃分別靜置培養(yǎng)12、24、36和48 h；棄去培養(yǎng)液，用無菌NaCl溶液洗滌3次除去殘留細菌，每孔加入200 μL 1%結晶紫染色液染色10 min；用NaCl溶液洗滌后，加入200 μL 33%乙酸，使用酶標儀測定OD590 nm，設3次重復。結果判定以空白對照組測得的OD590 nm平均值作為生物被膜形成能力的臨界值（ODC），當細菌OD590 nm≤ODC時，無生物被膜形成能力；當ODClt;細菌OD590 nm≤2×ODC時，生物被膜形成能力較弱；當細菌OD590 nmgt;2×ODC時，生物被膜形成能力強。

1. 7. 2 生長曲線測定 參照Dey等（2020）的方法，將純化后的分離菌株加入LB培養(yǎng)基，每1 h測定1次菌液的OD600 nm，連續(xù)測量20 h，設3次重復，取平均值，使用GraphPad Prism 9.5.1繪制生長曲線。

1. 7. 3 掃描電鏡觀察 樣品制備參照王維等（2022）的方法，使用掃描電鏡進行觀察和采集圖像。

1. 8 藥敏試驗

參考Yang等（2019）的方法，采用紙片擴散法進行藥敏試驗，將分離菌株均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，然后將藥敏紙片按順序依次貼在培養(yǎng)基上。28 °C恒溫條件下培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑。

1. 9 中藥抑菌試驗

1. 9. 1 中藥提取液制備 根據朱成科等（2018）、張桓橋等（2022）、侯天牧等（2023）、許瑞平等（2023）的研究結果，選取黃芩、黃柏、黃芪、板藍根、菝葜、金銀花、甘草、天葵子、蘇木、半枝蓮、烏梅、沙棘、訶子、地榆、黃連、五倍子、五味子和石榴皮共18種中藥，各取10 g搗碎，置于200 mL無菌蒸餾水中，浸泡過夜。大火煮沸后改用文火繼續(xù)煎煮2 h，使用300目尼龍篩網進行過濾。將殘渣再次加入200 mL無菌蒸餾水中，按照相同方法煎煮并過濾。將2次過濾獲得的濾液混合并加熱濃縮至10 mL，得到濃度為1 g/mL的中藥提取液。將制備好的中藥提取液進行滅菌處理，于4 °C保存?zhèn)溆茫◤埰较愕龋?023）。

1. 9. 2 抑菌圈試驗 采用抑菌圈法測定分離菌株對18種中藥的敏感性，抑菌圈直徑gt;15 mm為高度敏感，10 mmlt;抑菌圈直徑≤15 mm為中度敏感，0 mmlt;抑菌圈直徑≤10 mm為低度敏感，抑菌圈直徑=0 mm為不敏感。

1. 9. 3 最小抑菌濃度（MIC）測定 參考馬秀慧等（2018）的方法，采用二倍稀釋法進行MIC測定，設3次重復，將菌液接種至含有中藥提取液的試管中，28 ℃培養(yǎng)18 h，以無細菌生長的最高稀釋倍數中藥提取液濃度作為MIC。

1. 9. 4 最小殺菌濃度（MBC）測定 根據MIC測定結果，從無細菌生長的試管中，吸取100 μL液體均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，以菌落數不超過5個的最低中藥提取液濃度作為MBC（Naka‐mura et al.，2011）。

2 結果與分析

2. 1 人工感染試驗結果

從患病的寬體金線蛭的病變組織中分離獲得1株菌株，命名為W23。在人工感染分離菌株W23后，試驗組寬體金線蛭多在2～5 d內發(fā)病并死亡。其癥狀與自然發(fā)病的寬體金線高度相似，均表現為行動遲緩，對外界刺激反應遲鈍，軀體末端或中部形成明顯的結節(jié)（圖1-A）；進一步觀察發(fā)現，患病寬體金線蛭軀體明顯水腫且色澤發(fā)白，體腔內有大量積液（圖1-B）。隨著時間推移，結節(jié)逐漸壞死、僵硬，并擴散至整個軀體。該病的發(fā)病率和死亡率均較高，且表現出一定的傳染性。連續(xù)觀察8 d，試驗組均出現發(fā)病，其中接種菌液濃度為1×108 CFU/mL的寬體金線蛭在感染后24 h開始出現死亡，2 d內全部死亡（圖1-C）。相比之下，對照組寬體金線蛭在8 d觀察期內均保持正常狀態(tài)。進一步分析發(fā)現，寬體金線蛭的肌肉組織載菌量隨著接種菌液濃度的增大呈升高趨勢，其中在1×108 CFU/mL菌液濃度下，組織載菌量最高，顯著高于其他試驗組（Plt;0.05）（圖1-D）。

對健康寬體金線蛭和接種分離菌株W23的寬體金線蛭進行肌肉及腸道組織切片觀察。結果顯示，健康寬體金線蛭腸道內壁可見明顯紫色（圖2-A），患病寬體金線蛭的腸道黏膜層不完整，腸絨毛嚴重萎縮或脫落，腸道內充血明顯，腸腔內可見大量死亡細胞（圖2-B）。上述變化表明，細菌感染后寬體金線蛭腸道內發(fā)生炎癥反應，可能導致其消化吸收功能受損。觀察肌肉組織切片發(fā)現，健康寬體金線蛭肌細胞排列整齊，細胞間界限清晰（圖2-C）；患病寬體金線蛭肌細胞呈明顯的藍紫色，較健康寬體金線蛭顏色更深，細胞排列分散、紊亂，細胞間隙明顯（圖2-D）。

2. 2 分離菌株鑒定結果

2. 2. 1 形態(tài)學觀察及革蘭氏染色結果 分離菌株W23的菌落形態(tài)為圓形，具有光滑濕潤的表面和整齊的邊緣，呈半透明的灰白色（圖3-A），革蘭氏染色結果為陰性（圖3-B）。

2. 2. 2 生理生化特性鑒定結果 生理生化特性鑒定結果（表2）顯示，分離菌株W23能利用葡萄糖，VP試驗、賴氨酸、精氨酸雙水解酶呈陽性，不能利用肌醇，與維氏氣單胞菌的生理生化特性一致。

2. 2. 3 分子生物學鑒定結果 分離菌株W23的16S rRNA序列（GenBank登錄號：OR816105）長度為1470 bp（圖4-A）；BLAST比對結果顯示，分離菌株W23的16S rRNA序列與維氏氣單胞菌參考菌株（GenBank登錄號：KT964297.1）序列相似性為98%，進一步構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果（圖4-B）顯示，分離菌株W23與該維氏氣單胞菌菌株聚為一支，親緣關系最近。

2. 2. 4 MLST鑒定結果 分離菌株W23的管家基因gyrB、groL、gltA、metG、ppsA、recA等位基因編號分別為729、668、357、741、646、379，其ST型為899。通過GrapeTree分組聚類分析發(fā)現，ST型為899的分離菌株W23與ST型為1985的維氏氣單胞菌聚為一支（圖4-C），表明二者親緣關系較近。

2. 3 毒力基因檢測結果

如圖5所示，分離菌株W23可檢測到whiB3、Fla、Act、Lip、Aer、Ela共6種維氏氣單胞菌毒力基因，表明分離菌株W23攜帶相關毒力因子。

2. 4 耐藥基因檢測結果

如圖6所示，分離菌株W23可檢測到blaTEM、tetA、qnrS共3種耐藥基因，表明分離菌株W23攜帶相關耐藥因子。

2. 5 生物學特性測定結果

進行生物被膜形成能力測定發(fā)現，分離菌株W23在培養(yǎng)12 h后OD590 nm為0.430，而空白對照組OD590 nm為0.260，表明此時分離菌株W23生物被膜形成能力較弱，在培養(yǎng)24 h后，分離菌株W23的OD590 nm達頂峰，生物被膜形成能力強（圖7-A和圖7-B）。生長曲線（圖7-C）顯示，分離菌株W23在接種后5～9 h生長速度明顯加快，為對數生長期，隨后趨于平緩。采用掃描電鏡觀察發(fā)現，分離菌株W23為鈍圓形的短桿菌，部分菌體外部表面有凹痕且緊密相連（圖7-D）。

2. 6 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果（表3）表明，分離菌株W23對多黏菌素 B、四環(huán)素、氧氟沙星、頭孢哌酮、卡那霉素、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢曲松、萬古霉素和丁胺卡那10種抗生素敏感，占53%；對頭孢氨芐和復方新諾明2種抗生素中度敏感，占11%；對苯唑西林、青霉素、頭孢唑林、氨芐西林、慶大霉素、麥迪霉素和克林霉素7種抗生素具有耐藥性，占37%。

2. 7 中藥抑菌試驗結果

2. 7. 1 抑菌圈試驗結果 18種中藥對分離菌株W23的抑菌圈直徑測定結果如表4所示，分離菌株W23對烏梅高度敏感，抑菌圈直徑為17 mm；五倍子、蘇木和五味子3種中藥對分離菌株W23的抑制效果較好，抑菌圈直徑分別為15、12和11 mm，均為中度敏感；沙棘對分離菌株W23的抑制效果一般，抑菌圈直徑為8 mm；分離菌株W23對其余中藥不敏感。2. 7. 2 MIC測定結果 18種中藥的MIC測定結果如表5所示，烏梅和五倍子對分離菌株W23的抑制作用最強，MIC均為31.25 g/mL；石榴皮、地榆、訶子、蘇木、五味子和黃連次之，MIC均為62.50 g/mL；沙棘、半枝蓮和黃芩的MIC較低，均為250.00 g/mL；其余中藥的MIC均大于500.00 g/mL，無抑菌作用。2. 7. 3 MBC測定結果 18種中藥的MBC測定結果如表5所示，烏梅對分離菌株W23的抑制作用最強，MBC為31.25 g/mL；五倍子和石榴皮次之，MBC均為62.50 g/mL；地榆、訶子、蘇木、五味子和黃連的MBC較低，均為125.00 g/mL；其余中藥的MBC均大于500.00 g/mL，無抑菌作用。

3 討論

3. 1 寬體金線蛭源維氏氣單胞菌的分離鑒定

維氏氣單胞菌是一種人畜共患的傳染病病原菌，具有危害人體健康的潛在威脅。本研究中，患病寬體金線蛭臨床癥狀主要表現為軀體水腫、發(fā)白，體腔內有大量積液；軀體末端或中部有結節(jié)，且逐漸壞死、僵硬并蔓延至整個軀體，疑似感染維氏氣單胞菌，從患病寬體金線蛭的病變組織中分離到菌株W23，通過形態(tài)學觀察、生理生化特性鑒定初步判定為維氏氣單胞菌，通過16S rRNA序列分析進一步證實分離菌株W23是維氏氣單胞菌。經MLST鑒定發(fā)現，分離菌株W23的ST型為899，根據PubMLST已發(fā)布的記錄，2016年從上海豬群首次分離到該ST型的維氏氣單胞菌菌株，本研究首次分離到ST型為899的寬體金線蛭源維氏氣單胞菌菌株。

3. 2 寬體金線蛭源維氏氣單胞菌的毒力與致病性

維氏氣單胞菌的致病能力與其攜帶的毒力因子緊密相關（楊超，2022）。本研究檢測到分離菌株W23攜帶whiB3、Fla、Act、Lip、Aer、Ela共6種毒力基因，這些毒力基因顯著提升了細菌的致病能力。其中，Aer基因被認為是最關鍵的毒力基因之一，對維氏氣單胞菌的致病性起核心作用（Ran et al.，2018）。韓語等（2022）從泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）體內分離出的20株維氏氣單胞菌中，Aer基因檢測陽性率高達100%，Aer基因與維氏氣單胞菌的致病性間存在密切關聯(lián)。王興麗等（2016）認為，Aer基因可作為判斷維氏氣單胞菌是否具有致病性的關鍵標志之一。此外，本研究中分離菌株W23感染的寬體金線蛭體表和身體各組織均有明顯病變，體腔內有大量積液，嚴重個體呈透明狀，與王海華等（2023）的研究結果相似。通過對寬體金線蛭病理組織的觀察發(fā)現，腸道病變主要是腸絨毛脫落，腸道內有充血現象，腸腔內可見死亡細胞。病變肌肉組織中細胞排列分散、紊亂，細胞間隙較大。上述結果表明，分離菌株W23具有較高致病性。

3. 3 寬體金線蛭源維氏氣單胞菌的藥物敏感性

從不同物種和養(yǎng)殖環(huán)境中分離的維氏氣單胞菌對抗生素的耐藥性可能不同，雷寧等（2022）從浙江省湖州市大口黑鱸體內分離的維氏氣單胞菌對頭孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、強力霉素、復方新諾明、四環(huán)素和左氧氟沙星敏感。本研究結果表明，寬體金線蛭源維氏氣單胞菌對多黏菌素B、四環(huán)素、氧氟沙星、頭孢哌酮、卡那霉素、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢曲松、萬古霉素和丁胺卡那10種抗生素敏感，對頭孢氨芐和復方新諾明2種抗生素中度敏感，對苯唑西林、青霉素、頭孢唑林、氨芐西林、慶大霉素、麥迪霉素和克林霉素7種抗生素具有耐藥性，與耿昕穎等（2015）的部分研究結果一致。僅有少數藥物在不同菌株間表現出相同的敏感性，菌株間的耐藥性差異可能與抗生素的使用歷史、用藥劑量、用藥頻率及養(yǎng)殖環(huán)境等多種因素有關。在水產養(yǎng)殖中，抗生素是治療細菌性疾病的常用藥物，但對抗生素的不當使用可能導致細菌對藥物的敏感性降低甚至產生耐藥性（羅君等，2022）。

3. 4 中藥對寬體金線蛭源維氏氣單胞菌的抑制效果

中藥種類豐富，作為天然藥物，其含有多種抑制細菌繁殖的活性成分，中藥的抑菌效果受到大量學者關注，在水產養(yǎng)殖中極具應用潛力（陳嘉聲等，2023；勞錦程等，2023；陳希平，2024）。相較于抗生素，中藥具有不易產生耐藥性、無毒副作用、無殘留、不造成環(huán)境污染等優(yōu)勢（郭煥裕等，2022）。抑菌圈試驗結果表明，烏梅、五倍子、蘇木、五味子和沙棘5種中藥對維氏氣單胞菌具有抑制作用。因抑菌圈試驗對中藥抑菌能力的解釋力度稍顯不足，故綜合考慮抑菌圈直徑、MIC和MBC測定結果，篩選出抑菌效果較好的中藥為烏梅、五倍子、五味子和蘇木。本研究結果與王寶屯等（2021）的研究結果一致，但與許瑞平等（2023）研究中石榴皮和半枝蓮的抑菌效果不同。可能是各個地區(qū)中藥的有效成分及藥材的處理和提取方法存在差異，導致藥材對病原菌的抑制效果不同。

4 結論

維氏氣單胞菌是引起湖北省荊州市太湖養(yǎng)殖基地寬體金線蛭急性死亡的病原菌，其攜帶6種毒力基因（whiB3、Fla、Act、Lip、Aer、Ela）和3種耐藥基因（blaTEM、tetA、qnrS），具有較高的致病性。在寬體金線蛭養(yǎng)殖過程中可選用烏梅、五倍子、五味子和蘇木對維氏氣單胞菌感染引起的疾病進行防治。

參考文獻（（References））：

陳紅蓮，江河，胡王，凌俊，段國慶. 2014. 黃鱔病原性維氏氣單胞菌溫和生物變種的分離與鑒定［J］. 生物技術通報，（3）：130-136.［ Chen H L，Jiang H，Hu W，Ling J，Duan G Q. 2014. Isolation and identification of pathogenic Aeromo‐nas veronii biovar sobria from Monopterus albus［J］. Bio‐technology Bulletin，（3）：130-136.］ doi：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.03.029.

陳嘉聲，韋宏杰，楊奇慧，譚北平，陳宇航，林華杏. 2023. 五倍子對凡納濱對蝦生長、抗氧化、非特異性免疫及腸道結構的影響［J］. 廣東海洋大學學報，43（2）：11-17.［ Chen J S，Wei H J，Yang Q H，Tan B P，Chen Y H，Lin H X. 2023. Effects of Galla chinensis on growth，antioxidant capacity，non-specific immunity and intestinal structure for Litope‐naeus vanname［iJ］. Journal of Guangdong Ocean Univer‐sity，43（2）：11-17.］ doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2023.02.

002.

陳希平，王亞楠，楊嘉惠，劉夢飛，張佳程，鄧紅進，田繼業(yè)，譚北平，遲淑艷. 2024. 飼料中添加白術提取物對低鹽養(yǎng)殖凡納濱對蝦生長、腸道抗氧化及抗炎的影響［J］. 廣東海洋大學學報，44（5）：153-162. ［Chen X P，Wang Y N，Yang J H，Liu M F，Zhang J C，Deng H J，Tian J Y，Tan B P，Chi S Y. 2024. Effects of dietary extract of Atractylodes macrocephala Koidz on growth， intestinal antioxidant and anti-inflammatory abilities of Litopenaeus vannamei cul‐tured at low salinity［J］. Journal of Guangdong Ocean Uni‐versity，2024，44（5）：153-162.］ doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2024.05.017.

董靖，劉永濤，胥寧，宋懌，鄢志紅，楊秋紅，楊移斌，艾曉輝. 2018. 日本醫(yī)蛭水腫病病原分離鑒定及敏感性試驗［J］. 淡水漁業(yè)，48（6）：46-52.［ Dong J，Li Y T，Xu N，Song Y，Yan Z H，Yang Q H，Yang Y B，Ai X H. 2018. Identifica‐tion and susceptibility test of pathogenic Aeromonas vero‐nii isolated from leech Hirudo nipponia［J］. Freshwater Fisheries，48（6）：46-52.］ doi：10.13721/j.cnki.dsyy.2018.06.008.

耿昕穎，葛錚，孔令聰，朱世馨，單曉楓，馬紅霞，高云航. 2015. 52株不同淡水魚類維氏氣單胞菌耐藥表型的分析［J］. 中國獸藥雜志，49（6）：1-5.［ Geng X Y，Ge Z，Kong L C，Zhu S X，Shan X F，Ma H X，Gao Y H. 2015. Analy‐sis of resistance phenotype to 52 Aeromonas veronii from different freshwater fish［J］. Chinese Journal of Veterinary Drug，49（6）：1-5.］

郭煥裕，王亮，葛海霞. 2022. 中草藥在抗水產動物致病菌中的應用［J］. 安徽農業(yè)科學，50（2）：19-22.［ Guo H Y，Wang L，Ge H X. 2022. Application of Chinese herbal medicine in pathogenic bacteria of aquatic animals［J］. Journal of Anhui Agricultural Sciences，50（2）：19-22.］ doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.02.006.

郭雷鋒. 2022. 紅螯螯蝦抗維氏氣單胞菌相關基因的篩選及PLD基因的鑒定和功能分析［D］. 泰安：山東農業(yè)大學. ［Guo L F. 2022. Screening of genes related to the resis‐tance of Cherax quadricarinatus to Aeromonas veronii and identification and expression analysis of PLD gene［D］. Tai’an：Shandong Agricultural University.］ doi：10. 27277/d.cnki.gsdnu.2022.000120.

韓語，潘紀汶，王昕，楊諾，郭桂英，李遷，曾紀鋒，鄭繼平. 2022. 泥鰍維氏氣單胞菌的毒力基因與耐藥特性分析［J］. 水產科學，41（4）：564-572.［ Han Y，Pan J W，Wang X，Yang N，Gou G Y，Li Q，Zeng J F，Zheng J P. 2022. Virulence genes and antibiotic resistance characteristics of pathogenic Aeromonas veronii isolated from loach Misgur‐nus anguillicaudatus［J］. Fisheries Science，41（4）：564-572.］ doi：10.16378/j.cnki.1003-1111.20180.

侯天牧，項維，王玲玲，郭忠寶，吳利軍，張付賢. 2023. 烏梅-全蝎雙藥方對氣單胞菌混合感染大口黑鱸的治療效果分析［J］. 中國畜牧獸醫(yī)，50（3）：1259-1270.［ Hou T M，Xiang W，Wang L L，Gou Z B，Wu L J，Zhang F X. 2023. Effect of Fructus mume-Scorpion double prescription on Micropterus salmoides co-infected with Aeromonas［J］. China Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine，50（3）：1259-1270.］ doi：10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.03.040.

賈俊鵬，張冬星，康元環(huán)，張海月，孫武文，單曉楓，錢愛東. 2018.黃金鯽致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析［J］.中國獸醫(yī)學報，38（4）：716-721.［ Jia J P，Zhang D X，Kang Y H，Zhang H Y，Sun W M，Shan X F，Qian A D. 2018. Isolation，identification and drug susceptibility of pathogenic Aeromonas veronii from Golden crucian carp［J］. Chinese Journal of Veterinary Science，38（4）：716-721.］ doi：10.16303/j.cnki.1005-4545.2018.04.19.

康元環(huán)，張冬星，楊濱僮，張賀亮，孫武文，單曉楓，錢愛東. 2018. 維氏氣單胞菌最新研究進展［J］.中國人獸共患病學報，34（5）：452-459.［ Kang Y H，Zhang D X，Yang B T，Zhang H L，Sun W M，Shan X F，Qian A D. 2018. Latest research progress on Aeromonas veronii［J］. Chinese Jour‐nal of Zoonoses，34（5）：452-459.］ doi：10.3969/j.issn.1002-2694.2018.00.064.

勞錦程，李佳洋，譚洪新，劉文暢，羅國芝. 2023. 黃連對生物絮凝系統(tǒng)氨氮處理效率的影響［J］. 漁業(yè)現代化，50（5）：8-14.［ Lao J C，Li J Y，Tan H X，Liu W C，Luo G Z. 2023. Effects of different concentrations of Rhizoma coptidis on ammonia nitrogen treatment capacity of biofloc techno-logy system［J］. Fishery Modernization，50（5）：8-14.］ doi：10.3969/j.issn.1007-9580.2023.05.002.

雷寧，郝貴杰，黃愛霞，王雨辰，林峰，沈小明，朱俊杰. 2022. 大口黑鱸（Micropterus salmoides）致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定及其特性分析［J］. 海洋與湖沼，53（5）：1180-1188. ［Lei N，Hao G J，Huang A X，Wang Y C，Lin F，Shen X M，Zhu J J. 2022. Isolation and identification of pathogenic Aeromonas veronii in Micropterus salmoides ［J］. Oceanologia et Limnologia Sinica，53（5）：1180-1188.］ doi：10.11693/hyhz20220200045.

羅君， 付偉杰， 楊二軍， 黃建盛， 謝瑞濤， 陳剛. 2022. 槲皮素對雜交石斑魚生長性能、抗氧化能力和腸道菌群的影響［J］. 廣東海洋大學學報， 42（ 4）： 13-22.［ Luo J， Fu W J， Yang E J， Huang J S， Xie R T， Chen G. 2022. Effects of quercetin on growth performance， antioxidant capacity and intestinal microflora of hybrid grouper （Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus polyphekadion ）［J］. Jour‐nal of Guangdong Ocean University，42（4）：13-22.］ doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2022.04.002.

馬秀慧，姜海波，羅學評，張安青，羅榮能，董維鳳，程振濤，文明，姜志強. 2018. 中草藥對羅非魚源維氏氣單胞菌體外抑菌效果研究［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，（16）：174-176.［ Ma X H，Jiang H B，Luo X P，Zhang A Q，Luo R N，Dong W F，Chen Z T，Wen M，Jiang Z Q. 2018. Study on the bacte‐riostatic effect of Chinese herbal medicine on Aeromonas aeruginosa from tilapia in vitro［J］. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，（16）：174-176.］ doi：10. 13881/j.cnki.hljxmsy.2017.12.0192.

喬丹，秦華，李嘉瀅，關靜，馬英淇，王曉玲. 2022. 水蛭的生理特性及養(yǎng)殖前景［J］. 農業(yè)技術與裝備，（4）：107-109.［ Qiao D，Qin H，Li J Y，Guan J，Ma Y Q，Wang X L. 2022. Physio-logical characteristics and breeding prospect of leech［J］. Agricultural Technology amp; Equipment，（4）：107-109.］ doi：10.3969/j.issn.1673-887X.2022.04.037.

邵貴燕. 2023. 寬體金線蛭“紅腫病”細菌性病原菌分離及致病機理研究［D］. 鹽城：鹽城工學院.［ Shao G Y. 2023. Study on bacterial pathogen isolation and pathogenic mechanism of Whitmania pigra with erysipelas［D］. Yan-cheng：Yancheng Institute of Technology.］ doi：10.44381/d.cnki.gycit.2023.000022.

王寶屯，顏遠義，毛燦，馮娟，鄧益琴，蘇友祿. 2021. 82種中草藥及其復方對花鱸源維氏氣單胞菌的體外抑菌效果［J］. 華南師范大學學報（自然科學版），53（3）：64-72.［ Wang B T，Yan Y Y，Mao C，Feng J，Deng Y Q，Su Y L. 2021. The antibacterial effect of 82 kinds of Chinese herbal medi‐cines and their compounds on Aeromonas vernoii from Lateolabrax maculatus in vitro［J］. Journal of South China Normal University（ Natural Science Edition），53（3）：64-72.］ doi：10.6054/j.jscnun.2021043.

王海華，付輝云，王帥兵，馬本賀，熊良偉，李涵，王夢杰，李燕華. 2023. 螞蟥水腫病病原的分離鑒定與藥敏分析［J/OL］. 中國動物傳染病學報.（ 2023-01-03）［ 2024-05-08］. https：//kns.cnki.net/kcms/detail//31.2031.S.20230103. 1407.007.html.［ Wang H H，Fu H Y，Wang S B，Ma B H，Xiong L W，Li H，Wang M J，Li Y H. 2023. Isolation，iden‐tification and susceptibility test of the pathogen of lethal edema of Whitmania Pigra［J/OL］. Chinese Journal of Ani‐mal Infectious Diseases.（ 2023-01-03）［2024-05-08］. https：//kns.cnki.net/kcms/detail//31.2031.S.20230103.1407.007.html.］ doi：10.19958/j.cnki.cn31-2031/s.20230103.006.

王淑嫻，許拉，樊英，王友紅，葉海斌，吳海一. 2022. 水蛭來源熒光假單胞菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析［J］. 河北漁業(yè)，（11）：13-15.［ Wang S X，Xu L，Fan Y，Wang Y H，Ye H B，Wu H Y. 2022. Isolation，identification and phyloge‐netic tree analysis of pseudomonas fluorescens from leeches［J］. Hebei Fisheries，（11）：13-15.］ doi：10.3969/j.issn.1004-6755.2022.11.004.

王維，李長紅，詹萍萍，陳炯. 2022. 一株引起大彈涂魚出血癥的維氏氣單胞菌的分離及鑒定［J］. 農業(yè)生物技術學報，30（2）：344-355. ［Wang W，Li C H，Zhan P P，Chen J. 2022. Isolation and identification of a Aeromonas veronii strain causing the hemorrhagic disease of great blue-spotted mudskipper（ Boleophthalmus pectinirostris）［J］. Journal of Agricultural Biotechnology，30（2）：344-355.］ doi：10.3969/j.issn.1674-7968.2022.02.013.

王興麗，汪開毓，陳德芳，朱劼垚，楊倩，賀揚，王二龍. 2016. 一株虹鱒源維氏氣單胞菌的分離鑒定及組織病理學觀察［ J］. 中國預防獸醫(yī)學報，38（11）：879-883.［ Wang X L，Wang K Y，Chen D F，Zhu J Y，Yang Q，He Y，Wang E L. 2016. Isolation and identification of Aeromonas veronii from rainbow trout and histopathology study of the di-seased fish［J］. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，38（11）：879-883.］ doi：10.3969/j.issn.1008-0425. 2016.11.09.

吳雷明，王守紅，張家宏，寇祥明，韓光明，畢建花，王桂良，唐鶴軍，徐榮，朱凌宇. 2019. 不同孵化基質和開口餌料對寬體金線蛭生長發(fā)育的影響［J］.水產科學，38（2）：260-265.［ Wu L M，Wang S H，Zhang J H，Kou X M，Han G M，Bi J H，Wang G L，Tang H J，Xu R，Zhu L Y. 2019. Effects of different Incubation matrices and weaning foods on growth and development of leech Whitmania pigra［J］. Fisheries Science，38（2）：260-265.］ doi：10.16378/j.cnki. 1003-1111.2019.02.018.

項明源. 2020. 副豬嗜血桿菌生物被膜的生物學特征及轉錄組分析［D］. 雅安：四川農業(yè)大學.［ Xiang M Y. 2020. Biological characteristics and transcriptome analysis of Haemophilus parasuis biofilm［J］. Ya’an：Sichuan Agri-cultural University.］ doi：10.27345/d.cnki.gsnyu.2020.00

1181.

徐先棟，李燕華，王海華，吳斌，陶志英，習宏斌. 2018 .臺灣泥鰍幼魚紅點病病原的分離鑒定及藥敏分析［J］. 水產科學，37（4）：522-526.［ Xu X D，Li Y H，Wang H H，Wu B，Tao Z Y，Xi H B. 2018. Isolation，identification and drug sensitivity of a pathogen causing punctate hemorrhag in farmed Taiwan loach fingerlings［J］. Fisheries Science，37（4）：522-526.］ doi：10.16378/j.cnki.1003-1111.2018.04.014.

許瑞平，朱雨，劉軍，余登航，徐洪森. 2023. 40種中草藥對維氏氣單胞菌體外抑菌效果比較［J］. 武漢輕工大學學報，42（3）：52-58. ［Xu R P，Zhu Y，Liu J，Yu D H，Xu H S. 2023. Comparison the bacteriostatic effect of 40 kinds of Chinese herbal medicines on Aeromonas veronii in vitro［J］. Journal of Wuhan Polytechnic University，42（3）：52-58.］ doi：10.3969/j.issn.2095-7386.2023.03.008.

楊超. 2022. 大口黑鱸源維氏氣單胞菌的分離鑒定及其對宿主免疫應答的影響［D］. 上海：上海海洋大學.［ Yang C. 2022. Isolation and identification of Aeromonas veronii from diseased Micropterus salmoides and its effect on host immune［J］. Shanghai：Shanghai Ocean University.］ doi：10.27314/d.cnki.gsscu.2022.000498.

元麗花. 2022. 草魚源維氏氣單胞菌毒力基因及耐藥性分析［J］. 福建農業(yè)科技，53（3）：13-19.［ Yuan L H. 2022. Analy‐sis on the virulence genes and drug resistance of Aeromo‐nas veronii in Ctenopharyngodon idellus［J］. Fujian Agri‐cultural Science and Technology，53（3）：13-19.］ doi：10. 13651/j.cnki.fjnykj.2022.03.003.

張桓橋，商寶娣，張效平，周賢君，趙鳳，李小義，孔杰，楊星，陶莎. 2022. 31種中草藥及其復方對維氏氣單胞菌體外抑菌研究［J］. 淡水漁業(yè)，52（3）：74-81.［ Zhang H Q，Shang B D，Zhang X P，Zhou X J，Zhao F，Li X Y，Kong J，Yang X，Tao S. 2022. The antibacterial effect of 31 kinds of Chi‐nese herbal medicines and their compounds on Aeromonas vernoii in vitro［J］. Freshwater Fisheries，52（3）：74-81.］ doi：10.13721/j.cnki.dsyy.2022.03.006.

張明洋，胡安東，程振濤，姜海波，文明. 2020. 虹鱒弗氏檸檬酸桿菌的分離鑒定與多位點序列分型［J］. 基因組學與應用生物學，39（6）：2521-2528.［ Zhang M Y，Hu A D，Cheng Z T，Jiang H B，Wen M. 2020. Identification of the Citro‐bacter freundii in Oncorhynchus mykiss by multilocus sequence typing［J］. Genomics and Applied Biology，39（6）：2521-2528.］ doi：10.13417/j.gab.039.002521.

張平香，魏朝輝，鄭程鵬，張洵，張棋，蔣佳輝，羅楊志，喻運珍，艾桃山，張立強，朱文歡，黃天樂，鄧平. 2023. 一株黃顙魚源維氏氣單胞菌的分離鑒定及其對10種中草藥的敏感性研究［J］. 水產科技情報，50（3）：176-180.［ Zhang P X，Wei C H，Zheng C P，Zhang X，Zhang Q，Jiang J H，Luo Y Z，Yu Y Z，Ai T S，Zhang L Q，Zhu W H，Huang T L，Deng P. 2023. Isolation and identification of a strain of Aeromonas veronii from Pelteobagms fulvidraco and drug susceptibility to 10 kinds of Chinese herbal medicines［J］. Fisheries Scienceamp;Technology Information，50（3）：176-180.］ doi：10.16446/j.fsti.20220700105.

張曉君，房海，陳翠珍，鞏元芳. 2006. 寬體金線蛭嗜水氣單胞菌感染的病原檢驗［J］. 微生物學通報，33（1）：46-52. ［Zhang X J，Fang H，Chen C Z，Gong Y F. 2006. Examina‐tion of A. hydrophila isolated from Whitmania pigra （L.） ［J］. Microbiology China，33（1）：46-52.］ doi：10.13344/j.microbiol.china.2006.01.011.

朱成科，王建，周燕，雷駱，鄧星星，蒲德成，鄭宗林，周朝偉，鄭永華. 2018. 150種中草藥體外抑殺維氏氣單胞菌的藥效研究［J］. 淡水漁業(yè)，48（1）：80-85.［

Zhu C K，Wang J，Zhou Y，Lei L，Deng X X，Pu D C，Zheng Z L，Zhou C W，Zheng Y H. 2018. Antimicrobial activities for 150 kinds of Chinese herbal medicines agsinst Aeromonas veronii in vitro［J］. Freshwater Fisheries，48（1）：80-85.］ doi：10.13721/j.cnki.dsyy.2018.01.013.Deng Y T，Wu Y L，Tan A P，Huang Y P，Jiang L，Xue H J，

Wang W L，Luo L，Zhao F. 2014. Analysis of antimicrobial resistance genes in Aeromonas spp. isolated from cultured freshwater animals in China［J］. Microbial Drug Resistance，20（4）：350-356. doi：10.1089/mdr.2013.0068.

Dey A，Bokka V，Sen S. 2020. Dependence of bacterial growth rate on dynamic temperature change［s J］. IET Systems Bio-logy，14（2）：68-74. doi：10.1049/iet-syb.2018.5125.

Králová S，Staňková E，Sedlá?ek I. 2016. Classification of Aeromonas spp. isolated from water and clinical sources and distribution of virulence genes［J］. Folia Microbiolo-gica，61（6）：513-521. doi：10.1007/s12223-016-0464-9.

Maiden M C，Bygraves J A，Feil E，Morelli G，Russell J E，Urwin R，Zhang Q，Zhou J，Zurth K，Caugant D A，Fea-vers I M，Achtman M，Spratt B G. 1998. Multilocus sequence typing：A portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，95（6）：3140-3145. doi：10. 1073/pnas.95.6.3140.

Martino M E，Fasolato L，Montemurro F，Rosteghin M，Man‐frin A，Patarnello T，Novelli E，Cardazzo B. 2011. Determi‐nation of microbial diversity of Aeromonas strains on the basis of multilocus sequence typing，phenotype，and presence of putative virulence genes［J］. Applied and Envi‐ronmental Microbiology，77（14）：4986-5000. doi：10.1128/AEM.00708-11.

Nakamura S，Ochiai K，Hatai H，Ochi A，Sunden Y，Umemura T. 2011. Pathogenicity of avian leukosis viruses related to fowl glioma-inducing virus［J］. Avian Pathology，40（5）：499-505. doi：10.1080/03079457.2011.605783.

Nawaz M，Khan S A，Khan A A，Sung K，Tran Q，Kerdahi K，Steele R. 2010. Detection and characterization of virulence genes and integrons in Aeromonas veronii isolated from catfish［J］. Food Microbiology，27（3）：327-331. doi：10. 1016/j.fm.2009.11.007.

Ran C，Qin C B，Xie M X，Zhang J X，Li J，Xie Y D，Wang Y B，Li S N，Liu L H，Fu X Z，Lin Q，Li N Q，Liles M R，Zhou Z G. 2018. Aeromonas veronii and aerolysin are important for the pathogenesis of motile aeromonad septi‐cemia in cyprinid fish［J］. Environmental Microbiology，20（9）：3442-3456. doi：10.1111/1462-2920.14390.

Sen K，Rodgers M. 2004. Distribution of six virulence factors in Aeromonas species isolated from US drinking water utilities：A PCR identification［J］. Journal of Applied Mi-crobiology，97（5）：1077-1086. doi：10.1111/j.1365-2672. 2004.02398.x.

Wu C，Labrie J，Tremblay Y D，Haine D，Mourez M，Jacques M. 2013. Zinc as an agent for the prevention of biofilm for‐mation by pathogenic bacteria［J］. Journal of Applied Mi-crobiology，115（1）：30-40. doi：10.1111/jam.12197.

Yang X G，Wang D，Zhou Q，Nie F，Du H F，Pang X L，Fan Y Z，Bai T T，Xu Y. 2019. Antimicrobial susceptibility tes-ting of Enterobacteriaceae：Determination of disk content and Kirby-Bauer breakpoint for ceftazidime/avibactam ［J］. BMC Microbiology，19（1）：240. doi：10.1186/s12866-019-1613-5.

（責任編輯 劉可丹）