摘要：【目的】建立一套適用于木姜葉柯SRAP-PCR的最佳反應(yīng)體系，篩選出應(yīng)用于木姜葉柯種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的多態(tài)性引物，為后續(xù)木姜葉柯保護(hù)遺傳學(xué)研究及其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā坎捎脝我蛩卦囼?yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，對(duì)SRAP-PCR擴(kuò)增效果的主要影響因素（模板DNA用量、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶用量和引物濃度）進(jìn)行優(yōu)化。利用最佳反應(yīng)體系篩選出適用于木姜葉柯的SRAP多態(tài)性引物?！窘Y(jié)果】?jī)?yōu)化獲得木姜葉柯SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系（20.00 μL）：10×PCR Buffer 2.00 μL，Taq DNA聚合酶1.50 U，dNTPs 0.25 mmol/L，引物濃度0.600 μmol/L和模板DNA 30.00 ng。各因素對(duì)木姜葉柯PCR擴(kuò)增效果影響程度排序：引物濃度gt;dNTPs濃度gt;Taq DNA聚合酶用量gt;模板DNA用量。應(yīng)用優(yōu)化后的SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系和篩選到的20對(duì)多態(tài)性引物對(duì)3個(gè)居群的24個(gè)木姜葉柯樣本進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4對(duì)SRAP引物從3個(gè)野生木姜葉柯居群24個(gè)樣本中共擴(kuò)增出38個(gè)位點(diǎn)，每對(duì)引物平均擴(kuò)增出9.5個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)共21個(gè)，多態(tài)性比率為55.26%。3個(gè)木姜葉柯居群的平均等位基因數(shù)（Na）、平均有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性（H'）和Shannon’s信息指數(shù)（I）分別為1.55、1.30、0.18和0.27，總遺傳多樣性（Ht）、居群內(nèi)遺傳多樣性（Hs）和遺傳分化系數(shù)（Gst）分別為0.18、0.11和0.36，基因流（Nm）為0.90（lt;1.00），說(shuō)明3個(gè)居群間存在一定程度的基因交流，但基因交流程度有限?！窘Y(jié)論】木姜葉柯SRAP-PCR擴(kuò)增效果對(duì)引物濃度最敏感。建立木姜葉柯的SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系和篩選到的SRAP引物擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定，多態(tài)性豐富，能較好地反映

出不同木姜葉柯個(gè)體和居群間的親緣關(guān)系，可應(yīng)用于木姜葉柯種質(zhì)資源的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析。

關(guān)鍵詞：木姜葉柯；SRAP-PCR；反應(yīng)體系；優(yōu)化；引物篩選；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S567.19文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2024）11-3231-11

Optimization of SRAP-PCR reaction system， primer screeningand verification for Lithocarpus litseifolius

LUO Chao-ying1， YAN Wu-ping1， WANG Yu-ling1，2， WANG Meng-xing1， PENG Sha1，LIAO Hong1， CHENG Jian-feng1*

（1School of Agricultural Sciences， Jiangxi Agricultural University， Nanchang， Jiangxi 330045， China；2School of Breeding and Multiplication（ Sanya Institute of Breeding and Multiplication）， Hainan University， Sanya，Hainan 572025， China）

Abstract：【Objective】To establish an optimal reaction system applicable to SRAP-PCR of Lithocarpus litseifolius， and screen out polymorphic primers for the genetic diversity analysis of L. litseifolius germplasm resources， thereby pro‐viding scientific basis for the subsequent studies on conservation genetics and its development and utilization.【 Method】The combination of single-factor experiment and orthogonal experiment was adopted to optimize the main influencing fac‐tors（ template DNA amount， dNTPs concentration，Taq DNA polymerase amount and primer concentration） affecting the amplification effect of SRAP-PCR. Using optimal reaction system， SRAP polymorphic primers suitable for L. litseifoliuswere screened.【 Result】The optimal reaction system for SRAP-PCR of L. litseifolius（ 20.00 μL） was obtained as follows：10× PCR Buffer 2.00 μL，Taq DNA polymerase 1.50 U， dNTPs 0.25 mmol/L， primer concentration 0.600 μmol/L and tem‐plate DNA 30.00 ng. The degree of influence of each factor on the PCR amplification effect of L. litseifolius was ranked as follows：primer concentration gt; dNTPs concentration gt;Taq DNA polymerase amount gt; template DNA amount. Using the optimized SRAP-PCR optimal reaction system and the selected 20 pairs of polymorphic primers for SRAP-PCR amplifica‐tion of 24 samples from 3 populations of L. litseifolius， it was found that 4 pairs of SRAP primers amplified a total of 38 loci from the 24 samples of the 3 wild populations， with an average of 9.5 loci per pair of primers. Among them， 21 loci were polymorphic， with a polymorphic rate of 55.26%. The average number of alleles（Na）， average effective number of alleles（Ne）， Nei’s gene diversity（H'）， and Shannon’s information index（I） of the 3 populations of L. litseifolius were 1.55， 1.30， 0.18 and 0.27 respectively. The total genetic diversity（Ht）， within-population genetic diversity（Hs）， and genetic differentiation coefficient（Gst） were 0.18， 0.11 and 0.36 respectively. The gene flow（Nm） was 0.90（lt;1.00）， in‐dicating that there was a certain degree of gene exchange among the 3 populations， but the degree of gene exchange was limited. 【Conclusion】The amplification effect of SRAP-PCR of L. litseifolius is most sensitive to primer concentration. The established optimal reaction system of SRAP-PCR of L. litseifolius and the selected SRAP primers produce clear and stable amplification bands with rich polymorphism， which can better reflect the genetic relationships among different indi‐viduals and populations， and can be applied to the analysis of genetic diversity and genetic structure of L. litseifolius germ‐plasm resources.

Key words：Lithocarpus litseifolius； SRAP-PCR； reaction system； optimization； primer screening； genetic diversity

Foundation items：National University Students Innovation and Entrepreneurship Training Plan Project（20201041 0005X）； Science and Technology Research Project of Jiangxi Department of Education（GJJ20295， GJJ200445）； Doc‐toral Research Start-up Foundation Project of Jiangxi Agricultural University（9232309477）

0 引言

【研究意義】木姜葉柯（Lithocarpus litseifolius）俗稱甜茶，素有“樹上蟲草”“輻射的克星”“長(zhǎng)壽茶”的美譽(yù)（彭勇等，2020），是殼斗科柯屬高大喬木（中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1997），廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)，以江西與福建交界的武夷山脈分布最廣（林協(xié)全等，2023）。木姜葉柯富含多種生物活性物質(zhì)且安全無(wú)毒，兼具藥、茶、糖3種功能（萬(wàn)藍(lán)婷， 2022），但目前在開發(fā)利用上基本依靠野生資源，過(guò)度采挖導(dǎo)致木姜葉柯野生資源逐年減少，發(fā)掘優(yōu)良種質(zhì)資源，對(duì)緩解木姜葉柯供需矛盾問題已勢(shì)在必行。評(píng)估遺傳變異對(duì)于保護(hù)和開發(fā)該物種的遺傳資源至關(guān)重要。SRAP分子標(biāo)記技術(shù)是通過(guò)獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增開放閱讀框的特定區(qū)域，多態(tài)性取決于不同個(gè)體及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不同，具有操作簡(jiǎn)單、高共顯性、多態(tài)性高、在基因組中分布均勻等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建等研究（Yan et al.，2019；毛立彥等，2023；孫陽(yáng)陽(yáng)等，2023；丁海麥等，2024）。因此，探究木姜葉柯SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系，并應(yīng)用于木姜葉柯遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，對(duì)木姜葉柯種質(zhì)資源保護(hù)與利用具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前木姜葉柯的研究主要集中在對(duì)其藥用功能成分提取和測(cè)定及藥理功能分析等方面（彭勇等，2020），有關(guān)種質(zhì)資源的研究報(bào)道較少，僅Cheng等（2016）利用11個(gè)SSR分子標(biāo)記分析我國(guó)6個(gè)?。▍^(qū)）共11個(gè)木姜葉柯種群的遺傳變異和種群結(jié)構(gòu)。由于木姜葉柯種質(zhì)資源相關(guān)研究報(bào)道較少，導(dǎo)致育種工作停滯不前，阻礙了木姜葉柯潛在藥用價(jià)值的研究與開發(fā)。木姜葉柯葉片表型遺傳變異豐富，不同地區(qū)間葉片的主要活性成分含量也存在豐富的變異（萬(wàn)藍(lán)婷，2022；趙鵬霞等，2023）。因此，探究木姜葉柯野生種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)是其種質(zhì)創(chuàng)新和遺傳改良的必由之路，也是其野生資源有效保護(hù)的重要手段。由于SRAP分子標(biāo)記技術(shù)是采用獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增開放閱讀框的特定區(qū)域，能全面體現(xiàn)不同個(gè)體間的多態(tài)性，已廣泛應(yīng)用在栝樓（何慶元等，2023）、黃精（李亞萍等，2023）和金線蓮（黃錦春等，2023）等藥用植物的遺傳多樣性分析。SRAP-PCR反應(yīng)體系中各因子濃度或用量均會(huì)影響其擴(kuò)增結(jié)果，且不同物種適宜的反應(yīng)體系也不盡相同（王燕等，2007；嚴(yán)武平等，2018；孫秀秀等，2021；趙琦琦等，2022）。梁芳瑜等（2021）采用單因素結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化了寬葉纈草SRAP-PCR反應(yīng)體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各因素對(duì)寬葉纈草SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響程度排序?yàn)門aq Mixgt;Taq DNA聚合酶gt;Mg2+gt;DNA模板。胡小虎等（2022）采用單因素分析法建立獨(dú)腳金的SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)dNTPs和Taq DNA聚合酶對(duì)擴(kuò)增效率的影響最大?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】建立一套適用于木姜葉柯的SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系是基于SRAP分子標(biāo)記進(jìn)行木姜葉柯種質(zhì)資源遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析的前提。但目前尚未見有關(guān)木姜葉柯SRAP-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及驗(yàn)證的相關(guān)研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)的方法，對(duì)影響PCR擴(kuò)增效果的主要因素（模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶和引物）進(jìn)行優(yōu)化，建立一套適用于木姜葉柯的SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系，并應(yīng)用該體系篩選適用于木姜葉柯的SRAP多態(tài)性引物，為木姜葉柯野生資源保護(hù)和遺傳育種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試木姜葉柯資源種質(zhì)收集于江西吉安市和萍鄉(xiāng)市，經(jīng)江西農(nóng)業(yè)大學(xué)程建峰教授鑒定為木姜葉柯，材料居群編號(hào)：FGS、HKC和MYX（表1）。植物基因組DNA提取試劑盒（DE-06111）購(gòu)自成都福際生物技術(shù)有限公司；DL2000 DNA Marker、Taq DNA聚合酶（Mg2+ plus Buffer）和dNTP Mix均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。主要儀器設(shè)備：TG-16E離心機(jī)（博科控股集團(tuán)有限公司）、GS-521T一體式凝膠成像系統(tǒng)（上海騁克儀器有限公司）、DYY-6D型電泳儀（北京市六一儀器廠）、A300基因擴(kuò)增儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）、NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（ThermoFisher Scientific公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 木姜葉柯基因組DNA提取 從3個(gè)居群中選取24株健康無(wú)病蟲害的植株，摘取其健康嫩葉，液氮速凍帶回實(shí)驗(yàn)室。采用植物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取嫩葉基因組DNA，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)評(píng)估DNA純度和濃度。經(jīng)檢測(cè)合格的DNA樣品置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參考嚴(yán)武平等（2018）的方法設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)?；趯?shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行單因素試驗(yàn)。反應(yīng)體系20.00 μL：10×PCR Buffer 2.00 μL，Taq DNA聚合酶（含Mg2+）1.50 U，dNTPs 0.20 mmol/L，引物濃度0.400 μmol/L，模板DNA 20.00 ng，ddH2O補(bǔ)足至20.00 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 1 min，退火溫度（據(jù)各引物設(shè)定）1 min，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物4 ℃保存。按照以上擴(kuò)增程序和反應(yīng)體系對(duì)Li和Quiros（2001）公布的96對(duì)SRAP引物進(jìn)行初篩，選擇擴(kuò)增條帶清晰且多態(tài)性良好的引物組合ME1-EM8進(jìn)行反應(yīng)體系優(yōu)化。設(shè)計(jì)10個(gè)梯度的模板DNA用量、引物濃度、dNTPs濃度和Taq DNA聚合酶用量，開展單因素試驗(yàn)（表2）。采用直觀法確定各因素在木姜葉柯SRAP-PCR反應(yīng)體系中的適宜濃度范圍。

1. 2. 3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于單因素試驗(yàn)篩出的各因素適宜濃度范圍，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L16

（44），每個(gè)組合設(shè)3次重復(fù)。參考張尚文等（2023）的直觀分析法進(jìn)行評(píng)分，以擴(kuò)增條帶數(shù)目、擴(kuò)增背景、條帶清晰度和亮度等作為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，滿分為16分，評(píng)分越高，表示擴(kuò)增效果越好。K表示某因素不同水平下的評(píng)分平均值，反映各水平的擴(kuò)增效果；R表示同一因素不同處理水平評(píng)分平均值的極差，反映各因素對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響程度，根據(jù)評(píng)分結(jié)果確定木姜葉柯SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系，取3次重復(fù)得分的平均值。

1. 2. 4 木姜葉柯SRAP多態(tài)性引物篩選 參照Li和Quiros（2001）公布的SRAP引物序列信息（表3），委托北京擎科生物科技股份有限公司合成。以FGS居群的1個(gè)樣本基因組DNA為模板，利用建立的SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系對(duì)96對(duì)SRAP引物組合進(jìn)行篩選，選擇條帶清晰度高、背景明亮、條帶數(shù)量多的引物組合作為木姜葉柯SRAP多態(tài)性分析的候選引物。

1. 2. 5 木姜葉柯SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系及多態(tài)性引物穩(wěn)定性驗(yàn)證 選擇3個(gè)木姜葉柯居群（FGS、HKC和MYX）共24個(gè)樣本的基因組DNA為模板，基于建立的最佳反應(yīng)體系和4個(gè)候選引物（ME7-EM1、ME7-EM2、ME8-EM4和ME8-EM8）進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證優(yōu)化后反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和多態(tài)性引物的有效性。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行讀帶。將電泳圖譜上清晰可見且可重復(fù)的條帶標(biāo)記為“1”，同一位點(diǎn)無(wú)條帶標(biāo)記為“0”，生成0，1矩陣。使用Pop‐gene version 1.32分析生成的0，1矩陣，以估算供試居群的遺傳多樣性參數(shù)。使用MEGA version 6.06的非加權(quán)配對(duì)平均法（UPGMA）計(jì)算遺傳距離，并以此進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 木姜葉柯基因組DNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

24份木姜葉柯葉片基因組DNA提取結(jié)果如圖1所示。提取的基因組DNA條帶清晰，有輕微拖帶和無(wú)彌散現(xiàn)象，經(jīng)NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)OD260 nm/OD280 nm為1.80～2.00，表明提取的基因組DNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2. 2 模板DNA用量對(duì)木姜葉柯PCR擴(kuò)增效果的影響

由圖2可知，10個(gè)模板DNA用量梯度中，多數(shù)濃度均能產(chǎn)生擴(kuò)增條帶，但擴(kuò)增條帶在數(shù)量和清晰度等方面存在差異，當(dāng)模板DNA用量低于10.00 ng，擴(kuò)增條帶數(shù)量不穩(wěn)定且條帶偏模糊，可能是模板DNA用量過(guò)少導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)量低；當(dāng)模板DNA用量為10.00～80.00 ng，擴(kuò)增條帶清晰且?guī)位疽恢?；而?dāng)模板DNA用量大于80.00 ng，可能是DNA樣本中殘留的某些抑制物含量增多，從而抑制了PCR擴(kuò)增反應(yīng)，導(dǎo)致條帶數(shù)減少?；诮?jīng)濟(jì)節(jié)約的目的，在20.00 μL反應(yīng)體系中選擇10.00～40.00 ng的模板DNA用量進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2. 3 dNTPs濃度對(duì)木姜葉柯PCR擴(kuò)增效果的影響

由圖3可知，當(dāng)dNTPs濃度為0.05～0.20 mmol/L，擴(kuò)增條帶不清晰，可能是參與合成的原材料不足，導(dǎo)致無(wú)法充分合成產(chǎn)物；當(dāng)dNTPs濃度為0.25～0.40 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶清晰且豐富；而dNTPs濃度大于0.60 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶又開始模糊并減少。綜合評(píng)估，選擇dNTPs濃度范圍為0.25～0.40 mmol/L進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2. 4 Taq DNA聚合酶用量對(duì)PCR擴(kuò)增效果的影響

由圖4可知，當(dāng)Taq DNA聚合酶用量低于0.50 U，擴(kuò)增條帶不完整；隨著Taq DNA聚合酶用量的不斷增加，擴(kuò)增條帶開始逐漸清晰且穩(wěn)定；當(dāng)Taq DNA聚合酶用量超過(guò)3.00 U后，擴(kuò)增條帶又開始模糊并減少。基于經(jīng)濟(jì)節(jié)約的目的，選擇0.50～2.00 U的Taq DNA聚合酶用量進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2. 5 引物濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效果的影響

由圖5可知，當(dāng)引物濃度低于0.20 μmol/L時(shí)，PCR擴(kuò)增效果差，擴(kuò)增條帶少且模糊；隨著引物濃度的升高，擴(kuò)增條帶清晰且?guī)乌呌诜€(wěn)定；當(dāng)引物濃度超過(guò)0.600 μmol/L時(shí)，引起了錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增。因此，選擇0.200～0.600 μmol/L引物濃度進(jìn)行后續(xù)的正交試驗(yàn)。

2. 6 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)確定的各因素適宜濃度和用量范圍，選用L1（644）正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，結(jié)果如圖6和表4所示。雖選擇的濃度均是較適宜的范圍，但不同組合所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶質(zhì)量差異顯著。如組合1、組合7、組合10和組合13均未出現(xiàn)明顯擴(kuò)增條帶，表明擴(kuò)增效果差；而組合3、組合4、組合5和組合8的擴(kuò)增條帶清晰且?guī)我恢拢瑪U(kuò)增效果最好。按照直觀分析法，將條帶亮度、數(shù)量、清晰度及背景混雜程度等作為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各個(gè)水平擴(kuò)增效果進(jìn)行評(píng)估打分，可得出組合9（20.00 μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.00 μL，Taq DNA聚合酶1.50 U，dNTPs 0.25 mmol/L，引物0.600 μmol/L，模板DNA 30.00 ng）的擴(kuò)增效果最好，擴(kuò)增產(chǎn)物清晰穩(wěn)定、條帶豐富。由R值可知，各因素對(duì)木姜葉柯PCR擴(kuò)增效果影響程度排序：引物濃度gt;dNTPs濃度gt;Taq DNA聚合酶用量gt;模板DNA用量。由此可見，引物濃度變化對(duì)木姜葉柯SRAP-PCR反應(yīng)最敏感。

2. 7 木姜葉柯SRAP多態(tài)性引物篩選

基于優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系，以1個(gè)FGS居群樣本的基因組DNA為模板，對(duì)96對(duì)SRAP引物進(jìn)行篩選（圖7），以背景清晰度和條帶數(shù)量為篩選指標(biāo)，獲得20對(duì)條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物組合（表5）。

2. 8 木姜葉柯SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系穩(wěn)定性驗(yàn)證

以地理位置相隔遠(yuǎn)和生境差異大的3個(gè)野生木姜葉柯居群（FGS、HKC和MYX）共24個(gè)樣本的基因組DNA為模板，利用上述SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系及篩選的4對(duì)多態(tài)性引物（ME7-EM1、ME7-EM2、ME8-EM4和ME8-EM8）進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增，部分結(jié)果如圖8所示。擴(kuò)增的條帶清晰、背景明亮、多態(tài)性豐富，表明優(yōu)化后SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系能穩(wěn)定擴(kuò)增木姜葉柯。

4對(duì)SRAP引物從3個(gè)野生木姜葉柯居群24個(gè)樣本中共擴(kuò)增出38個(gè)位點(diǎn)，每對(duì)引物平均擴(kuò)增出9.5個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)共21個(gè)，多態(tài)性比率為55.26%。由表6可知，3個(gè)木姜葉柯居群的平均等位基因數(shù)（Na）、平均有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性（H'）和Shannon’s信息指數(shù)（I）分別為1.55、1.30、0.18和0.27?；谶z傳多樣性參數(shù)計(jì)算出3個(gè)居群的總遺傳多樣性（Ht）和居群內(nèi)遺傳多樣性（Hs），再以此計(jì)算出不同居群間的遺傳分化系數(shù)（Gst）和基因流（Nm），結(jié)果顯示，3個(gè)居群的Ht為0.18，Hs為0.11，Gst為0.36，表明在總的遺傳變異中，居群間的遺傳變異占36.00%，居群內(nèi)的遺傳變異占64.00%，表明在居群內(nèi)和居群間均存在遺傳分化，主要遺傳變異存在于居群內(nèi)；Nm為0.90（lt;1.00），表明供試居群間雖存在一定的基因交流，但基因交流程度有限。利用UPGMA方法，基于遺傳距離對(duì)3個(gè)居群共24個(gè)樣本進(jìn)行聚類分析，在遺傳距離為0.11時(shí)，能將24個(gè)樣本分為三大類（圖9），聚類結(jié)果與地理距離不相關(guān)?？梢姡瑯?gòu)建的SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系和篩選到的多態(tài)性引物能較好地體現(xiàn)不同居群木姜葉柯的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。

2 討論

木姜葉柯是一種藥食兼用的天然植物資源，應(yīng)用廣泛，加強(qiáng)木姜葉柯種質(zhì)資源收集保護(hù)和評(píng)價(jià)是加快其育種產(chǎn)業(yè)化和開發(fā)利用步伐的前提（Chenget al.， 2016）。SRAP分子標(biāo)記是雙引物特異擴(kuò)增，具有多態(tài)性高和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)（Yan et al.， 2019），已被廣泛應(yīng)用在植物種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析等方面（姜武等，2023；王潔等，2023）。不同物種影響SRAP-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增效果的主要因素并不相同。陳蘭艷等（2019）研究表明，模板DNA用量和引物濃度對(duì)郁金香SRAP-PCR擴(kuò)增效率影響最大。謝秋霞等（2023）研究發(fā)現(xiàn)，Taq DNA聚合酶用量對(duì)雷公筍SRAP-PCR擴(kuò)增效果影響最小，引物濃度和dNTPs濃度對(duì)雷公筍SRAP-PCR擴(kuò)增效果影響最大。但本研究發(fā)現(xiàn)，一定范圍內(nèi)Taq DNA聚合酶和模板DNA用量的變化對(duì)木姜葉柯SRAP-PCR擴(kuò)增效果的影響較小，但引物濃度對(duì)木姜葉柯SRAP-PCR 擴(kuò)增效果影響最大，其次是dNTPs濃度，與海南油茶（戚華沙等，2020）和青蒿（石紫薇等，2020）的研究結(jié)果一致。引物是PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。引物濃度低會(huì)降低SRAP-PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增效率，濃度過(guò)高則會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，并易形成引物二聚體。

目前大多數(shù)分子標(biāo)記PCR反應(yīng)體系優(yōu)化試驗(yàn)主要采取單因素試驗(yàn)或正交試驗(yàn)確定最佳反應(yīng)體系，但單一試驗(yàn)方法無(wú)法綜合考慮各因素間的相互作用（趙宏宇等，2008；嚴(yán)武平等，2018）。例如，單因素試驗(yàn)雖能迅速地確定PCR反應(yīng)體系各組分的最適濃度范圍，但忽略了PCR反應(yīng)體系中各組分之間相互作用的影響。正交試驗(yàn)雖具有分散可比和齊整均衡等特點(diǎn)，可彌補(bǔ)各因素之間的相互影響，但往往選取的各組分濃度范圍并非最優(yōu)，導(dǎo)致得不到最佳擴(kuò)增效果。本研究先使用單因素試驗(yàn)確定反應(yīng)體系各組分的適宜濃度范圍，再結(jié)合正交試驗(yàn)，建立了一套木姜葉柯SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系（20.00 μL）：10×PCR Buffer 2.00 μL，Taq DNA聚合酶1.50 U，dNTPs 0.25 mmol/L，引物濃度0.600 μmol/L和模板DNA 30.00 ng。最后，通過(guò)3個(gè)不同木姜葉柯居群的24個(gè)樣本對(duì)SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系和多態(tài)性引物進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證，結(jié)果表明，優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系和篩選到的SRAP引物能很好地體現(xiàn)木姜葉柯種質(zhì)資源間的遺傳關(guān)系和物種的遺傳多樣性，可應(yīng)用于后續(xù)木姜葉柯種質(zhì)資源遺傳多樣性分析。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)的方法，優(yōu)化并建立了一套適用于木姜葉柯SRAP-PCR的最佳反應(yīng)體系（20.00 μL）：10×PCR Buffer 2.00 μL，Taq DNA聚合酶1.50 U，dNTPs 0.25 mmol/L，引物濃度0.600 μmol/L和模板DNA 30.00 ng，引物濃度對(duì)該反應(yīng)體系擴(kuò)增效果影響最大?；趦?yōu)化后的反應(yīng)體系，篩選得到20對(duì)高多態(tài)性SRAP引物，為木姜葉柯種質(zhì)資源的開發(fā)利用及種質(zhì)創(chuàng)新提供技術(shù)支撐。

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（責(zé)任編輯陳燕）