摘要：【目的】揭示附睪不同區(qū)段溶質(zhì)載體（SLC）蛋白的調(diào)控及功能差異，明確SLC基因家族在牦牛附睪中的表達情況，為提高牦牛繁育性能提供理論依據(jù)。【方法】從牦牛附睪頭、附睪體和附睪尾的上皮細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出54個SLC基因家族差異表達基因（DEGs），通過關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析篩選出關(guān)鍵基因，然后采用實時熒光定量PCR檢測DEGs在牦牛附睪不同區(qū)段上皮細胞中的表達情況?！窘Y(jié)果】在牦牛附睪頭vs附睪體中有SLC2A9、SLC8A1和SLC29A1等18個DEGs呈上調(diào)表達，SLC41A2、SLC40A1和SLC26A3等24個DEGs呈下調(diào)表達；在附睪頭vs附睪尾中有SLC16A2、SLC7A1和SLC2A9等17個DEGs呈上調(diào)表達，SLC39A4、SLC26A3和SLC40A1等15個DEGs呈下調(diào)表達；在附睪體vs附睪尾中有SLC5A3、SLC16A2和SLC46A3等6個DEGs呈上調(diào)表達，SLC25A20、SLC20A2和SLC27A1等6個DEGs呈下調(diào)表達。通過關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析篩選出13個關(guān)鍵基因：SLC41A2、SLC7A8、SLC26A3、SLC39A11、SLC30A4、SLC1A1、SLC7A2、SLCO2A1、SLC6A2、SLC22A17、SLC5A5、SLC22A18和SLC30A4。其中，SLC26A3基因是附睪頭vs附睪體、附睪頭vs附睪尾2組樣本的關(guān)鍵基因，且SLC26A3基因在附睪頭的相對表達量顯著高于附睪體和附睪尾（Plt;0.05）。牦牛附睪SLC基因家族在礦物質(zhì)吸收通路上富集的數(shù)量最多，其中SLC26A3基因參與礦物質(zhì)吸收和胰腺物分泌2條信號通路?！窘Y(jié)論】從牦牛附睪不同區(qū)段上皮細胞中篩選得到13個SLC基因家族調(diào)控基因，其中SLC26A3基因是附睪頭vs附睪

體、附睪頭vs附睪尾2組樣本的共有關(guān)鍵基因，通過調(diào)控礦物質(zhì)吸收而影響雄性牦牛的生殖能力。

關(guān)鍵詞：牦牛；附睪；上皮細胞；SLC基因家族；差異表達基因（DEGs）

中圖分類號：S823.85文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2024）11-3404-10

Expression analysis of SLC gene family in epithelial cellsof different segments of yak epididymis

WU Yi-tao， PAN Mei-lan， LUO Xiao-feng， PAN Cheng， ZHAO Wang-sheng*（School of Life Science and Engineering， Southwest University of Science and Technology， Mianyang，Sichuan 621010， China）

Abstract：【Objective】The regulation and functional differences of solute carrier（ SLC） protein in different segments of epididymis were revealed， and the expression of SLC gene family in yak epididymis was clarified to provide theoretical basis for improving the breeding performance of yaks. 【Method】A total of 54 differentially expressed genes（ DEGs） of SLC gene family were screened from the transcriptome data of epithelial cells of yak epididymis caput， corpus， and cauda epithelial cells. Key genes were screened by association network analysis， and then real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of DEGs in epithelial cells of different segments of yak epididymis.【 Result】In the comparison between caput vs corpus， 18 DEGs including SLC2A9， SLC8A1 and SLC29A1 were up-regulated， while 24 DEGs including SLC41A2， SLC40A1 and SLC26A3 were down-regulated. In the caput vs cauda， 17 DEGs including SLC16A2， SLC7A1 and SLC2A9 were up-regulated， while 15 DEGs including SLC39A4， SLC26A3 and SLC40A1 were down-regulated. For the corpus vs cauda， 6 DEGs including SLC5A3， SLC16A2 and SLC46A3 were up-regulated， while6 DEGs including SLC25A20， SLC20A2 and SLC27A1 were down-regulated. A total of 13 key genes were selected through association network analysis： SLC41A2， SLC7A8， SLC26A3， SLC39A11， SLC30A4， SLC1A1， SLC7A2， SLCO2A1， SLC6A2， SLC22A17， SLC5A5， SLC22A18 and SLC30A4. Among them，SLC26A3 gene was the key gene in both the caput vs corpus and caput vs cauda groups. SLC26A3 gene exhibited significantly higher expression in the caput compared to the corpus and cauda segments（ Plt;0.05）. The SLC gene family of yak epididymis was the most abundant in mineral absorption pathway， and SLC26A3 gene was involved in 2 signaling pathways： mineral absorption and pancreatic secretion. 【Conclusion】Thirteen regulatory genes of SLC gene family are selected from epithelial cells of different seg‐ments of yak epididymis， among which SLC26A3 gene is the common key gene of caput vs corpus and caput vs cauda groups， which influences the reproductive ability of male yaks by regulating mineral absorption.

Key words： yak； epididymis； epithelial cells； SLC gene family； differentially expressed genes（ DEGs）

Foundation items： Central Government Guiding Local Science and Technology Development Projec（t 2023ZY026）； Sichuan Science and Technology Plan Projec（t 2021YFH0101）； Graduate Excellent Course and Bilingual Course Project of Southwest University of Science and Technology（20SYKC05）

0 引言

【研究意義】牦牛是青藏高原的特有物種之一，廣泛分布于我國青藏高原地區(qū)。牦牛作為高原地區(qū)重要的牲畜品種，為西藏及其他高海拔地區(qū)的游牧民族提供了必要的資源，在高原農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中發(fā)揮著重要作用（廖陽慈等，2023）。由于高原地區(qū)環(huán)境惡劣及飼養(yǎng)管理方式落后，牦牛的生長發(fā)育和繁殖受到限制，導致牦牛的經(jīng)濟價值未能完全體現(xiàn)（Jing et al.，2022）。因此，有效提高牦牛繁育性能已成為高原畜牧養(yǎng)殖業(yè)的重點和難點?！厩叭搜芯窟M展】附睪是精子發(fā)育、修飾、成熟和儲存的重要場所（李琳等，2007；蒙利潔等，2024）。附睪附著于睪丸上，連接睪丸和輸精管，內(nèi)部分布有數(shù)條小管并布滿纖毛，精子隨著這些纖毛的擺動懸浮于管腔中，且沿著附睪頭部向尾部運動。哺乳動物的附睪組織分為3個部分：附睪頭、附睪體和附睪尾（趙旺生等，2023）。附睪頭部可分泌睪丸液，促進精子發(fā)育成熟；附睪尾能維持精子活力，使精子處于靜止狀態(tài)，在精子的儲存過程中發(fā)揮作用（Shah et al.，2018）。在附睪轉(zhuǎn)運過程中，鞭毛結(jié)構(gòu)改變、蛋白與精子相互作用、碳酸氫鹽/腺苷酸（Adenosine monophosphate，AMP）濃度變化、磷酸酶和激酶活性及精子細胞內(nèi)pH變化均是影響精子成熟和獲得活力的重要因素（Navarro et al.，2007；Dacheux and Dacheux，2014；Gervasi and Vis‐conti，2017）。溶質(zhì)載體（Solute carrier，SLC）轉(zhuǎn)運蛋白家族參與各種物質(zhì)的運輸，包括離子、氨基酸、糖、代謝物及異生物質(zhì)等（Hediger et al.，2004），其家族成員可通過調(diào)節(jié)生殖道內(nèi)腔液的pH而影響生殖過程（Lin et al.，2015）。已有研究表明，敲除小鼠的SLC4A2和SLC22A14基因，會導致其精子發(fā)生異常而不育（Medina et al.，2003；Maruyama et al.，2016）。此外，在SLC26A8基因敲除雄性小鼠模型中，精子結(jié)構(gòu)的嚴重缺陷導致其無法生育（Touré et al.，2007；Dirami et al.，2013）。SLC蛋白家族中的SLC26屬于保守膜蛋白，主要介導各種陰離子穿透上皮細胞質(zhì)膜的運輸，是構(gòu)成pH和HCO3–濃度的重要調(diào)節(jié)因子（冉麗丹等，2015）。SLC26A3基因調(diào)節(jié)雄性個體生育能力的作用更復(fù)雜。SLC26A3基因缺失與附睪的嚴重病變、細胞結(jié)構(gòu)異常及精子數(shù)量、形態(tài)和功能缺陷相關(guān)，且這些缺陷共同損害雄性個體的生育能力（El Khouri et al.，2018）?！颈狙芯壳腥朦c】SLC基因家族在附睪不同區(qū)段均有大量表達（Pholpramool et al.，2011），但有關(guān)SLC基因家族在牦牛精子發(fā)生過程中的分子作用機制至今尚未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對牦牛附睪頭、附睪體和附睪尾的上皮細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，揭示附睪不同區(qū)段SLC蛋白的調(diào)控及功能差異，明確SLC基因家族在牦牛附睪中的表達情況，為提高牦牛繁育性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

在四川省阿壩州紅原縣屠宰場選擇3頭體型和生長情況相似、身體健壯、36月齡的公牦牛，通過手術(shù)去勢采集睪丸和附睪，分離附睪并去除結(jié)締組織和脂肪組織，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗后按頭、體和尾3個部位進行分割，分別命名為附睪頭（T1、T2、T3）、附睪體（J1、J2、J3）和附睪尾（W1、W2、W3），然后轉(zhuǎn)移至含玻璃化冷凍液的凍存管中，液氮速凍保存。動物試驗由西南科技大學生物與健康倫理委員會批準，批準號L2022014。

1. 2 牦牛附睪組織總RNA提取

按照RNAsimple總RNA 提取試劑盒（DP419）說明分別提取牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾的上皮細胞總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-2000分光光度計（賽默飛世爾中國公司）分別檢測總RNA質(zhì)量及其濃度，檢測合格的總RNA置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 牦牛附睪SLC基因家族篩選

使用Oligo（dT）磁珠富集牦牛附睪頭、附睪體和附睪尾的上皮細胞mRNA，以mRNA為模板合成cDNA第一鏈，加入緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶I合成cDNA第二鏈，純化后進行末端修復(fù)加poly（A）尾并連接測序接頭，然后根據(jù)片段大小進行PCR擴增。構(gòu)建cDNA文庫后，通過實時熒光定量PCR和Qubit? 2.0熒光儀測定文庫濃度，采用Agilent 2100生物分析儀測定插入片段大小，使用Illumina Nova‐Seq 6000對cDNA文庫進行測序。根據(jù)牦牛附睪轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果（表1）篩選出附睪頭、附睪體和附睪尾中SLC基因家族的差異表達基因（Differentially expressed genes，DEGs）。

1. 4 生物信息學分析

從牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾的上皮細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出屬于SLC基因家族的DEGs，使用Python 3.12.4中的Seaborn程序?qū)Ω讲G頭vs附睪體、附睪頭vs附睪尾、附睪體vs附睪尾3組樣本間的SLC基因家族進行差異表達分析，將所有DEGs集合后采用Z-score對數(shù)據(jù)進行標準化處理及層次聚類分析。對附睪頭vs附睪體、附睪頭vs附睪尾、附睪體vs附睪尾3組樣本間的DEGs進行Spearman相關(guān)分析，然后使用R語言（3.6.3）對各DEGs的相關(guān)性進行可視化，并通過KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.genome.jp/kegg）對DEGs進行KEGG信號通路富集分析。

1. 5 實時熒光定量PCR檢測

將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為實時熒光定量PCR擴增的模板。以Premier 5.0設(shè)計擴增引物（表2），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系10.0 μL：2×SG Fast qPCR Master Mix 5.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA模板（50 ng/μL）0.5 μL，無菌去離子水補足至10.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行32個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。附睪頭、附睪體和附睪尾樣品均設(shè)3個重復(fù)，通過2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量，并以SigmaPlot v8.02中的t檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 牦牛附睪SLC基因家族差異表達分析結(jié)果

通過對牦牛附睪頭、附睪體和附睪尾的上皮細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有54個DEGs屬于SLC基因家族。以附睪頭的表達量為對照組，附睪體中的SLC2A9、SLC8A1和SLC29A1等18個DEGs呈上調(diào)表達，SLC41A2、SLC40A1和SLC26A3等24個DEGs呈下調(diào)表達（圖1-A）；附睪尾中的SLC16A2、SLC7A1和SLC2A9等17個DEGs呈上調(diào)表達，SLC39A4、SLC26A3和SLC40A1等15個DEGs呈下調(diào)表達（圖2-A）。以附睪體的表達量為對照組，附睪尾中的SLC5A3、SLC16A2和SLC46A3等6個DEGs呈上調(diào)表達，SLC25A20、SLC20A2和SLC27A1等6個DEGs呈下調(diào)表達（圖3-A）。此外，從聚類分析熱圖（圖1-B、圖2-B和圖3-B）可看出附睪頭vs附睪體、附睪頭vs附睪尾、附睪體vs附睪尾3組樣本間的DEGs重復(fù)性較好，聚類較集中。

2. 2 SLC基因家族關(guān)鍵基因的篩選與定量分析結(jié)果

對54個DEGs進行關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果如表3所示。附睪頭vs附睪體的邊數(shù)與平均聚類系數(shù)均大于其他2組樣本，說明附睪頭vs附睪體具有更復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。從附睪頭vs附睪體組［節(jié)點數(shù)（n=54）和邊數(shù)（n=1836）］中篩選出SLC41A2、SLC7A8和SLC26A3等3個關(guān)鍵基因（圖4-A）；從附睪頭vs附睪尾組［節(jié)點數(shù)（n=54）和邊數(shù)（n=1628）］中篩選出6個關(guān)鍵基因，分別是SLC39A11、SLC30A4、SLC1A1、SLC7A2、SLCO2A1和SLC26A3（圖5-A）；從附睪體vs附睪尾組［節(jié)點數(shù)（n=54）和邊數(shù)（n=850）］中篩選出5個關(guān)鍵基因，分別是SLC6A2、SLC22A17、SLC5A5、SLC22A18和SLC30A4（圖6-A）。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，附睪頭vs附睪體、附睪頭vs附睪尾2組樣本的關(guān)鍵基因均在附睪頭上皮細胞中高表達（圖4-B和圖5-B）；附睪體vs附睪尾組的關(guān)鍵基因SLC22A17和SLC30A4在附睪頭高表達，SLC6A2和SLC22A18基因在附睪尾的相對表達量顯著高于附睪頭和附睪體（Plt;0.05，下同），SLC5A5基因在附睪體的相對表達量最高（圖6-B）。此外，SLC26A3基因是附睪頭vs附睪體、附睪頭vs附睪尾2組樣本的關(guān)鍵基因，且SLC26A3基因在附睪頭的相對表達量顯著高于附睪體和附睪尾。

2. 3 牦牛附睪SLC基因家族參與的信號通路調(diào)控

對牦牛附睪SLC基因家族DEGs進行KEGG信號通路富集分析，結(jié)果（圖7）顯示，SLC基因家族在礦物質(zhì)吸收（Mineral absorption）通路上富集的數(shù)量最多。其中，SLC26A3基因參與礦物質(zhì)吸收和胰腺物分泌（Pancreatic secretion）2條信號通路。附睪頭vs附睪尾的關(guān)鍵基因中以SLC1A1基因參與的KEGG信號通路最多，包括谷氨酸能突觸（Glutamatergic synapse）、蛋白消化和吸收（Protein digestion and absorption）及突觸囊泡周期（Synaptic vesicle cycle）；而SLC7A2基因主要參與mTOR信號通路（mTORsignaling pathway）。附睪體vs附睪尾的關(guān)鍵基因SLC5A5主要參與甲狀腺激素信號通路（Thyroid hor‐mone signaling pathway）。

3 討論

附睪上皮可保護精子細胞免受免疫系統(tǒng)侵害，并介導血液循環(huán)中離子、溶質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)及水的矢量運輸，從而確保精子細胞的生存與活力。在生殖過程中，雄性和雌性的生殖道均依賴于pH穩(wěn)態(tài)，而SLC基因家族在電解質(zhì)運輸與pH穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用（Delgado-Bermúdez et al.，2022）。SLC蛋白家族調(diào)節(jié)多種物質(zhì)在細胞膜上的運輸，在細胞對營養(yǎng)物質(zhì)、藥物及其他外源物質(zhì)的吸收生理過程中扮演重要角色（Lin et al.，2015）。本研究通過分析牦牛附睪頭、附睪體和附睪尾的上皮細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，SLC基因家族在牦牛附睪頭、附睪體和附睪尾的上皮細胞中廣泛表達分布，最終篩選得到54個DEGs屬于SLC基因家族。在附睪頭vs附睪體、附睪頭vs附睪尾、附睪體vs附睪尾3組樣本間，通過關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析篩選出13個關(guān)鍵基因：SLC41A2、SLC7A8、SLC26A3、SLC39A11、SLC30A4、SLC1A1、SLC7A2、SLCO2A1、SLC6A2、SLC22A17、SLC5A5、SLC22A18和SLC30A4。其中，SLC26A3基因是附睪頭vs附睪體、附睪頭vs附睪尾2組樣本的共有關(guān)鍵基因，且SLC26A3基因在附睪頭的相對表達量顯著高于附睪體和附睪尾。

哺乳動物生殖道內(nèi)腔液pH對精子發(fā)生、獲能、受精及早期胚胎發(fā)育等均有重要影響（Bernardino et al.，2019），生殖道的酸堿平衡紊亂通常導致不育或生育能力低下（Ga??ska et al.，2022）。在附睪內(nèi)，低碳酸氫鹽濃度的建立有助于生殖腔內(nèi)酸化，是精子成熟及靜止狀態(tài)下儲存的必需條件（Chan et al.，2009；Liu et al.，2012；Breton et al.，2019）。此外，離子平衡的調(diào)節(jié)對于精子活力及其生育能力至關(guān)重要。SLC26是保守的膜蛋白，介導各種陰離子在上皮細胞質(zhì)膜上運輸，是pH和HCO-濃度的重要調(diào)3節(jié)因子（Delgado-Bermúdez et al.，2022）。Touré（2019）研究證實，大多數(shù)SLC26蛋白通過刺激Cl-通道活性，與各種上皮組織中的囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子（Cystic fibrosis transmembrane conductance regu‐lator，CFTR）相互作用。因此，本研究推測SLC26基因在牦牛附睪精子成熟過程中參與pH和HCO3-濃度的調(diào)節(jié)。SLC26A3基因在雄性生殖道和精子細胞中的功能研究已有較多報道。Chen等（2009）最先發(fā)現(xiàn)SLC26A3基因在精子頭部的頂體前部區(qū)域表達，且精子頭部中的CFTR與SLC26A3基因共同參與精子獲能；Chávez等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，SLC26A3基因存在于小鼠精子中段，與CFTR的位置相同，表明CFTR與SLC26A3相互作用對小鼠精子獲能十分重要；El Khouri等（2018）通過分析SLC26A3基因敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)，SLC26A3基因缺失小鼠表現(xiàn)出嚴重的附睪尾損傷和細胞結(jié)構(gòu)異常，嚴重影響附睪精子的儲存。此外，Breton等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，SLC26A3基因缺失小鼠附睪頭中的V型三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，V-ATP）含量增加，反映了管腔液中HCO3-和pH失調(diào)的補償機制。綜上所述，SLC26A3基因影響附睪環(huán)境的pH和離子含量，在雄性生育能力方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究中，SLC26A3基因在牦牛附睪頭上皮細胞中顯著高表達，可能是通過調(diào)控附睪腔環(huán)境及精子的成熟而影響牦牛的生殖能力。

牦牛附睪SLC基因家族在礦物質(zhì)吸收通路上富集的數(shù)量最多，且關(guān)鍵基因SLC26A3參與該通路的調(diào)控。精液的質(zhì)量及生育能力受礦物質(zhì)補充的高度影響（Rahman et al.，2014）。飼喂微量礦物質(zhì)對畜禽精子的產(chǎn)生和生育能力有顯著影響，而達到最佳的生殖功能（Narasimhaiah et al.，2018）。礦物質(zhì)補充有助于保持精子膜的完整性，以及增強精子細胞的抗氧化性能（Kendall et al.，2000）。精子需要有鋅離子才能將頭部附著于雌性生殖道中，并從前列腺釋放出抗菌化合物（Saaranen et al.，1987）。精子膜中的高脂質(zhì)含量導致精子細胞極易發(fā)生氧化損傷和脂質(zhì)過氧化（Khan et al.，2012），鑒于礦物質(zhì)的抗氧化特性，補充礦物質(zhì)能有效清除過量的超氧自由基，進而阻止精子細胞發(fā)生氧化損傷。睪丸生長和精子發(fā)生對鋅的需求量大于身體生長，說明鋅在雄性個體的發(fā)育及成熟過程中發(fā)揮重要作用，尤其對睪丸上皮細胞的完整性至關(guān)重要（Narasimhaiah et al.，2018）。由此推測，SLC26A3基因通過調(diào)控礦物質(zhì)吸收而影響雄性的生殖能力。

4 結(jié)論

從牦牛附睪不同區(qū)段上皮細胞中篩選得到13個SLC基因家族調(diào)控基因，其中SLC26A3基因是附睪頭vs附睪體、附睪頭vs附睪尾2組樣本的共有關(guān)鍵基因，通過調(diào)控礦物質(zhì)吸收而影響雄性牦牛的生殖能力。

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（責任編輯 蘭宗寶）