李曉迎 方玉蓮 寧靜 徐勇勝

據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)2022年統(tǒng)計(jì)[1],估算2021年全球新發(fā)結(jié)核病患者1060萬例,其中兒童患者約120萬例,占11%,其中兒童結(jié)核病死亡患者約20萬例,占14%。按照2018—2022年聯(lián)合國高級別會議(UNHLM)里程碑目標(biāo),截止到2021年底,只有54%(190萬例)兒童結(jié)核病患者得到了妥善的治療(目標(biāo)350萬例)。Dodd 等[2]和Jenkins等[3]估算全球每年新發(fā)兒童耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)患者約2.5萬～3.5萬例,此外,超過50%的兒童結(jié)核病患者未被確診或報(bào)告?？梢?早期明確診斷、及時(shí)治療對改善患兒預(yù)后尤為重要。

有研究顯示,涂片鏡檢結(jié)核分枝桿菌(MTB)的陽性率不足15%[4],而MTB培養(yǎng)及菌種鑒定作為診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn),其陽性率僅為30%～40%[5],結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)聯(lián)合γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)作為臨床診斷肺結(jié)核的參考標(biāo)準(zhǔn)之一,其不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和活動性結(jié)核病。而利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)(Xpert)作為近年新興起的結(jié)核病診斷檢測方法,其對成人肺結(jié)核的診斷價(jià)值已得到大量研究證實(shí)[6],WHO也推薦其用于兒童結(jié)核病的診斷,但鑒于兒童痰液及胃液標(biāo)本留取困難,尋找新的無創(chuàng)性操作獲取標(biāo)本并準(zhǔn)確診斷兒童結(jié)核病已成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)。筆者就Xpert方法檢測MTB用于診斷兒童肺結(jié)核、肺外結(jié)核及糞便標(biāo)本處理方法及臨床應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述,為糞便Xpert檢測在兒童結(jié)核病診斷中的應(yīng)用提供參考。

一、糞便Xpert應(yīng)用優(yōu)勢

由于兒童結(jié)核病診斷過程中痰液或胃液抽吸物樣本獲得較困難,目前其在兒童結(jié)核病診斷中的敏感度較低[7],其次,兒童體液量較少,胸腔積液、腦脊液、肺泡灌洗液、胃液等樣本量采集量不足;且兒童配合度低,采集標(biāo)本質(zhì)量差[8],這就使得兒童結(jié)核病的診斷更加困難。

Cordova等[9]指出,含MTB的痰可被吞咽,特別是在睡眠期間,抗酸桿菌也已被證明可在消化過程中存活,并可在糞便中檢測到,因此,糞便Xpert檢測用于診斷肺結(jié)核是可行的,而Liu等[10]研究成果中指出Xpert檢測糞便標(biāo)本在兒童和青少年結(jié)核病的治療管理中有重要的診斷價(jià)值。同時(shí)針對Xpert檢測敏感度低的特點(diǎn),隨著新一代測序技術(shù)GeneXpert MTB/RIF Ultra(簡稱“Xpert Ultra”)出現(xiàn),補(bǔ)充了Xpert檢測敏感度低的問題[11],Xpert Ultra較Xpert增加了IS1081和IS6110區(qū)域探針,提高了MTB的檢出率。

二、糞便Xpert檢測樣本處理方法

不同的糞便樣本處理方法可能會影響結(jié)果的敏感度及特異度,從而影響最終的診斷結(jié)果,因此,標(biāo)本的處理方法至關(guān)重要,目前國際及國內(nèi)尚無統(tǒng)一的糞便處理方法,已知用于Xpert檢測的糞便處理方法如下:

1.離心法:其主要是應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)對樣本進(jìn)行處理, Chipinduro等[12]采用0.15 g大便方法,將收集好的糞便于2～8 ℃中運(yùn)輸,在-80 ℃ 中冷凍儲存(儲存后在6個(gè)月內(nèi)對標(biāo)本進(jìn)行處理),收集合適量的糞便后,將糞便解凍后取0.15 g 置于2.4 ml PBS中混勻,室溫靜置20 min,取上清1 ml,3500 r/min離心15 min,棄掉上清,在1 ml PBS中重新懸浮,然后用樣品試劑2∶1稀釋,加入Xpert試劑盒中進(jìn)行化驗(yàn)。需注意離心法中糞便處理方法及在PBS混勻后的靜置時(shí)間略有不同[13-15];此外,離心法需要較高級別的生物安全措施[16]。

2.緩沖液制備法:屬于非離心法,需格外配置緩沖液。AL緩沖液(Qiagen, Valencia, CA)+10%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+2 ml Xpert樣品試劑 (SR)+3 mm玻璃微珠。與大便混勻后,室溫下孵育30 min,將獲得樣品通過玻璃棉注射器過濾器放入單獨(dú)容器中,再將2 ml濾液放入Xpert試劑盒中[17-18]。

3.TS法(two-step processing method):簡稱兩步法,是一種接近痰液處理流程的方法,取1 g糞便樣本,用木質(zhì)涂布棒將其添加到10 ml PBS(pH值為7.4)溶液中,劇烈振蕩混勻,沉淀10 min后,取2 ml 上清液與2～4 ml Xpert樣品試劑混勻,孵化15 min后,取2 ml混合物進(jìn)行測試[19]。

4.優(yōu)化蔗糖浮選法(optimized sucrose flotation,OSF):該方法為主要檢測糞便中寄生蟲蟲卵的方法,現(xiàn)已用于糞便Xpert檢測,在糞便樣本中加入56%蔗糖溶液,通過密度梯度從糞便顆粒中分離分枝桿菌[20],具體步驟為:(1)在10 ml 56%蔗糖溶液中加入0.5 g糞便;(2)渦流搖動;(3)漏斗紗布濾過;(4)100×g離心1 min;(5)取上清0.5 ml與1.8 ml Xpert樣品試劑混合并渦流搖動。該方法需離心,且至少需要生物安全2級。隨后 Lounnas等[21]開發(fā)一種新的操作方法,在上述傳統(tǒng)方法中進(jìn)行了改進(jìn),稱OSF法,其開發(fā)并發(fā)現(xiàn)了蔗糖處理方法的最佳組合方法,即應(yīng)用0.5 g標(biāo)本量,用沉降法代替上述離心,采用玻璃棉過濾,沉淀30 min,稀釋比例為1∶3.6。

5.簡單一步法(SOS法):此方法是基于重力沉降,其原理類似于痰液Xpert處理方法[22]。取0.8～1.0 g糞便,直接加入至8 ml檢測試劑中,混合液進(jìn)行搖晃靜置,將靜置后的上層“無碎屑”的上清液轉(zhuǎn)移到Xpert試管中進(jìn)行檢測。SOS檢測其對標(biāo)本處理方法上較其用于痰液處理時(shí)有所改進(jìn),主要體現(xiàn)在以下幾點(diǎn):(1)加入玻璃珠以改善樣品的均勻化,增加MTB的釋放量;(2)用PBS稀釋類似“TS”方法;(3)按照Banada方法進(jìn)行過濾。該方法被Jasumback等[23]定義為最適合在低資源配置中實(shí)施的方法。

三、糞便Xpert檢測肺結(jié)核的敏感度和特異度

既往研究發(fā)現(xiàn),不同的研究機(jī)構(gòu)及研究樣本敏感度及特異度有一定差異,總體來說,Xpert檢測MTB的敏感度為25%～85%,特異度為91.7%～100%[24-28]。而Xpert Ultra檢測的敏感度為45.5%～60.3%,特異度為88.1%～100%。

糞便Xpert較適用于呼吸系統(tǒng)標(biāo)本收集相對較為困難的兒童,國外學(xué)者Kokuto等[29]發(fā)現(xiàn)在成人痰涂片陽性的肺結(jié)核患者中,糞便Xpert檢測肺結(jié)核的敏感度為100%,痰涂片弱陽性的患者,糞便Xpert檢測的敏感度為81%,痰涂片陰性患者中敏感度為50%,非肺結(jié)核組糞便Xpert檢測均陰性,特異度為100%。此外,Walters等[18]收集了280例疑似肺結(jié)核的兒童患者進(jìn)行糞便檢測,并與單一呼吸道標(biāo)本進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)其檢測的敏感度及特異度分別達(dá)到了44.4%和99%以上,糞便Xpert檢測的特異度較高,但其敏感度略低于呼吸道標(biāo)本。

另外,Hasan等[30]比較與兒童糞便Xpert與培養(yǎng)(胃液/痰液)方法診斷兒童肺結(jié)核的一致性,發(fā)現(xiàn)糞便Xpert檢測的敏感度為88.9%(95%CI: 50.7%～99.4%),特異度為95%(95%CI: 81.8%～99.1%),且發(fā)現(xiàn)胃液標(biāo)本與糞便檢測結(jié)果基本一致。Banada等[17]及Walters等[ 15]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)糞便Xpert直接與單一胃液或痰液檢出率進(jìn)行比較時(shí),糞便并沒有表現(xiàn)出劣勢。 我國Liu等[10]使用Xpert Ultra方法對126例兒童結(jié)核病患者的糞便、呼吸道標(biāo)本進(jìn)行檢測并與痰培養(yǎng)、痰涂片等進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)痰Xpert Ultra檢測的敏感度及特異度最高,而糞便與痰Xpert Ultra一致率為84.1%,敏感度為45.5% (95%CI: 35.0%～56.0%),特異度為94.7%(95%CI: 82.0%～99.0%),與MTB培養(yǎng)的敏感度[45.5% (95%CI: 35.0%～56.0%)]相似,但高于痰抗酸染色涂片法[27.3%(95%CI: 18.0%～38.0%)]。

Sun 等[31]對141例兒童活動性肺結(jié)核及34例兒童非結(jié)核性呼吸系統(tǒng)疾病患者分別采用Xpert和Xpert Ultra方法對糞便樣本進(jìn)行檢測,同時(shí)采用Xpert Ultra方法檢測同一患兒胃液,并與胃液培養(yǎng)及涂片進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)糞便Xpert Ultra檢測的敏感度為60.3% (95%CI: 51.7%～68.3%),特異度為97.1% (95%CI: 82.9%～99.8%);糞便Xpert檢測的敏感度為32.6%(95%CI:25.1%～41.1%),特異度為100.0% (95%CI:87.4%～100.0%),Xpert Ultra較Xpert有更高的敏感度,但特異度略低于Xpert,并指出糞便Xpert Ultra可替代胃液Xpert Ultra用于兒童肺結(jié)核診斷,且糞便與胃液Xpert Ultra陽性均可作為肺結(jié)核的細(xì)菌學(xué)診斷依據(jù)。

2022年世界衛(wèi)生組織《兒童結(jié)核病診療指南》[32]指出,在兒童和青少年結(jié)核病的管理中明確指出,在具有典型的肺結(jié)核癥狀的兒童中,啟用Xpert Ultra對痰液、鼻咽分泌物、胃液和糞便等樣本作為結(jié)核病的初始診斷及利福平耐藥的檢測工具,而不是痰涂片/培養(yǎng)和表型藥物敏感性試驗(yàn)。

四、糞便Xpert檢測腸結(jié)核的敏感度和特異度

兒童腸結(jié)核患者癥狀不明顯,體征非特異性,臨床體征與許多其他疾病相似,如克羅恩病等,因此腸結(jié)核的診斷較為困難。

腸道糞便Xpert檢測是基于腸結(jié)核的干酪肉芽腫性病變可在糞便中脫落分枝桿菌這一假設(shè)進(jìn)行的。關(guān)于Xpert用于腸結(jié)核診斷方面的研究中, Bellam等[33]應(yīng)用腸鏡取成人腸黏膜組織進(jìn)行Xpert檢測,發(fā)現(xiàn)其檢測的敏感度、特異度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值及準(zhǔn)確率分別為32% (95%CI: 15.0%～53.5%)、 100% (95%CI: 78.2%～100%)、 46.88% (95%CI: 40.3%～53.6%)、 100%和57.50% (95%CI: 0.9%～72.9%),但以上均為有創(chuàng)性檢查,在兒童中適用性較差。

熊瑜等[34]選取我國3家較大型的醫(yī)院收集254例疑似腸結(jié)核患者進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn),糞便Xpert檢測的敏感度和特異度分別為60.4%和100%;糞便抗酸桿菌涂片的敏感度和特異度分別為13.2%和98.3%;糞便BACTEC MGIT 960 培養(yǎng)的敏感度和特異度分別為43.2%和100.0%。糞便Xpert檢測的敏感度明顯高于抗酸桿菌涂片及BACTEC MGIT 960 培養(yǎng)。

糞便Xpert用于腸結(jié)核診斷尤其用于腸結(jié)核診斷研究數(shù)據(jù)較少,其在兒童中的應(yīng)用有待進(jìn)一步大樣本數(shù)據(jù)研究。

五、總結(jié)與展望

糞便Xpert檢測因其檢測時(shí)間短及有較高的診斷準(zhǔn)確性,為診斷兒童肺結(jié)核提供了一種新的方法,對于控制結(jié)核病的傳播有較為深遠(yuǎn)的影響,且糞便標(biāo)本獲得比較方便,在很大程度上避免了支氣管鏡等操作獲取標(biāo)本。但目前糞便Xpert檢測在方法學(xué)上無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),還需大樣本研究確定統(tǒng)一的參考標(biāo)準(zhǔn),為臨床的實(shí)際應(yīng)用提供更好的價(jià)值。另外,糞便Xpert 陽性也不能作為診斷金標(biāo)準(zhǔn),無論是肺結(jié)核或者腸結(jié)核均不能以Xpert陽性作為診斷金標(biāo)準(zhǔn),此外,糞便Xpert的診斷效能受到感染部位、標(biāo)本類型、標(biāo)本質(zhì)量和合并其他病原感染等因素的影響,需要完善標(biāo)本采集體系,建立規(guī)范的標(biāo)本采集和檢測流程,尤其對于不同年齡階段兒童的適用性及使用價(jià)值。因此,糞便Xpert在兒童結(jié)核病診斷中的應(yīng)用需進(jìn)一步改良和優(yōu)化,以便更廣泛地應(yīng)用于臨床及不同年齡肺結(jié)核的診斷和治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)李曉迎:文章撰寫及文章修改;方玉蓮:文獻(xiàn)檢索;寧靜:對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱;徐勇勝:對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、支持性貢獻(xiàn)