楊焜 程意 郭雪君

慢性阻塞性肺疾病(簡(jiǎn)稱慢阻肺)是一種常見(jiàn)的氣道慢性炎癥性疾病。截至到2019年,全球30～79歲人口慢阻肺的患病率為10.3%,患病人數(shù)約3.919億人,大多數(shù)為低、中收入國(guó)家人群[[]]。吸煙是慢阻肺最重要的病因之一。煙草燃燒釋放的煙霧(cigarette smoke,CS)中已經(jīng)鑒定出4 000至 7 000 種氧化劑(reactive oxygen species,ROS)成分,包括酚類、半醌類、一氧化氮、二氧化氮、過(guò)氧亞硝酸鹽等。每一口CS中約含1 015個(gè)自由基[2,3],引起全身氧化應(yīng)激,尤其是進(jìn)行直接接觸的肺。

慢阻肺患者體內(nèi)的ROS不僅源于直接吸入的CS,也由后續(xù)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生。吸煙者肺部及全身的吞噬細(xì)胞均高于非吸煙者,且生成ROS的速度更快[3]。CS還誘導(dǎo)大量髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的生成。MPO已被證實(shí)與慢阻肺患者呼吸功能障礙程度相關(guān)[4]。

線粒體是參與能量代謝及維持穩(wěn)態(tài)的重要結(jié)構(gòu),參與ROS生成與調(diào)節(jié)。線粒體DNA (mitochondrial Deoxyribonucleic Acid,mtDNA) 對(duì)氧化損傷易感[5]。ROS積累會(huì)影響線粒體形態(tài)與功能。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)不僅保留了多向分化潛力,還參與組織修復(fù)與免疫調(diào)節(jié)。研究證實(shí)其對(duì)氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。其中線粒體轉(zhuǎn)移是重要的機(jī)制之一[6,7]。MSCs可以通過(guò)多種方式將線粒體轉(zhuǎn)移至損傷細(xì)胞,從而改善細(xì)胞能量代謝,減少凋亡。其中隧道納米管(tunneling nanotubes,TNT)介導(dǎo)的線粒體轉(zhuǎn)移是目前研究的熱點(diǎn)之一[6,8]。

TNT是由細(xì)胞膜延伸出的突起結(jié)構(gòu)[9]。直徑約50納米至200納米,長(zhǎng)度數(shù)微米,外觀很少表現(xiàn)出分支,通常懸浮于培養(yǎng)基中,與基質(zhì)無(wú)接觸[10-15]。TNT是瞬態(tài)結(jié)構(gòu),壽命約幾分鐘到幾個(gè)小時(shí)不等[11,14]。允許細(xì)胞間小分子、囊泡、線粒體甚至致病微生物交換[11]。不同種類細(xì)胞TNT結(jié)構(gòu)、組成、功能、性質(zhì)和形成機(jī)制具有差異[11]。F-肌動(dòng)蛋白是TNT的主要組分,通常根據(jù)TNT中是否含微管將其分為兩種類型[11-15]。 研究證實(shí), MSCs通過(guò)TNT介導(dǎo)與CS損傷后細(xì)胞間的線粒體轉(zhuǎn)移[7,16],因此在慢阻肺中具有潛在治療作用。

一、氧化應(yīng)激引起線粒體功能障礙

氧化應(yīng)激參與慢阻肺的發(fā)生與發(fā)展,是CS引發(fā)慢阻肺的啟動(dòng)環(huán)節(jié)[2,3,17]。 ROS的積累可以引發(fā)肺泡上皮受損以及細(xì)胞外基質(zhì)重塑,使得肺表面活性物質(zhì)與抗蛋白酶活性減低,促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放與呼吸道粘液大量分泌。

ROS可以引起線粒體形態(tài)改變與損傷。氣道疾病患者的氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)線粒體表現(xiàn)出明顯的形態(tài)學(xué)缺陷,線粒體分裂與融合失衡[5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CS影響了線粒體分裂融合過(guò)程的相關(guān)基因,如磷酸酶和張力蛋白同源物誘導(dǎo)激酶1、 E3泛素蛋白連接酶、Ras同系物家族成員T1和動(dòng)力蛋白相關(guān)蛋白1[18,19]。慢阻肺患者和CS誘導(dǎo)肺氣腫小鼠血清中mtDNA水平升高。香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract,CSE)刺激后的細(xì)胞培養(yǎng)液中也發(fā)現(xiàn)mtDNA的釋放,提示線粒體損傷。同時(shí),DNA損傷相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)增加,包括DNA酶Ⅲ、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-腺苷合成酶、NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3、促炎細(xì)胞因子及衰老相關(guān)標(biāo)志物p16和p21[20]。

二、TNT介導(dǎo)MSCs與細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移

細(xì)胞間TNT的形成及其介導(dǎo)的線粒體轉(zhuǎn)移在大量體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)。在對(duì)細(xì)胞、MSCs線粒體及TNT主要組分(F-肌動(dòng)蛋白)進(jìn)行染色后,通過(guò)熒光顯微鏡觀察到了線粒體經(jīng)TNT由MSCs轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞[6]。利用激光掃描共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn),TNT在MSCs與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中共培養(yǎng)4小時(shí)內(nèi)形成,并且檢測(cè)到了線粒體通過(guò)TNT的轉(zhuǎn)移[21]。

TNT可以在MSCs與多種細(xì)胞間形成[7,13,14,22-26]。 包括支氣管上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等,參與機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育與免疫調(diào)節(jié)。TNT還調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老。共培養(yǎng)第5代(P5)與第11代(P11)MSCs后發(fā)現(xiàn),相比于單獨(dú)培養(yǎng)P11 MSCs,共培養(yǎng)體系中細(xì)胞存活率更高,上清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子,白介素-6分泌升高。此外,P5MSCs明顯減少了P11MSCs衰老標(biāo)志物p16的表達(dá),而這種作用在使用TNT抑制劑后明顯減弱。證明此過(guò)程主要通過(guò)TNT介導(dǎo)[27]。

三、TNT的形成與調(diào)節(jié)機(jī)制

TNT受到多種外界因素的影響。在缺氧缺血、藥物、CSE等刺激下,TNT的形成率明顯增高[7,16,28-30]。 說(shuō)明細(xì)胞傾向于通過(guò)TNT構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)以提高應(yīng)激下存活率。

TNT的形成與調(diào)節(jié)機(jī)制目前仍處于研究中。Guy等[31]提出線粒體Rho GTP酶1(mitochondrial Rho-GTPase 1,Miro1)參與調(diào)節(jié)線粒體運(yùn)動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)線粒體轉(zhuǎn)移效率與Miro1有關(guān)。人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的MSCs (Mesenchymal Stem Cells Derived from Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC-MSCs)較骨髓MSCs高表達(dá)Miro1,其線粒體轉(zhuǎn)移效率更高。此外,腫瘤壞死因子α促進(jìn)iPSC-MSC 形成TNT。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)人腫瘤壞死因子α/核因子-κB/人腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白2信號(hào)通路調(diào)節(jié)此過(guò)程[32]。使用膜聯(lián)蛋白V屏蔽損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)后,MSCs與內(nèi)皮細(xì)胞間的TNT形成明顯減少。說(shuō)明PS結(jié)構(gòu)域引導(dǎo)TNT的形成[21]。 p53參與星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間TNT的形成。siRNA沉默p53后TNT形成抑制[33]。 線粒體轉(zhuǎn)錄因子A被證實(shí)參與MSCs與肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞間TNT的形成[34]。 研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)MICAL2PV(神經(jīng)元引導(dǎo)基因MICAL2的剪接異構(gòu)體)可以促進(jìn)TNT生成。此外,MICAL2PV與線粒體Rho GTP酶2(Miro2)相互作用可以調(diào)節(jié)亞細(xì)胞線粒體運(yùn)輸。單加氧酶結(jié)構(gòu)域參與介導(dǎo)此過(guò)程[15]。

四、TNT介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)具有方向性

有研究認(rèn)為MSCs可以通過(guò)TNT將胞質(zhì)內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到支氣管上皮細(xì)胞中。但這種轉(zhuǎn)移是單向的[35]。Wang等[9]提出了不同的見(jiàn)解,他們發(fā)現(xiàn)jurkat細(xì)胞(人T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系)借助TNT將線粒體轉(zhuǎn)移到MSCs,但很少?gòu)腗SCs接受線粒體。而MSCs與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞間建立的TNT存在雙向線粒體轉(zhuǎn)移[13]。血管平滑肌細(xì)胞與MSCs共培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)TNT介導(dǎo)線粒體的雙向轉(zhuǎn)移,但僅MSCs出現(xiàn)促增殖效應(yīng),血管平滑肌細(xì)胞的增殖速率并未改變。因此,這種交換對(duì)不同細(xì)胞的影響相異[36]。Lou等[37]發(fā)現(xiàn)TNT可以在惡性細(xì)胞間或間皮細(xì)胞間形成。但并未在惡性細(xì)胞和間皮細(xì)胞間發(fā)現(xiàn)TNT。Matula等[38]也觀察到相同的現(xiàn)象。脂肪來(lái)源的MSCs與jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)后,僅發(fā)現(xiàn)jurkat細(xì)胞間形成TNT結(jié)構(gòu)。

關(guān)于TNT介導(dǎo)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的方向性目前仍有爭(zhēng)議,需要進(jìn)一步深入研究。

五、TNT介導(dǎo)的治療作用

大量動(dòng)物和臨床研究證實(shí)了MSCs在慢阻肺中的治療作用,線粒體轉(zhuǎn)移是潛在機(jī)制之一[18,39]。使用iPSC-MSCs 與骨髓MSCs治療CS暴露大鼠,可以改善肺結(jié)構(gòu),緩解CS暴露引發(fā)的氣道纖維化。體外研究證實(shí)了MSCs與支氣管上皮細(xì)胞間TNT樣結(jié)構(gòu)的形成,通過(guò)流式細(xì)胞熒光分選證實(shí)了細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移。而這種轉(zhuǎn)移在應(yīng)用TNT抑制劑后受到阻斷。此外,研究證實(shí)TNT介導(dǎo)的線粒體轉(zhuǎn)移效率具有細(xì)胞特異性,iPSC-MSCs轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)[16]。直接共培養(yǎng)iPSC-MSCs與ASMCs,先觀察到了iPSC-MSCs線粒體轉(zhuǎn)移,后觀察到了ASMCS線粒體轉(zhuǎn)移。這種轉(zhuǎn)移在煙草刺激存在下增強(qiáng)。直接共培養(yǎng)緩解了煙草刺激后ASMCs線粒體ROS生成、細(xì)胞凋亡及Ψm損失。而使用MSCs條件培養(yǎng)基或Transwell共培養(yǎng)ASMC等非直接共培養(yǎng)僅見(jiàn)線粒體ROS生成減少。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)iPSC-MSCs可以減少ROS生成及Ψm損失從而緩解線粒體功能障礙,減低氣道高反應(yīng)性,肺泡灌洗液中的炎細(xì)胞數(shù)量明顯減少,并且證實(shí)了iPSC-MSCs對(duì)肺部炎癥的緩解[7]。

TNT不僅介導(dǎo)線粒體轉(zhuǎn)移,還可以影響細(xì)胞旁分泌。小鼠心肌細(xì)胞(cardiomyocytes,CM)和人多能脂肪衍生干細(xì)胞(human multipotent adipose derived stem cells,hMADS)共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn):CM對(duì)hMADS的旁分泌有影響作用。使用痛苦狀態(tài)小鼠的CM模擬心肌梗死,與hMADS共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中多種細(xì)胞因子含量變化。其中人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、單核細(xì)胞趨化蛋白3和人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α等心臟保護(hù)因子在應(yīng)用TNT阻斷劑后減少。從而支持TNT對(duì)這些細(xì)胞因子的刺激作用[40]。

六、結(jié)語(yǔ)

線粒體轉(zhuǎn)移參與多種生理、病理活動(dòng),是生物界普遍存在的現(xiàn)象。由于氧化與抗氧化失衡,慢阻肺患者體內(nèi)ROS堆積,引發(fā)線粒體損傷,導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙及穩(wěn)態(tài)失衡。TNT介導(dǎo)MSCs與細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移,可以恢復(fù)細(xì)胞正常生理功能,從而緩解疾病進(jìn)展。在治療慢阻肺中具有潛在應(yīng)用前景。