毛迎雪，劉蒙達，張皓博，曲 瑤，南文龍，蘇華彬，3，劉建柱，孫淑芳，胡莉萍，樊曉旭

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安 271000；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109；4.山東省動物疫病預(yù)防控制中心，山東濟南 250100）

長期以來，病毒、細菌、寄生蟲等病原微生物引發(fā)的各種動物疫病嚴重影響畜牧業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，同時布魯氏菌病、結(jié)核病等人獸共患病還嚴重影響公共衛(wèi)生安全[1]。因此，如何快速準確診斷動物疫病，成為當前畜牧業(yè)十分重要而突出的問題。

動物疫病診斷方法包括流行病學(xué)診斷、病理診斷、病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷、臨床診斷等。其中，病原學(xué)診斷包括血清學(xué)檢測、分子生物學(xué)檢測等方法。血清學(xué)檢測技術(shù)主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），其優(yōu)點在于檢測靈敏度高，缺點是血清抗體制備時間較長且易出現(xiàn)假陽性，對檢測人員技術(shù)要求較高[2]；分子生物學(xué)檢測技術(shù)主要是聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR），其檢測靈敏度高，操作簡便快速，但對檢測儀器要求較高，不適用于偏遠地區(qū)或?qū)嶒灄l件有限的實驗室。

等溫擴增核酸技術(shù)是一種新型分子生物學(xué)檢測技術(shù)[3]，其中環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）、重組酶聚合酶擴增技術(shù)（RPA）和重組酶介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（RAA）是目前發(fā)展比較成熟的幾種等溫核酸檢測技術(shù)[4]，都具備恒溫、特異、高效等優(yōu)點。RPA 與RAA 技術(shù)的反應(yīng)原理、反應(yīng)條件、反應(yīng)體系類似，但相關(guān)重組酶來源不同，其中RPA 的重組酶來源于T4 噬菌體[5]，而RAA 的重組酶來源于細菌和真菌[6]。公開資料[7-8]顯示，RAA 采用的重組酶和DNA 聚合酶相較于RPA 活力更高。本文對RAA 技術(shù)原理、引物設(shè)計及其在動物疫病檢測應(yīng)用等方面進行綜述，以期為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。

1 RAA 技術(shù)簡介

1.1 原理

RAA 技術(shù)的三大核心酶包括重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA 聚合酶。與傳統(tǒng)PCR 熱循環(huán)不同，RAA 技術(shù)利用上述3 種酶實現(xiàn)恒溫核酸擴增過程[6]。具體原理（圖1）：重組酶、單鏈結(jié)合蛋白在腺苷三磷酸酶（ATP）輔助下與引物結(jié)合，形成重組酶-單鏈結(jié)合蛋白-引物復(fù)合體，接著復(fù)合體掃描模板DNA 鏈，當識別到互補序列時，在復(fù)合體作用下，形成穩(wěn)定的D 環(huán)（D-loop），然后在脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和ATP 充足條件下，DNA 在恒溫下完成DNA 鏈的延伸，形成新的DNA 鏈。整個反應(yīng)過程需5～15 min，可快速有效擴增目的片段，達到儀器能檢測出的水平。

圖1 重組酶介導(dǎo)等溫擴增法原理

1.2 引物設(shè)計

核酸擴增的關(guān)鍵在于引物和探針設(shè)計，由于RAA 擴增溫度為37～42℃，相比PCR 反應(yīng)溫度較低，因此對引物設(shè)計有著較高要求。從引物長度來看，RAA 所用引物長度一般為25～35 bp，長于PCR 引物，因此常規(guī)PCR 引物不一定適用于RAA。若RAA 引物太短則會影響引物與重組酶的結(jié)合效率，不能快速擴增目的片段；若引物太長，則會在擴增過程中容易形成引物二聚體或二級結(jié)構(gòu)。另外，引物序列中，5' 端應(yīng)避免出現(xiàn)重復(fù)G和C，3'端最好要有G 或C，同時G 和C 堿基含量最好為30%～50%。因設(shè)計的不同引物的擴增效率不同，所以一般只針對1 個基因，在同時設(shè)計多組引物序列時，通過試驗條件優(yōu)化篩選出最佳引物對。

1.3 優(yōu)缺點

相較于傳統(tǒng)分子檢測技術(shù)，RAA 具有高特異性和敏感性，能夠準確檢測并擴增低豐度靶基因；反應(yīng)時間短，操作簡便，反應(yīng)在恒溫下進行，不需要復(fù)雜的溫度變化，只需30 min 左右即可得到檢測結(jié)果，方便了RAA 技術(shù)在實驗室和現(xiàn)場的應(yīng)用。當然，RAA 技術(shù)也存在一些缺點：引物設(shè)計難度較高，目前沒有專門用于設(shè)計RAA 引物及探針的軟件，這限制了RAA 技術(shù)的廣泛應(yīng)用；因樣品的前期處理不當，試驗結(jié)果易出現(xiàn)假陽性。具體對比結(jié)果見表1。

表1 RAA 與其他分子檢測技術(shù)對比結(jié)果

2 RAA 衍生技術(shù)

傳統(tǒng)RAA 檢測方法的目的基因擴增通過水浴鍋或恒溫箱進行，目的基因判讀則通過凝膠電泳實現(xiàn)，操作步驟較為繁瑣，耗時較長。而隨著RAA技術(shù)的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)檢測方法可以與其他新型技術(shù)結(jié)合，如實時熒光RAA（fRAA）、逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸擴增法（RT-RAA）、CRISPR-Cas13a/Cas12a 輔助RAA 法以及多重檢測等，使得RAA技術(shù)對檢測結(jié)果的判讀更加方便直觀，同時拓展了該技術(shù)在疫病檢測方面的應(yīng)用。

2.1 fRAA

fRAA 法是在RAA 基礎(chǔ)反應(yīng)體系中添加熒光染料或熒光探針，可以實時監(jiān)測目的基因擴增進程的技術(shù)。2020年，趙凱穎等[9]建立了非洲豬瘟病毒（ASFV）fRAA 檢測法。該方法的靈敏度與qPCR 方法相當，且與其他豬源病原無交叉反應(yīng)，相較于qPCR 檢測需要2 h，RAA 法只需10 min，因而大大縮短了檢測時間，為ASFV 早期診斷提供了技術(shù)支持。

2.2 RT-RAA

RT-RAA 是基于RAA 法建立的核酸檢測方法，其原理是先將病原體的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA 聚合酶等完成對目標基因的擴增，從而達到檢測目的。呂蕎等[10]利用RT-RAA 法建立了豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）檢測方法，其臨床樣本檢測結(jié)果與RTPCR 方法一致，且與其他豬源病毒無交叉感染。相較于RT-PCR 方法，RT-RAA 法更簡便、高效，總反應(yīng)時間縮短至20 min，為臨床樣本篩查提供了可行的技術(shù)支持。

2.3 CRISPR-Cas13a/Cas12a 輔助RAA 法

CRISPR-Cas 系統(tǒng)是一種基因編輯工具，其核酸酶主要包括兩類：一類是RNA 引導(dǎo)下可以切割RNA 鏈的Cas13a 和Cas13b；另一類是RNA 引導(dǎo)下可以切割DNA 鏈的Cas12a 和Cas14。具體原理：以Cas12a 為例，CRISPR/Cas12a 對非特異性單鏈DNA（ssDNA）表現(xiàn)出反式切割活性。Cas12a 與crRNA 結(jié)合形成Cas12a-crRNA 復(fù)合物，然后特異性識別DNA 靶標形成三元復(fù)合物（Cas12a/crRNA/DNA 靶標）。Cas12a 蛋白對ssDNA 的反式切割活性由靶DNA 特異性識別觸發(fā)，通過ssDNA 熒光團和淬滅劑標記，靶基因內(nèi)容物可以轉(zhuǎn)化為熒光信號，從而被檢測到。Lv 等[11]針對海產(chǎn)品中副溶血弧菌建立CE-RAA-CRISPR 檢測方法，其在RAA 反應(yīng)體系基礎(chǔ)上添加LbaCas12a 復(fù)合物進行反應(yīng)，相較于普通RAA 法，該方法對純細菌培養(yǎng)物的檢出限為6.1×101CFU/mL，對蝦的檢出限為7.3×101CFU/g，檢測靈敏度更高，且臨床樣本檢測結(jié)果與qPCR 相同，為副溶血弧菌的臨床檢測提供了新的技術(shù)方法。

3 RAA 技術(shù)應(yīng)用研究

RAA 技術(shù)自問世以來，已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)檢測，如病毒、細菌、寄生蟲等的病原微生物檢測，除此之外，該項技術(shù)也被應(yīng)用于抗生素抗性基因檢測等[12]。

3.1 病毒檢測

Wang 等[13]將RAA 和qPCR 技術(shù)結(jié)合，在qPCR 的基礎(chǔ)上引入RAA 反應(yīng)體系，實現(xiàn)了以物理隔絕策略在不開蓋情況下對病毒進行超靈敏、快速且準確的檢測，檢測限最高可達到單個拷貝/反應(yīng)，比常規(guī)qPCR 敏感。Chen 等[14]開發(fā)了一種RT-RAA 法檢測呼吸道合胞病毒（RSV），該方法在39 ℃恒溫條件下，30 min 即可得到檢測結(jié)果，對呼吸道合胞病毒A 型（RSVA）、B 型（RSVB）的檢測靈敏度分別達到38、35 拷貝/反應(yīng)，能更快速檢測RSV。Mao 等[15]建立了猴痘病毒等溫擴增檢測方法，其將RAA 方法與側(cè)向流試紙條結(jié)合（RAA-LFS），在大大縮短檢測時間的同時，保證了靈敏性。Fan 等[16]用兩種等溫擴增法（RPA/RAA）進行了ASFV 檢測，同時將檢測結(jié)果與實時PCR 進行臨床驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在靈敏度方面，RPA 和RAA 分別能達到93.4 和53.6 拷貝/反應(yīng)，在39 ℃下16 min 即可得到檢測結(jié)果，且與其他豬源類病原體無交叉反應(yīng)，對ASFV 的24 種基因型均具有特異性，說明該方法具有較好的臨床應(yīng)用價值。

3.2 細菌及耐藥性檢測

葛以躍等[17]將RAA 技術(shù)與CRISPR-Cas13a檢測系統(tǒng)相結(jié)合，建立了一種快速、靈敏、特異的副溶血性弧菌檢測方法（RAA-Cas13a），其對副溶血性弧菌的檢測靈敏度為10 拷貝/反應(yīng)，為副溶血性弧菌的快速檢測提供了新工具。郭晨瑤等[18]建立了霍亂弧菌fRAA 檢測方法，該方法等溫30 min 即可出結(jié)果，且檢測儀器便攜度高，最低檢測限可達6.7×102拷貝/μL，設(shè)計的引物與副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌等12 種非霍亂弧菌進行DNA擴增試驗，結(jié)果均為陰性。姚麗鋒等[19]建立了食品中銅綠假單胞菌的RAA 方法，可20 min 完成檢測，對純菌液檢測的靈敏度為1.7 pg/μL，對肉類樣品的檢出限與傳統(tǒng)檢測方法一致。

周志祥等[20]采用RAA 建立了對四環(huán)素抗性基因（tetA）的檢測，其最低檢測限為2×102拷貝/μL，并且與tetA陽性菌、無抗性細菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、志賀菌等）、不同耐藥表型細菌（同時含有氨芐青霉素抗性、嘌呤霉素抗性）等無交叉反應(yīng)。車勇良等[21]通過RAA 技術(shù)建立了多黏菌素耐藥基因mcr-1檢測方法，其最低檢測限為102拷貝/μL，檢測結(jié)果與現(xiàn)有檢測方法一致。目前RAA 技術(shù)用于抗生素抗性基因檢測的研究較少，但從已有方法來看，有很大的研究前景。

3.3 寄生蟲檢測

RAA 技術(shù)憑借高效、快速、便捷等優(yōu)勢，已被應(yīng)用于寄生蟲核酸檢測，并成為推進寄生蟲病現(xiàn)場檢測和防控工作的重要手段。Lin 等[22]針對瘧疾設(shè)計了RAA-LFD 檢測方法。該方法在37 ℃下孵育15 min 后，在試紙條上滴加樣品，3 min 后可見到擴增條帶；在靈敏度方面，重組質(zhì)粒可達1 拷貝/μL；在實驗室能力有限或資源匱乏的環(huán)境中對瘧原蟲進行檢測，可得到較可靠的檢測結(jié)果。Lin 等[23]對小巴貝蟲進行研究，選擇cox1為靶基因，建立了fRAA 檢測方法，其靈敏度可達到10 拷貝/ 反應(yīng)重組質(zhì)粒和10 fg/μL 基因組DNA。邵雷等[24]建立了快速、靈敏檢測瘧原蟲的RAA 技術(shù)，其對瘧原蟲的檢測限達到10 拷貝/μL，與惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲等病原體和嬰兒利士曼原蟲、杜氏利士曼原蟲等無交叉反應(yīng)。Ding 等[25]針對鉤蟲進行研究，建立了基于RAA 技術(shù)的新型檢測方法，其能夠在0.1 pg/μL 質(zhì)量濃度下，檢測出2 種鉤蟲基因組DNA，具有較高的靈敏度。

4 RAA 法的標準發(fā)布及產(chǎn)品開發(fā)

目前，在動物產(chǎn)品成分檢測以及新型冠狀病毒、非洲豬瘟等病原檢測領(lǐng)域已制定了相關(guān)RAA檢測標準[26-31]，表2 為RAA 方法相關(guān)標準的發(fā)布情況。在市場應(yīng)用方面，國內(nèi)現(xiàn)有RAA 產(chǎn)品開發(fā)公司包括眾測生物、奇天基因、寶盈同匯等，涉及的RAA 產(chǎn)品包括樣本前處理試劑、核酸檢測試劑盒（RAA 法/RT-RAA 法）、病原實時檢測試劑盒和檢測儀器等。奇天基因針對新型冠狀病毒靶基因ORF1ab 開發(fā)了RAA 檢測試劑盒，增設(shè)了內(nèi)參檢測方案，并通過了中國疾病預(yù)防控制中心新型冠狀病毒樣本驗證和其他50 多種病毒、細菌交叉干擾試驗驗證，準確性和特異性均100%符合。德國萊比錫實驗室設(shè)計了基于RAA 的新型冠狀病毒檢測試劑盒，并在非洲7 國進行了現(xiàn)場驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于RdRP 的RT-RAA 法測試結(jié)果最佳[32]。

表2 關(guān)于RAA 法標準發(fā)布情況

5 展望

RAA 作為一種可以在37～42 ℃等溫條件下完成快速檢測的核酸擴增技術(shù)，近年來得到了長足發(fā)展。與PCR變溫擴增方法相比，RAA具有操作簡單、檢測時間短、對設(shè)備要求低等優(yōu)點。在靈敏度方面，RAA 最低可檢測樣本中含量為單拷貝的核酸，靈敏度超過PCR 方法；在特異性方面，RAA 引物探針序列較長，抗干擾能力更強，特異性良好。此外，RAA 技術(shù)可以在37～42 ℃下恒溫運行，無需復(fù)雜的溫度控制設(shè)備，非常適合低資源環(huán)境下的現(xiàn)場檢測，且RAA 可在20 min 內(nèi)得到檢測結(jié)果，有利于樣本的快速篩查和檢測。

為了提高RAA 技術(shù)的高效性和便捷性，人們對RAA 技術(shù)的擴增體系和檢測結(jié)果讀取系統(tǒng)采取了各種優(yōu)化和改進措施，如添加熒光探針以提高檢測可視化，開發(fā)便攜式手提箱，開發(fā)病原實時檢測試劑盒等。

當然，RAA 作為一種新興檢測方法，開發(fā)時間較短，還存在一定的局限性。例如，沒有專門的RAA 引物設(shè)計軟件，常規(guī)PCR 引物設(shè)計軟件無法做到兼容。因RAA 反應(yīng)在常溫下進行，如操作不慎，就容易造成核酸污染，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。此外，RAA 技術(shù)在海關(guān)動物產(chǎn)品成分檢測及非洲豬瘟檢測等方面有相關(guān)應(yīng)用，尚未得到普及，主要作為未開放技術(shù)，多用于科學(xué)研究?，F(xiàn)國內(nèi)主要有3 家公司可自主研發(fā)并生產(chǎn)、銷售RAA 檢測試劑盒，對大規(guī)模檢測樣品來說，其成本較高。因此，需要進一步對RAA 技術(shù)進行完善優(yōu)化，放大RAA 技術(shù)優(yōu)勢，彌補當前不足，推動該技術(shù)在體外診斷行業(yè)的發(fā)展。