羅 娟，尚佳靜，封瑩潔，孟 鴿，張富友，鄧春冉，于曉慧，蔣文明，劉華雷，劉冠慧，李 陽

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056038）

星狀病毒（astroviruses，AstVs）于1975年首次被發(fā)現(xiàn)，因其在電子顯微鏡下呈現(xiàn)具有明顯五角或六角星狀外觀而被命名為星狀病毒。AstVs 最早是在患有腹瀉的兒童中被檢出，隨后在哺乳動物幼崽和雛鳥中被發(fā)現(xiàn)[1-2]?；诟腥舅拗鞣秶煌?，AstVs 可分為哺乳動物星狀病毒（mammalian astroviruses，MAstV） 和禽星狀病毒（avian astroviruses，AAstV）。雖然不同屬AstVs 對同一物種可引起相似的臨床癥狀，但對不同物種引起的臨床癥狀存在一定差異：哺乳動物感染AstVs 可表現(xiàn)腸道疾病，或其他一系列癥狀，如水貂和奶?？杀憩F(xiàn)腦炎和腦膜炎癥狀，犢牛出現(xiàn)呼吸道疾病等[3-5]；禽類感染后，火雞主要表現(xiàn)腸炎[6]，雞表現(xiàn)腎炎[4]，鴨、鵝則出現(xiàn)肝炎、痛風等不同病癥[7-8]，還可出現(xiàn)孵化率降低、死亡率增加等[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)AAstV 可能存在跨宿主感染：Meyer等[11]在岡比亞、肯尼亞人類糞便中分離到2 株新型AAstV，比對發(fā)現(xiàn)其與禽腎炎病毒1 型、2 型及犬星狀病毒具有高度相似性；Chen 等[12]從患病小鴨中成功分離到鵝星狀病毒2型（goose astrovirus 2，GoAstV-2）毒株，對其進行雛鴨動物回歸試驗發(fā)現(xiàn)，該毒株在雛鵝和雛鴨之間可能存在跨宿主感染。

AAstV 分型較多，至今尚未有有效疫苗和藥物對該病進行防治，因此病原檢測在AAstV 感染監(jiān)測和鑒別診斷中起重要作用。目前國內外已建立多種AAstV 檢測方法，包括電鏡法以及病毒分離與鑒定、免疫學檢測、分子生物學檢測等技術。本文主要針對現(xiàn)階段的AAstV 檢測技術的應用和發(fā)展進行綜述，期望能夠為AAstV 檢測方法研究提供參考。

1 病毒分類及生物學特性

1.1 病毒分類

1995年以來，國際病毒分類委員會（The International Committee for Taxonomy of Viruses，ICTV）對不同來源禽類和哺乳動物物種的AstVs分類進行了多次修改[13-14]。目前ICTV 報道的AAstV 包 括3 個 型——AAstV-1、AAstV-2 和AAstV-3，其中AAstV-1 包含火雞星狀病毒1 型（turkey astrovirus 1，TAstV-1），AAstV-2 包含禽腎炎病毒1 型（avian nephritis virus 1，ANV-1）和2 型（ANV-2），AAstV-3 包含TAstV-2 和鴨星狀病毒1 型（duck astrovirus 1，DAstV-1）[15]。近年來還有一些AAstV 沒有被明確分類，如雞星狀 病毒（chicken astrovirus，CAstV）、GoAstV、TAstV-3、DAstV-2 等[16]。AAstV 分類圖見圖1。

圖1 AAstV 分類

1.2 分子生物學特征

AAstV 是一種無囊膜的單股正鏈RNA 病毒，基因組全長一般為6.8～7.9 kb，由5' 非翻譯區(qū)（5' UTR）、3'非翻譯區(qū)（3' UTR）、1 個多聚核苷酸尾巴（poly A）及3 個開放閱讀框（ORF1a、ORF1b、ORF2）組成[17]。ORF1a 和ORF1b 區(qū)域編碼非結構蛋白（NSP），包括跨膜結構域（TM）、絲氨酸蛋白酶基序、鋅指蛋白模型、核定位序列和RNA 依賴性RNA 聚合酶[18]。ORF1b 與ORF1a之間存在一段重疊區(qū)域，且不同物種AstVs 的重疊區(qū)域稍有不同，MAstV 重疊區(qū)長為10～148 nt，AAstV 重疊區(qū)長一般為12～45 nt。兩者重疊區(qū)域中還包含1 個核糖體移碼信號，其對RNA 聚合酶翻譯起重要作用。ORF1b 是病毒種屬和血清型之間差異最小的區(qū)域[19]；ORF2 編碼衣殼蛋白、刺突蛋白和結構蛋白（衣殼蛋白前體），是病毒高度變異區(qū)間，能夠與病毒的特異性抗體發(fā)生特異性反應，同時也是劃分AAstV 的種間依據(jù)[20-22]。

1.3 理化特征

AAstV 適應外界環(huán)境能力較強且比較穩(wěn)定，在4 ℃及室溫環(huán)境中可穩(wěn)定存活幾個月，對高溫、高濃度酸不敏感；可抵抗多種消毒劑，如氯仿、各種去垢劑、酚類、酸類、醇類、季銨鹽和脂質溶劑等[23]。但有研究[24]表明，90%甲醇或含有硫酸鹽的消毒劑也可以達到滅活AAstV 的目的。

2 檢測技術

2.1 電鏡法

電鏡法是指借助電子顯微鏡等儀器，對病毒粒子的顯微結構進行觀察，對病毒種類進行分類的一種檢測方法。1975年，研究者利用電子顯微鏡在患有胃腸炎嬰兒的糞便中觀察到28～30 nm 的星狀病毒粒子。有研究[25]將GoAstV-2 接種雞肝癌細胞（LMH cell，LMH），3 次傳代后收集病毒感染的LMH，用2.5%戊二醛固定后使用透射電子顯微鏡觀察到大量病毒顆粒，顆粒直徑約為30 nm。電子顯微鏡的敏感程度和樣品濃度相關，因此在檢測時具有一定的局限性，當病毒含量低時結果難以被準確觀察。由于只有少數(shù)病毒粒子能夠表現(xiàn)出完整的星狀結構，易與一些小RNA 病毒混合，所以此方法準確性低。因此，電鏡法不適于大批量臨床樣品檢測，少數(shù)條件下適用于實驗室研究。

2.2 病毒分離與培養(yǎng)

AAstV 常用禽胚或細胞進行分離培養(yǎng)。有研究[26]利用無特定病原（specific pathogen free，SPF）雞胚代替鴨胚或鵝胚進行DAstV 和GoAstV分離鑒定，發(fā)現(xiàn)有些毒株無法適應SPF 雞胚，但在SPF 雞胚中被成功分離的病毒，對雞胚致死率達到100%。Zhang 等[27]將GoAstV-2 組織樣品處理后接種到鵝胚發(fā)現(xiàn)，隨著傳代次數(shù)的增加，到第5 天胚胎死亡率達到60%～100%，死亡胚胎出現(xiàn)浮腫、肝臟壞死和出血，絨毛尿囊膜增厚。Liu等[28]經(jīng)絨毛尿囊膜接種鴨胚對DAstV-3 毒株進行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)從第4 代開始出現(xiàn)鴨胚死亡，死亡率達到20%～33.3%，第7～16 代，死亡率高達62.5%～100%，并且感染胚胎表現(xiàn)出不同程度的發(fā)育遲緩、皮膚出血和頭部水腫等癥狀。Wang等[29]為實現(xiàn)GoAstV-1 的分離，將病毒勻漿液分別接種于SPF 雞胚、SPF 鴨胚和鵝胚，發(fā)現(xiàn)接種3 代后，鵝胚在10 d 后出現(xiàn)死亡，死亡率可達40%～100%，死亡胚胎出現(xiàn)嚴重的皮下出血，但利用雞胚、鴨胚進行分離，未成功分離出病毒。由于缺乏SPF 鵝胚，在每次進行GoAstV 分離時，都要從鵝胚中排除其他病原體污染，導致GoAstV 分離較為困難。

雞肝癌細胞（LMH）、鵝胚胎腎細胞（GEK）、鵝胚胎肝細胞（GEH）、鵝胚胎成纖維細胞（GEF）、鴨胚成纖維細胞（DEF）也可用于AAstV 分離[30]。Zhu 等[25]和Zhao 等[31]分別將患病鵝和雞的內臟組織勻漿液接種LMH，發(fā)現(xiàn)能夠通過LMH分離到GoAstV-2 和CAstV。Zhang 等[32]也發(fā)現(xiàn)GoAstV 雖然能夠在LMH 中繁殖，但未導致明顯細胞病變。Zhang 等[33]研究發(fā)現(xiàn)DAstV-1 的親本毒株和獲救毒株均可以在DEF 細胞中培養(yǎng)。由此可見，部分毒株也可適應細胞，在細胞上進行繁殖。但原代細胞生長潛力有限，需要自己制備。綜上可見，用禽胚和原代細胞分離鑒定操作過程繁瑣，周期長，且在分離過程中存在一定的局限性。

2.3 免疫學檢測技術

2.3.1 免疫熒光技術 免疫熒光技術是根據(jù)抗原抗體反應的基本原理，將抗原或抗體以共價鍵形式牢固結合，熒光抗體或抗原與特異性抗原或抗體反應，在紫外線下可觀察到熒光的技術[34]。該技術可分為直接免疫熒光技術（direct fluorescent antibody，DFA）和間接免疫熒光技術（indirect fluorescent antibody，IFA）。DFA 靈敏度低且用于直接標記的抗原來源較少，操作復雜，未得到廣泛使用；IFA 主要使用未標記的一抗與抗原結合，利用不同來源的二抗與一抗結合，在熒光顯微鏡下觀察，即可檢測出相應的抗原定性和定位。劉莉等[35]以原核表達載體pET-30a（+）表達了GoAstV-1 結構蛋白編碼基因ORF2，制備了兔源多克隆抗體血清，經(jīng)IFA 鑒定，證實所制備的多克隆抗體血清能夠與GoAstV-1 特異性結合。而Li等[36]則使用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達ORF2 衣殼基因片段制備了小鼠多克隆抗體，并以此作為IFA 一抗，可用于測定病毒滴度。但IFA 的一抗需自己制備，制備過程繁瑣耗時。

2.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是將吸附在固相載體表面的已知抗原或抗體與酶標記的待檢抗體或抗原進行孵育，利用洗滌液將在固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分離，滴加顯色劑進行顯色，通過酶標儀對待測物濃度進行檢測的一種方法。Wang 等[37]表達了DAstV 衣殼蛋白C 端，建立了DAstV ELISA 抗體檢測方法；Ren 等[38]針對ORF2 的單克隆抗體（mAbs），開發(fā)了用于檢測抗GoAstV-1 抗體的夾心ELISA 檢測方法，可用于GoAstV-1 的血清學檢測。此類方法對實驗室安全級別要求不高，不會造成過多的污染，在流行病學調查中應用較多，但該方法的穩(wěn)定性還有待提高[39]。

2.4 分子生物學診斷技術

2.4.1 聚合酶鏈式反應 20世紀80年代Mullis 發(fā)明了聚合酶鏈式反應（ploymerase chain reaction，PCR），因其能夠檢測難以培養(yǎng)的微生物，操作簡單，目前已成為實驗室應用較多的方法之一，也是AAstV 的主要檢測方法之一。擴增程序主要包括變性、退火和延伸[40]，擴增產物可通過瓊脂糖凝膠電泳分析、直接測序或克隆到單個質粒載體后測序分析，對單個克隆進行測序[41-42]。該方法已被應用于AAstV 分型和大批量臨床樣本的流行病學調查。Liu 等[28]建立了一種檢測DAstV-3 的PCR 方法，其特異性較好，與其他3 種DAstV 無交叉反應，最低檢測限可達5.5×102copies/μL，為開展DAstV-3 流行病學和致病性調查提供了診斷工具。肖亦辰等[43]針對GoAstV-2 的ORF2 基因序列設計特異性引物建立了RT-PCR 方法，其最低檢測限可達4.54×102copies/μL，對實現(xiàn)該病的臨床檢測及有效防控具有重要意義。總體上，PCR 方法操作簡單，成本低，已成為臨床上檢測AAstV的主要手段，被用于大批量臨床樣本AAstV 篩查，但其耗時長，產物殘留或PCR 抑制易導致假陽性結果[44]。隨著技術的發(fā)展，在單一PCR 擴增的基礎上又興起了多重PCR 技術，即在同一體系中加入兩對或多對擴增不同目標的引物，操作與單一PCR 相同，但在設計引物時要注意區(qū)分不同病毒目的片段的大小，以免混淆。Dai 等[45]以鵝細小病毒（GPV）和番鴨細小病毒（MDPV）Rep1基因為靶基因，設計了通用PCR 引物，同時根據(jù)鴨腸炎病毒（DEV）UL54基因、GoAstV 的ORF1b基因設計特異性檢測引物，建立了多重PCR 檢測方法，可在一次反應中同時檢測GPV、MDPV、DEV、GoAstV，研究發(fā)現(xiàn)此方法特異性較好，其中DEV、GoAstV 靈敏度分別為2.136×102和7.481× 10?1copies/μL，GPV 和MDPV 的靈敏度一致，均為2.375×103copies/μL。Jindal 等[46]針對禽輪狀病毒的NSP4基因以及TAstV-2 和禽呼腸孤病毒的S4基因保守序列設計特異性引物，所建立的PCR 檢測方法能夠實現(xiàn)對這3 種病毒的同時檢測與鑒別。為實現(xiàn)GoAstV-1 和GoAstV-2 的鑒別檢測，王宏宇等[47]針對GoAstV-1 和GoAstV-2 的RdRp區(qū)域設計特異性引物，建立了雙重RT-PCR檢測方法，此方法特異性較好，檢測限分別可達103和102copies/μL，為GoAstV 感染的早期流行病學調查和臨床診斷提供了可靠手段。

2.4.2 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR 是將PCR 與熒光報告化學及電信號分析相結合，監(jiān)測模板擴增的一種檢測方法，分為相對定量和絕對定量兩種，可用于基因表達，微生物、拷貝數(shù)的絕對定量或相對基因表達研究。相對定量法是將一個樣品的基因表達與另一個樣品進行比較，而絕對定量法是使用一系列標準品構建的標準曲線進行定量計算。相較于RT-PCR 方法，實時熒光定量PCR的靈敏度和特異性更好，其操作簡單，反應產物無需開蓋檢測，檢測限（能夠檢到核酸或者細胞的最低濃度）和定量限（被定量的最低濃度）較高[48-49]，目前已被廣泛用于AAstV 實驗室快速檢測。Smyth 等[50]建立了分別檢測ANV 和CAstV的實時熒光定量PCR 檢測方法，并通過試驗證明該方法可對感染雞的病毒復制能力進行監(jiān)測。為實現(xiàn)DAstV-3 的快速檢測，掌握其在鴨群中的流行動態(tài)，傅秋玲等[51]針對nsp1a基因設計了特異性引物和探針，建立了檢測DAstV-3 的熒光定量PCR 方法，其最低檢測限可達21.3 copies/μL，靈敏度較常規(guī)RT-PCR 高11.60%。鄧昕竹等[52]針對GoAstV 的ORF1b 基因保守序列設計特異性引物和探針，分別建立了TaqMan 和SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR 方法，并利用該方法對臨床樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)探針法靈敏度較好，其陽性檢出率較染料法高。熒光定量PCR 儀器具有可以同時檢測不同熒光通道擴增情況的優(yōu)勢，即在同一反應體系中加入不同熒光基團標記的探針，可實現(xiàn)對多種疾病病原的同時檢測。近年來有許多研究者建立了多重熒光定量PCR 技術。如：Wang 等[53]針對GoAstV 的ORF1b 保守基因序列，建立了快速檢測GoAstV-1 和GoAstV-2 的雙重熒光RT-PCR 方法；Yang 等[54]建立了檢測GPV 和GoAstV 的雙重實時熒光定量PCR 方法，能夠實現(xiàn)對兩種病毒混合感染的鑒別檢測，為GPV 和GoAstV 感染的流行病學調查提供了有效的篩查手段。

2.4.3 其他檢測技術 隨著技術的不斷發(fā)展，一些新興的檢測技術也逐漸被應用到禽病檢測中，如環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和重組酶介導等溫擴增（recombinase aided amplification，RAA） 等。 上述方法操作簡單，反應時間較短，恒溫條件下即可完成反應，無需昂貴的設備，目前已被用于新型冠狀病毒[55]、禽流感病毒[56]等病原體的檢測，在AAstV 上也有一定的應用。鄧春冉等[57]針對DAstV-3 的RdRp基因保守區(qū)域設計特異性引物和探針，建立了RT-RAA 檢測方法，其在39 ℃恒溫條件下，僅需20 min 就能實現(xiàn)對DAstV-3 的快速檢測。Yu 等[58]針對GoAstV ORF2 基因設計了特異性引物從而建立了RT-LAMP 檢測方法，并將該方法與巢氏PCR 和普通RT-PCR 方法進行對比，結果發(fā)現(xiàn)RT-LAMP 的靈敏度與巢氏PCR 基本一致，但要優(yōu)于普通RT-PCR，且該方法耗時短，對設備要求不高，僅需恒溫水浴鍋即可完成反應。除此之外，基于規(guī)律成簇的間隔短回文重復序列及其相關蛋白（CRISPR/Cas）核酸的即時檢測分子診斷技術由于快速、簡單、敏感等優(yōu)點，也逐漸被用于檢測各種病原體，包括寨卡病毒、登革熱病毒、非洲豬瘟病毒等[59]。Yang 等[60]將酶促重組等溫擴增技術（ERA）與CRISPR-Cas12a 技術相結合，成功建立了用于快速檢測GoAstV 的方法，其操作簡單，僅需便攜式加熱器進行反應，特異性較好，靈敏度低至8 copies/μL。上述不同AAstV 分子生物學診斷技術的檢測限及優(yōu)缺點對比結果見表1。

表1 不同AAstV 分子生物學診斷技術檢測限及優(yōu)缺點對比

3 小結

現(xiàn)階段對于AAstV 的研究大部分都集中在引起以痛風、尿酸鹽沉積為主要癥狀的GoAstV，而對CAstV、TAstV、DAstV 等其他AAstV 的研究相對較少。由于缺少合適的動物模型，在AstVs 致病機制、疫苗和藥物研發(fā)方面存在一定難度?；谏鲜鲅芯楷F(xiàn)狀和局限，開發(fā)靈敏、快速、準確的檢測方法，對于有效控制AAstV 感染的頻發(fā)和開展分子流行病學調查具有重要意義。隨著檢測技術的不斷進步，AAstV 檢測技術得以發(fā)展。不同檢測方法各有優(yōu)劣：電鏡法在病毒含量低時難以檢測，準確性較低；病毒分離鑒定準確可靠，但缺少理想的病毒體外培養(yǎng)體系，且分離培養(yǎng)耗時長；IFA 沒有成品化的一抗，需要個人制備；ELISA 操作簡單，成本較低，被廣泛應用于流行病學調查及抗體水平檢測，但目前針對AAstV 的研究相對較少；PCR操作簡單，成本低，但耗時長，產物殘留或PCR抑制易出現(xiàn)假陽性結果；實時熒光定量PCR 的靈敏度和特異性更好，操作簡單，但成本較PCR 高，熒光引物探針設計復雜；RT-RAA、RT-LAMP、CRISPR-Cas 等檢測技術耗時更短，設備要求不高，靈敏性和特異性更好，但同樣易出現(xiàn)假陽性結果。在生產實踐及研究中，可以根據(jù)不同場合及需求選擇合適的方法，以提高工作效率。隨著對AAstV研究的不斷深入，以及不同技術的結合與優(yōu)化，該病原的檢測方法將會得到更多的開拓，更靈敏、更簡便的新型檢測技術的建立也將為該病診斷及防控提供更有力的技術支持。