于浩洋，王彩霞，仇松寅，劉曉飛，景宏麗，吳紹強(qiáng)，馮春燕，林祥梅

（1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢驗(yàn)與檢疫研究所，北京 100176；2.三亞中國檢科院生物安全中心，海南三亞 572000）

豬Linda病毒（Linda virus，LV）是黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）的新成員。瘟病毒屬病毒為高度可變的RNA 病毒，病毒粒子包含4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和8 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[1]。在國際病毒分類委員會(huì)（ICTV）第十次報(bào)告中，瘟病毒屬被劃分為11 個(gè)種（PestivirusA—K），具體包括牛病毒性腹瀉病毒Ⅰ型（bovine viral diarrhea virus 1，BVDV-1）、牛病毒性腹瀉病毒Ⅱ型（bovine viral diarrhea virus 2，BVDV-2）、豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、邊界病病毒（border disease virus，BDV）、叉角羚羊瘟病毒（pronghorn antelope pestivirus，PAPeV）、Bungowannah 病毒（Bungowannah virus，BV）、長(zhǎng)頸鹿瘟病毒（giraffe pestivirus，GPeV）、Hobi 樣瘟病毒（Hobi-like pestivirus，HoBiPeV）、Aydin 樣瘟病毒（Aydinlike pestivirus，AydinPeV）、 大鼠瘟病毒（rat pestivirus，RPeV）、豬非典型瘟病毒（atypical porcine pestivirus，APPV）[2]。該屬中的CSFV、BV、APPV 與LV 都可引起豬相關(guān)疾病，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。其中BV、APPV 與LV均為近20年來發(fā)現(xiàn)的新型瘟病毒。2003年，澳大利亞豬只暴發(fā)了可導(dǎo)致母豬生殖障礙，產(chǎn)死胎、木乃伊胎以及斷奶仔豬猝死的疫病，2007年其病原被命名為BV[3-4]。2015年，APPV 被發(fā)現(xiàn)，其能夠引起仔豬先天性震顫（congenital tremors，CT），在全球范圍內(nèi)均有流行[5]。同年，Benjamin 等[6]從奧地利一家豬場(chǎng)的感染豬中分離出一種新型瘟病毒，將其命名為L(zhǎng)inda病毒。研究[7]顯示：感染LV 后，該豬場(chǎng)中20%～100%仔豬表現(xiàn)出嚴(yán)重的全身側(cè)搖及吮吸母乳困難，且仔豬斷奶前死亡率很高；對(duì)患病仔豬進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，確認(rèn)其為A-II 型CT，患病仔豬脊髓髓鞘退化嚴(yán)重，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）組織中存在病毒抗原。雖然LV 與APPV 均會(huì)導(dǎo)致CT，但瘟病毒屬親緣關(guān)系研究[8]顯示，LV 與BV 的親緣關(guān)系最近，而與APPV 基因同源性僅為60%。另一項(xiàng)研究[9]顯示，免疫功能正常的仔豬感染LV 后可出現(xiàn)短暫的病毒血癥，在感染后14 d 表現(xiàn)出強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生高滴度的LV 中和抗體，且病毒能夠持續(xù)存在于仔豬淋巴組織中，21 d 后仍可被檢測(cè)到。LV 感染疫情首次在奧地利發(fā)生后并沒有造成廣泛傳播，僅在距離首次發(fā)生疫情農(nóng)場(chǎng)10 km 以外的另一農(nóng)場(chǎng)中被監(jiān)測(cè)到，該農(nóng)場(chǎng)仔豬同樣出現(xiàn)了CT 癥狀和死亡，同時(shí)在感染仔豬的糞便和唾液中檢出大量病毒，推測(cè)這可能是LV 的傳播途徑[10]。目前我國尚無LV感染病例，關(guān)于LV 的檢測(cè)方法也較少，僅有本實(shí)驗(yàn)室建立的熒光RT-PCR 方法[11]，而儲(chǔ)備有效快速的檢測(cè)方法是預(yù)防該疫病傳入的有效手段。

巢式PCR 是使用兩套引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的方法，相較于普通PCR，它具有更高的特異性和靈敏度[12]。此外，巢式PCR 是一種傳統(tǒng)的PCR 技術(shù)，對(duì)設(shè)備、人員及成本要求不高，適用于條件有限的養(yǎng)殖場(chǎng)及實(shí)驗(yàn)室。本研究針對(duì)LV 保守序列Core-Erns基因，首次建立了巢式RT-PCR檢測(cè)方法，以期對(duì)LV 進(jìn)行準(zhǔn)確、快速檢測(cè)，從而為口岸預(yù)防該病傳入及國內(nèi)養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)疫病檢測(cè)提供技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

滅活的非洲豬瘟病毒（African swine fever，ASFV）陽性血清，由波蘭國家獸醫(yī)研究所提供；CSFV 活疫苗，購自武漢科前生物股份有限公司；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）活疫苗，購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司；豬偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）活疫苗（Kartha-K61株），購自青島易邦生物工程有限公司；豬圓環(huán)病毒2 型（porcine circovirus type 2，PCV2）滅活疫苗，購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；DNA 提取試劑盒（QIAamp?Viral DNA Mini Kit）、RNA提取試劑盒（QIAamp?Viral RNA Mini Kit），購自德國QIAGEN 公司；2×PCR ExTaq聚合酶，購自日本TaKaRa 公司；一步法移除gDNA 并合成cDNA 混 合 液（TransScipt II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix），購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；聚乙二醇8000（PEG 8000），購自美國Sigma 公司；pLVX 載體、包膜質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒、293T 細(xì)胞等，均由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院保存；Core-Erns基因靶標(biāo)序列，由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

PCR 儀（Veriti96），購自美國ABI 公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Microfuge20R），購自美國BECKMAN COULTER 公司；電泳儀（DYY-6C 型），購自北京六一生物科技有限公司；迷你紫外投射切膠儀（M-10E），購自美國UVP 公司；凝膠成像儀（Fluor Chem E），購自美國protein simple 公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

針對(duì)靶序列，引物位置的選擇對(duì)PCR 建立至關(guān)重要。使用Mega 7.0 軟件對(duì)瘟病毒屬病毒Core-Erns基因序列進(jìn)行分析，確認(rèn)各病毒的親緣關(guān)系，并繪制遺傳進(jìn)化樹。隨后下載GenBank 中所有LV 毒株序列（OK086026.1、MZ027894.1、NC_035432.1 與KY436034.1）及同屬病毒代表毒株序列，包括BVDV-1（M31182.1、KX577637.1）、BVDV-2（U18059.1、FJ527854.1）、CSFV（X87939.1、J04358.2）、BDV（AF037405.1）、PAPeV（AY781152.3）、BV（NC023176.1、MH807263.1、EF100713.2）、GPeV（AF144617.2）、BVDV-3（AB871953.1）、AydinPeV（NC018713.1）、RPeV（KJ950914.1）、APPV（KX929062.1、KU041639.1、KU194229.1）。 對(duì)上述毒株的Core-Erns基因序列進(jìn)一步比對(duì)分析，選取LV 與其余瘟病毒有差異的Core-Erns基因區(qū)域來設(shè)計(jì)引物。

1.3 RNA 慢病毒粒子核酸定性陽性對(duì)照樣品制備

將人工合成的Core-Erns基因靶標(biāo)序列克隆至慢病毒pLVX 載體，然后將重組質(zhì)粒與包膜質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞；48 h 后收集含有慢病毒顆粒的細(xì)胞上清，加入PEG 8000，混勻后置于4 ℃過夜；對(duì)混合液進(jìn)行濃縮與純化，然后以PBS 輕輕重懸，獲得含有靶標(biāo)基因的慢病毒粒子；按照RNA 提取試劑盒說明書提取慢病毒RNA，并根據(jù)一步法合成cDNA 試劑盒說明書，將慢病毒RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，計(jì)算cDNA 拷貝數(shù)并作為模板待用。

1.4 巢式RT-PCR檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化

按照2×PCR ExTaqPCR 試劑盒說明書提供的反應(yīng)體系與條件，分別對(duì)一輪RT-PCR 與二輪巢式RT-PCR 的模板用量、退火溫度、引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳擴(kuò)增條件。

1.5 敏感性試驗(yàn)

以10 倍倍比稀釋的慢病毒陽性對(duì)照品cDNA（106～100copies/μL）作為模板，無酶水作為陰性對(duì)照，進(jìn)行巢式RT-PCR檢測(cè)，驗(yàn)證所建立方法的靈敏度。

1.6 特異性試驗(yàn)

按照DNA 提取試劑盒說明書，提取PCV2滅活疫苗、ASFV 陽性血清、PRV 活疫苗DNA；再按照RNA 提取試劑盒說明書，分別提取滅活CSFV 活疫苗、PRRSV 活疫苗RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。分別以上述DNA、cDNA 樣品作為模板，同時(shí)以慢病毒陽性對(duì)照品cDNA 為陽性對(duì)照，無酶水為陰性對(duì)照，進(jìn)行巢式RT-PCR檢測(cè)，驗(yàn)證所建立方法的特異性。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

以慢病毒陽性對(duì)照品cDNA（106copies/μL）為模板，重復(fù)3 次試驗(yàn)，進(jìn)行組內(nèi)巢式RTPCR 檢測(cè)；然后以慢病毒陽性對(duì)照品cDNA（106copies/μL）為模板，每隔1 周進(jìn)行1 次試驗(yàn)，共3 次，進(jìn)行組間巢式RT-PCR檢測(cè)，驗(yàn)證所建立方法的重復(fù)性。

1.8 對(duì)病毒模擬樣品的檢測(cè)限及與熒光RT-PCR靈敏度比較

病毒模擬樣品制備：參照文獻(xiàn)[13]中的方法，計(jì)算1.3 中LV RNA 慢病毒粒子滴度，并對(duì)慢病毒粒子進(jìn)行10 倍倍比稀釋（106～100TU/mL）；將不同濃度梯度的慢病毒粒子分別與豬陰性血清混合，制備病毒模擬樣品。提取病毒模擬樣品RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用本研究建立的巢式RT-PCR與本實(shí)驗(yàn)室前期建立的熒光RT-PCR 方法[11]，分別對(duì)病毒模擬樣品進(jìn)行擴(kuò)增，評(píng)估巢式RT-PCR 對(duì)病毒模擬樣品的檢測(cè)限，并比較上述兩種方法的靈敏度。

2 結(jié)果

2.1 靶序列選擇及引物設(shè)計(jì)

利用Mega 7.0 軟件對(duì)瘟病毒屬病毒Core-Erns基因進(jìn)行進(jìn)化分析。以LV 為樹根繪制的進(jìn)化樹（圖1）顯示，LV 與BV（NC023176.1、EF100713.2）親緣關(guān)系較近，與其余瘟病毒親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。進(jìn)一步對(duì)瘟病毒Core-Erns基因靶序列比對(duì)分析的結(jié)果（圖2）顯示，LVCore-Erns基因靶序列（1 030～1 664 bp）為一段高度保守序列。針對(duì)該靶序列，使用Oligo7 軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)套式引物，外套引物為L(zhǎng)INDA-N-F1、LINDA-N-R1，內(nèi)套引物為L(zhǎng)INDA-N-F2、LINDA-N-R2。引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

圖1 瘟病毒屬病毒Core-Erns 基因進(jìn)化關(guān)系

圖2 瘟病毒屬病毒Core-Erns 基因靶序列比對(duì)結(jié)果

2.2 巢式RT-PCR 反應(yīng)體系建立

經(jīng)過對(duì)模板用量、退火溫度和引物配比等優(yōu)化，最終確定了LV 一輪RT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×ExTaq10 μL，LINDA-N-F1（10 μmol/L）1 μL，LINDA-N-R1（10 μmol/L）1 μL，LV 慢病毒陽性對(duì)照品cDNA（作為模板）1 μL，最后以ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。

LV 第二輪巢式RT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×ExTaq10 μL，LINDA-N-F2（10 μmol/L）1 μL，LINDA-N-R2（10 μmol/L）1 μL，100 倍稀釋的一輪PCR 產(chǎn)物（作為模板）1 μL，最后以ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。

2.3 敏感性試驗(yàn)

以10 倍倍比稀釋的LV 慢病毒陽性對(duì)照品cDNA（106～100copies/μL）為模板，進(jìn)行巢式RTPCR 檢測(cè)。結(jié)果顯示，第一輪RT-PCR 可檢測(cè)到102copies/μL 的慢病毒陽性對(duì)照品cDNA（圖3-A）；以100 倍稀釋的第一輪RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物作為巢式RT-PCR 模板，第二輪巢式RT-PCR可檢測(cè)到101copies/μL 的慢病毒陽性對(duì)照品（圖3-B）。結(jié)果表明，巢式RT-PCR 靈敏度為普通RTPCR 的10 倍，其對(duì)LV 慢病毒陽性對(duì)照品的最低檢出限為101copies/μL。

圖3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 特異性試驗(yàn)

以CSFV、PRRSV cDNA 以及PCV2 ASFV 及PRV DNA 樣品為模板，慢病毒陽性對(duì)照品cDNA為陽性對(duì)照，無酶水為陰性對(duì)照，進(jìn)行巢式RTPCR 特異性試驗(yàn)。結(jié)果（圖4）顯示，只有泳道1（LV慢病毒陽性對(duì)照品）有目的條帶，其余泳道均沒有條帶。結(jié)果表明，本研究建立的巢式RT-PCR 方法具有良好的特異性。

圖4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

以慢病毒陽性對(duì)照品cDNA（106copies/μL）為模板，進(jìn)行組內(nèi)與組間巢式RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果（圖5）顯示，組內(nèi)與組間各3 次巢式RT-PCR檢測(cè)均為單一目的條帶。結(jié)果表明，該方法具有良好的重復(fù)性。

圖5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 病毒模擬樣品檢測(cè)及與熒光RT-PCR 靈敏度比較

制備不同梯度的病毒模擬樣品（106～100TU/mL），提取其cDNA 作為模板進(jìn)行巢式RT-PCR 與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果（圖6）顯示，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 與巢式RT-PCR 的檢測(cè)靈敏度一致，對(duì)病毒模擬樣品的最低檢出限均為101TU/mL。

圖6 兩種方法對(duì)病毒模擬樣品的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

CT 是一種主要危害新生仔豬的疾病。輕微感染的仔豬表現(xiàn)為耳朵、側(cè)翼或后腿區(qū)域明顯震顫；嚴(yán)重感染時(shí)，仔豬在出生數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生局部或全身肌肉痙攣，甚至出現(xiàn)全身持續(xù)震顫從而站立或行走困難，無法哺乳進(jìn)食，最終被餓死[14]。CSFV、APPV 與LV 等病毒感染是仔豬CT 發(fā)生的原因之一。從病理角度CT 可分為可見組織學(xué)病變的A 型與未見明顯病變的B 型。A 型CT 可進(jìn)一步分為5組，分別為A Ⅰ—A Ⅴ：A Ⅲ和A Ⅳ型與某些豬品種的遺傳相關(guān)；A Ⅴ型是由母豬妊娠期間有機(jī)磷化合物中毒引起；A Ⅰ和A Ⅱ型都是由病毒感染引起，其中A Ⅰ型是由感染CSFV 的母豬經(jīng)胎盤傳播引起，而A Ⅱ型是由APPV 或LV 等病毒感染引起[3，14]。自2015年APPV在美國被首次發(fā)現(xiàn)以來，全球多個(gè)國家均有該病毒的相關(guān)報(bào)道，其血清陽性率可達(dá)到60%，而LV 疫情僅在奧地利出現(xiàn)2 次，并未造成大范圍傳播[7-10]。

目前LV 毒株序列及其相關(guān)研究均較少，且未在我國發(fā)現(xiàn)感染病例。因LV 與APPV 感染后引起的臨床癥狀高度相似，均能引起仔豬發(fā)生CT，因此當(dāng)感染發(fā)生時(shí)，無法根據(jù)癥狀來分辨感染病原，需要進(jìn)一步進(jìn)行分子生物學(xué)鑒別診斷。我國已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道建立了APPV 的PCR 與qPCR 檢測(cè)方法[5]，但LV 的病原學(xué)檢測(cè)方法較少，僅有本實(shí)驗(yàn)室前期建立的熒光RT-PCR 方法。因而儲(chǔ)備靈敏度高、特異性好的LV 檢測(cè)方法對(duì)預(yù)防LV 傳入我國十分重要。

本研究針對(duì)LVCore-Erns基因靶序列建立了巢式RT-PCR 方法。結(jié)果顯示：該方法對(duì)RNA慢病毒粒子核酸定性陽性對(duì)照品的最低檢出限為101copies/μL，靈敏度為普通RT-PCR 的10 倍。該方法顯示出良好的特異性，與ASFV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2 均無交叉反應(yīng)；用該方法對(duì)病毒模擬樣品進(jìn)行檢測(cè)，最低檢出限為101TU/mL，與本實(shí)驗(yàn)室建立的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 方法靈敏度一致[13]。由于巢式RT-PCR 方法成本更低，且僅需PCR 儀便可完成檢測(cè)，因此在條件有限的檢測(cè)機(jī)構(gòu)依然可以進(jìn)行，這為口岸或條件有限的豬場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)篩查L(zhǎng)V 提供了有效的技術(shù)手段。