李 翠，王 兆，2，王德麗，高月異，沈青春，高金源

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)，山東濟(jì)南 250117）

流行性乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE）簡稱乙腦，是由黃病毒科黃病毒屬的乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）感染引起的一種以蚊蟲為傳播媒介的人獸共患傳染病，對(duì)人類危害極大。豬是JEV 傳播的中間宿主，為該病的主要傳染源。JEV 可引起豬的嚴(yán)重繁殖障礙，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重威脅[1]。精準(zhǔn)高效的JE 診斷技術(shù)[2]及疫苗免疫等是該病防治的關(guān)鍵。JEV 僅有1 個(gè)血清型，但在使用血清學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，與其同屬的西尼羅病毒會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)，對(duì)診斷結(jié)果判定造成了干擾[3-4]。JE 診斷技術(shù)研發(fā)和疫苗質(zhì)量控制都需要標(biāo)準(zhǔn)陽性血清[5-6]。目前，已報(bào)道制備的JEV陽性血清多為鼠源、人源[7]，血清效價(jià)偏低，制備數(shù)量也受到限制，無法滿足相關(guān)疫苗檢驗(yàn)、研究的需求。綜合考慮陽性血清的純凈性和特異性要求，JE 活疫苗對(duì)不同動(dòng)物的安全性及免疫效力[8-9]以及前人經(jīng)驗(yàn)[7，10]，本研究選用SPF 雞作為試驗(yàn)動(dòng)物，以JE 活疫苗和滅活疫苗為免疫原，制備了純凈性、特異性好，中和效價(jià)較高的JE 陽性血清，可滿足JE 活疫苗的鑒別檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)[11]需求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 30～35日齡SPF 雞15 只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 免疫原及相關(guān)材料 JE 滅活疫苗（P3 株），購自上海生物制品研究所；豬JE 活疫苗（SA14-14-2株），購自武漢科前生物股份有限公司；BHK21細(xì)胞和地鼠腎原代細(xì)胞，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；安瓿瓶，購自中海生物科技有限公司。

1.1.3 特異性試驗(yàn)所需病毒 口蹄疫病毒（FMDV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）、偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）和牛病毒性腹瀉病毒（BVDV），均來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 免疫程序

選取30～35日齡SPF 雞15 只，以豬JE 活疫苗（SA14-14-2 株）和JE 滅活疫苗（P3 株）分別作為免疫原對(duì)其進(jìn)行免疫。免疫程序：使用稀釋為1 mL/頭份的豬JE 活疫苗（SA14-14-2 株）進(jìn)行肌肉注射1 mL/只，首次免疫后14 d 以相同劑量進(jìn)行第2 次免疫；第2 次免疫后7 d，使用稀釋為1 mL/頭份的JE 滅活疫苗（P3 株）進(jìn)行肌肉注射1 mL/只（第3 次免疫），間隔7 d 后以相同劑量再次免疫1 次，共免疫4 次，全免疫周期35 d。本試驗(yàn)重復(fù)2 次，第1 次使用SPF 雞8 只，編號(hào)分別為1-1—1-8，第2 次使用SPF 雞7 只，編號(hào)分別為2-1—2-7。

1.3 血清抗體檢測(cè)

首次免疫后，每隔7 d 對(duì)SPF 雞進(jìn)行翅靜脈采血（1 mL/只），將采集的血液以3 000 r/min 離心15 min 收集上層血清。使用噬斑減少中和試驗(yàn)（PRNT）進(jìn)行血清抗體效價(jià)檢測(cè)。將10 倍系列稀釋的被檢血清與100 PFU/0.1 mL 的JEV（SA14-14-2 株）等體積混合，然后置于37 ℃水浴中和90 min，間隔30 min 振蕩混勻；將中和后的病毒液接種于長滿單層BHK21 細(xì)胞的24 孔板中，各稀釋度接種4 孔，每孔0.1 mL，同時(shí)以濃度分別為100 和0.1 PFU/0.1 mL 的病毒液各設(shè)置4 個(gè)重復(fù)作為病毒回歸試驗(yàn)；以4 孔不作處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照。將24 孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中吸附90 min，棄去病毒液，以PBS 清洗3 次，然后加入0.5 mL RPMI 1640 培養(yǎng)基（含4%胎牛血清）與2%低熔點(diǎn)瓊脂糖等體積混合的培養(yǎng)液，在室溫下等待其自然凝固。將凝固后的24 孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，加入1%結(jié)晶紫染色。對(duì)蝕斑進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)血清稀釋度的蝕斑減少率，50%蝕斑減少的最大血清稀釋度為噬斑減少中和抗體滴度，即為被檢血清的抗體效價(jià)。

1.4 血液采集與血清分離

免疫程序結(jié)束后，當(dāng)血清抗體效價(jià)達(dá)到1:1 000以上時(shí)，以心臟采血法對(duì)試驗(yàn)雞采集血液至其死亡。將采集的血液以3 000 r/min離心15 min，收集血清。將血清置于-20 ℃及以下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 高免血清檢驗(yàn)

免疫結(jié)束后，將15 只SPF 雞的血清樣品各取200 μL，每5 份混合共獲得3 份混合樣品，隨后進(jìn)行純凈性檢驗(yàn)、效價(jià)測(cè)定和特異性檢驗(yàn)。若某只試驗(yàn)動(dòng)物不符合要求，可按照少于5 份混合?；旌蠘悠窓z驗(yàn)后若出現(xiàn)不符合標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果，需將5 份樣品進(jìn)行單獨(dú)檢驗(yàn)。

1.5.1 純凈性檢驗(yàn) 按照《中華人民共和國獸藥典》（以下簡稱《獸藥典》）[12]附錄3306、3308和3305 進(jìn)行無菌、支原體及外源病毒檢驗(yàn)。上述檢驗(yàn)均為陰性表明純凈性檢驗(yàn)符合標(biāo)準(zhǔn)。

1.5.2 效價(jià)測(cè)定 以PRNT 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果不低于1:1 000 表明符合效價(jià)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。

1.5.3 特異性檢驗(yàn) 以《獸藥典》附錄3406 中和試驗(yàn)分別檢測(cè)FMDV、PCV、PRV、CSFV、PRRSV、PPV 和BVDV 抗體。上述檢驗(yàn)均為陰性表明特異性檢驗(yàn)符合標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 分裝凍干

將檢驗(yàn)合格的高免血清混合均勻，在無菌條件下以瓶頂分裝器定量分裝至安瓿瓶中，每支裝量1 mL，共200 只。冷凍干燥后抽真空熔封。

1.7 凍干高免血清檢驗(yàn)

1.7.1 真空度測(cè)定和剩余水分測(cè)定 按《獸藥典》附錄3103 和3204 進(jìn)行，結(jié)果應(yīng)符合規(guī)定。

1.7.2 純凈性檢驗(yàn)、特異性檢驗(yàn)和效價(jià)測(cè)定 按《獸藥典》附錄3306、3308、3305 和3406 進(jìn)行無菌、支原體、外源病毒檢驗(yàn)和特異性檢驗(yàn)；以PRNT 進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，所有檢測(cè)應(yīng)符合規(guī)定。

1.7.3 均勻性檢驗(yàn) 隨機(jī)選取10 支凍干血清，采用PRNT 進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，然后以方差分析法分析樣品均勻性[13]。通過比較組間和組內(nèi)方差來判斷各組測(cè)量值之間是否存在系統(tǒng)性差異，如果兩者的比值小于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的臨界值，則認(rèn)為樣品均勻。

1.8 應(yīng)用

按照《獸藥典》附錄豬JE 活疫苗中鑒別檢驗(yàn)項(xiàng)和外源病毒檢驗(yàn)項(xiàng)，以本研究制備的陽性血清進(jìn)行豬JE 活疫苗（SA14-14-2 株）的鑒別檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血清制備及抗體檢測(cè)

對(duì)兩次試驗(yàn)每次免疫后采集的SPF 雞血液分離血清，使用PRNT 檢測(cè)不同免疫時(shí)期抗體效價(jià)。結(jié)果（表1～2）顯示，免疫周期結(jié)束后，僅編號(hào)為1-2 的雞血清效價(jià)低于1:1 000，其余雞血清效價(jià)均滿足試驗(yàn)要求。

表2 第2 次試驗(yàn)血清抗體水平檢測(cè)結(jié)果

2.2 高免血清檢驗(yàn)

2.2.1 純凈性檢驗(yàn) 將準(zhǔn)備的3 份血清混合樣品進(jìn)行無菌、支原體及外源病毒檢驗(yàn)，結(jié)果均為陰性，符合規(guī)定。

2.2.2 特異性檢驗(yàn) 將準(zhǔn)備的3 份血清混合樣品進(jìn)行FMDV、PCV、PRV、CSFV、PRRSV、PPV和BVDV 抗體檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，符合規(guī)定。

2.2.3 效價(jià)測(cè)定 將準(zhǔn)備的3 份血清混合樣品分別進(jìn)行PRNT，發(fā)現(xiàn)其血清效價(jià)分別為1:3 320、1:5 192、1:2 309，符合規(guī)定。

2.3 凍干血清檢驗(yàn)

2.3.1 純凈性檢驗(yàn) 隨機(jī)選取5 支凍干血清進(jìn)行無菌、支原體以及外源病毒檢驗(yàn)，結(jié)果均為陰性，符合規(guī)定。

2.3.2 效價(jià)測(cè)定 隨機(jī)抽取10 支凍干血清，以1 mL 滅菌生理鹽水復(fù)溶后，測(cè)定噬斑減少中和效價(jià)，發(fā)現(xiàn)所有結(jié)果均大于1:1 000（表3）。

表3 凍干陽性血清噬斑減少中和效價(jià)測(cè)定結(jié)果

2.3.3 特異性檢驗(yàn) 隨機(jī)抽取10 支凍干血清，以1 mL 滅菌生理鹽水復(fù)溶后，進(jìn)行FMDV、PCV、PRV、CSFV、PRRSV、PPV 和BVDV 抗體檢測(cè)，所有結(jié)果均為陰性，符合規(guī)定。

2.3.4 剩余水分測(cè)定 按《獸藥典》附錄3204剩余水分測(cè)定法進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)剩余水分含量分別為0.9%、1.2%、0.9%、0.8%，均＜3%，結(jié)果符合規(guī)定。

2.3.5 真空度測(cè)定 按《獸藥典》附錄3103 真空度測(cè)定法進(jìn)行，結(jié)果均符合規(guī)定。

2.3.6 均勻性檢驗(yàn) 采用方差分析法統(tǒng)計(jì)2.3.2 中10 個(gè)樣品的效價(jià)測(cè)定結(jié)果。經(jīng)檢驗(yàn)，10 個(gè)樣品組內(nèi)、組間均無明顯差異（P＜0.05），樣品是均勻的。

2.4 應(yīng)用

2.4.1 鑒別檢驗(yàn) 結(jié)果顯示，本研究制備的JEV特異性陽性血清按1:100 稀釋后，能夠完全中和500 PFU/mL 的JEV（SA14-14-2 株）。

2.4.2 外源病毒檢驗(yàn) 將凍干血清應(yīng)用于3 批JE活疫苗（SA14-14-2 株）的外源病毒檢驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，1 mL 血清能完全中和10 頭份病毒含量為107.0TCID50/頭份的疫苗樣品。

表4 3 批JE 活疫苗外源病毒檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

按照《獸藥典》豬JE 活疫苗標(biāo)準(zhǔn)，鑒別檢驗(yàn)項(xiàng)和外源病毒檢驗(yàn)項(xiàng)需要純凈性好、中和效價(jià)高的JEV 特異性血清。本研究以SPF 雞作為免疫動(dòng)物，優(yōu)化了免疫程序，以JE 活疫苗進(jìn)行基礎(chǔ)免疫后，再以JE 滅活疫苗協(xié)同免疫，最終獲得了中和效價(jià)大于1:1 000 的JEV 陽性血清。SPF 雞不含豬源病原體，將其用于制備豬用活疫苗外源病毒檢驗(yàn)用的陽性血清，在純凈性上容易控制，可更好地保證陽性血清具有良好的特異性。此外，本研究中免疫原為商品化JE 滅活疫苗和活疫苗，沒有使用JEV 強(qiáng)毒，降低了生物安全風(fēng)險(xiǎn)；免疫程序共為4 次，簡便易行，適合大規(guī)模血清制備。特異性好且中和效價(jià)高的JEV 陽性血清的制備，完善了JE 活疫苗的檢驗(yàn)工作。

按《獸藥典》附錄3305 外源病毒檢驗(yàn)法，非禽源活疫苗按瓶簽注明頭份稀釋至每1.0 mL 至少含10 頭份，再用等體積的特異性血清中和后作為檢品進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)。參照《獸藥典》豬JE 活疫苗標(biāo)準(zhǔn)，每頭份病毒含量應(yīng)不低于105.7TCID50。在實(shí)際生產(chǎn)中，豬JE 活疫苗的病毒含量可達(dá)到107.0TCID50/頭份，這對(duì)用于外源病毒檢驗(yàn)的陽性血清中和效價(jià)要求更高。為確保外源病毒檢驗(yàn)可操作，在實(shí)際生產(chǎn)檢驗(yàn)中需考慮陽性血清效價(jià)能否滿足活疫苗中病毒的完全中和。本研究中，制備的JEV 血清能等體積完全中和10 頭份病毒含量為107.0TCID50/頭份的疫苗樣品，表明制備的血清中和效價(jià)高，應(yīng)用性良好，可滿足JE 活疫苗的檢驗(yàn)需求。