陳麗麗,施民新,薛麗娟

(南通市腫瘤醫(yī)院 南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,江蘇 南通 226000)

乳腺癌作為女性中最普遍的惡性腫瘤類型,其患病率持續(xù)占據(jù)高位并呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)[1]。由于乳腺癌的發(fā)生與分子層面的調(diào)控異常密切相關(guān),導(dǎo)致患者展現(xiàn)出多樣化的臨床病理特征,因此,深入解析乳腺癌的分子病理機(jī)制及其與臨床表型之間的聯(lián)系,已成為醫(yī)學(xué)研究的關(guān)鍵課題[2-3]。在細(xì)胞生物學(xué)中,剪接體是由與蛋白質(zhì)相互作用的小RNA構(gòu)成的復(fù)合體,負(fù)責(zé)精確移除真核生物前體mRNA的內(nèi)含子[4]。若RNA剪接過程發(fā)生異常,可能觸發(fā)多種病理狀態(tài)。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步,對(duì)癌癥患者基因組的深入分析揭示了RNA剪接異常與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展之間的潛在聯(lián)系[5]。作為U2小分子核糖核蛋白復(fù)合體的關(guān)鍵組成部分,剪接因子3B(Splicing factor 3B,SF3B)在U2小分子核糖核蛋白的組裝及分支點(diǎn)序列的穩(wěn)定結(jié)合上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6]。特別是剪接因子3B亞單位1(Splicing factor 3B subunit 1,SF3B1)其在剪接體與前體mRNA的錨定過程中起著核心作用,研究發(fā)現(xiàn)其是變異頻率極高的基因之一,已報(bào)道的變異頻率介于66.7%～79%之間[7]。本研究旨在深入探究SF3B1在乳腺癌患者腫瘤組織中的表達(dá)趨勢(shì),并探討其表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征之間的潛在聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究納入了在2020年11月至2022年11月期間于本院進(jìn)行手術(shù)治療的88例乳腺癌病例作為研究樣本。病例納入標(biāo)準(zhǔn):①初發(fā)、原發(fā)的乳腺癌患者,并且經(jīng)過病理學(xué)檢查結(jié)果確診為乳腺浸潤(rùn)導(dǎo)管癌;②有手術(shù)指征,初次接受乳腺手術(shù)者;③術(shù)前未接受其他治療如放療、化療、激素療法及生物治療等。排除標(biāo)準(zhǔn):①有其他重大合并癥;②病例數(shù)據(jù)資料缺失者。88例患者均為女性,年齡31～73歲,平均(53.17±4.05)歲;分化程度為高分化67例,中分化15例,低分化6例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例;未絕經(jīng)45例,已絕經(jīng)43例。

1.2 研究方法 將手術(shù)采集到的組織樣本立即于-80 ℃冷凍保存,采用RIPA緩沖液對(duì)組織樣本進(jìn)行勻漿處理,提取總蛋白后,采用BCA蛋白測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度,加載等量蛋白至SDS-PAGE凝膠中,使用恒電流模式進(jìn)行電泳分離。將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,使用冷TBS-T緩沖液進(jìn)行濕式轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后,在5%脫脂牛奶中封閉1 h。采用SF3B1特異性一抗(1∶1000稀釋)于4 ℃孵育過夜。洗滌后,采用與一抗相對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h,使用β-actin作為內(nèi)參抗體,采用ECL化學(xué)發(fā)光底物顯影。最后,使用Image J圖像處理軟件對(duì)SF3B1蛋白及內(nèi)參蛋白的條帶進(jìn)行灰度分析,通過計(jì)算目標(biāo)蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值來(lái)確定SF3B1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo) 分析SF3B1在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá),比較不同SF3B1表達(dá)情況患者臨床病理因素:年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤部位、病理學(xué)分級(jí)、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度的差異。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌組織和癌旁組織SF3B1表達(dá)比較 乳腺癌組織SF3B1表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.05),見表1。

表1 乳腺癌組織和癌旁組織SF3B1表達(dá)比較

2.2 SF3B1表達(dá)對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示,SF3B1診斷乳腺癌的AUC為0.713,最佳截?cái)嘀禐?10.72,約登指數(shù)為0.314,敏感度為75.00%,特異度為56.43%,95%CI:0.656～0.765(P<0.001)(圖1)。

圖1 SF3B1表達(dá)診斷乳腺癌的ROC曲線

2.3 SF3B1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)ROC分析得出SF3B1診斷乳腺癌的最佳截?cái)嘀禐?10.72,以此為標(biāo)準(zhǔn)將≥110.72的納入高表達(dá)組,<110.72的納入低表達(dá)組,高表達(dá)組49例,低表達(dá)組39例。高表達(dá)組年齡明顯高于低表達(dá)組,病理學(xué)分級(jí)顯著高于低表達(dá)組,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為N0的比例明顯低于低表達(dá)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 SF3B1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

乳腺癌已成為我國(guó)女性中最為常見的惡性腫瘤類型,對(duì)女性健康構(gòu)成了極大的威脅,位居女性腫瘤發(fā)病率和病死率的首位。盡管醫(yī)療技術(shù)持續(xù)發(fā)展與進(jìn)步,乳腺癌的發(fā)生率和病死率依舊呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)[8-9]。盡管手術(shù)、放療、化療和靶向治療等多種治療手段已在臨床中廣泛應(yīng)用,但仍然有相當(dāng)一部分的患者在治療以后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,從而影響乳腺癌患者的長(zhǎng)期生存率[10-11]。了解癌癥的分子基礎(chǔ)不僅有助于更好地理解其發(fā)病機(jī)制,還可為開發(fā)新的治療策略提供方向,因此,深入探索乳腺癌的分子機(jī)制和潛在治療靶點(diǎn)尤為重要。

SF3B1是核糖核蛋白復(fù)合體的關(guān)鍵組成部分,對(duì)RNA的前體剪切起到至關(guān)重要的作用,在細(xì)胞的基因表達(dá)過程中,RNA前體剪切是mRNA合成及后續(xù)蛋白質(zhì)翻譯過程中一個(gè)至關(guān)重要的調(diào)控步驟。研究[12-13]顯示,有56%的乳腺癌中剪接體成分基因發(fā)生突變,在ER陽(yáng)性亞型患者中SF3B1的突變較為顯著,頻率較高,可能參與乳腺癌的發(fā)生。在乳腺癌中,SF3B1的突變和異常表達(dá)可能導(dǎo)致RNA剪切的異常,從而產(chǎn)生異常的mRNA和蛋白質(zhì)異構(gòu)體,這些異常的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的功能可能發(fā)生增強(qiáng)、減弱或完全改變,從而影響細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,比如某些由SF3B1突變引起的RNA剪切變體可能增強(qiáng)細(xì)胞的生存和增殖信號(hào),或抑制細(xì)胞的凋亡信號(hào),從而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展[14-15]。此外,SF3B1的突變和異常表達(dá)還可能影響乳腺癌細(xì)胞對(duì)激素等其他信號(hào)的響應(yīng),比如SF3B1的某些突變可能增強(qiáng)或減弱乳腺癌細(xì)胞對(duì)雌激素的響應(yīng),從而影響乳腺癌的生長(zhǎng)和治療反應(yīng)。本研究對(duì)比了乳腺癌組織和癌旁組織中SF3B1的表達(dá),結(jié)果顯示乳腺癌組織中SF3B1表達(dá)明顯較癌旁組織上調(diào)。原因可能是與SF3B1的作用機(jī)制有關(guān),具體而言,RNA的剪切作用是保持蛋白質(zhì)多樣性的關(guān)鍵,如果剪切相關(guān)的因子發(fā)生突變,可能會(huì)導(dǎo)致多種不正常的剪切變體,從而破壞基因序列的穩(wěn)定性,異常的RNA剪切和與之相關(guān)的基因變異,已被認(rèn)為是與腫瘤發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵特征[16-17]。SF3B1基因位于染色體2q33.1,可組成剪接體催化核心的U2小分子核糖核蛋白體(U2 small nuclear ribonucleoprotein particle,U2-snRNP),SF3B1作為SF3B的亞單位,能夠與RNA前提的5’及3’端分支點(diǎn)交聯(lián),參與mRNA內(nèi)含子的剪切和成熟過程[18-19]。作為RNA剪切因子中突變頻率最高的基因,突變發(fā)生在多種類型癌癥中。SF3B1的變異主要集中在其C端的22個(gè)HEAT重復(fù)結(jié)構(gòu)域內(nèi),在乳腺癌中,這種變異會(huì)導(dǎo)致氨基酸的單點(diǎn)替換,表現(xiàn)為雜合性的突變形式,其突變位點(diǎn)在22個(gè)重復(fù)HEAT結(jié)構(gòu)域中集中在第5至第9,乳腺癌中SF3B1的復(fù)發(fā)性錯(cuò)義突變也表明mRNA剪接過程中剪接體的重要作用。有研究應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)評(píng)估慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者癌癥細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)SF3B1突變引起的RNA選擇性剪接大多集中在3’剪接位點(diǎn),另外也有研究分析乳腺癌的生物信息學(xué),得到了相同結(jié)論[20-21]。

本研究分析SF3B1表達(dá)對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值,ROC結(jié)果顯示,SF3B1的AUC為0.713,診斷效能較好。并且本研究根據(jù)ROC得出的最佳截?cái)嘀祫澐指叩捅磉_(dá)組,證實(shí)SF3B1的表達(dá)水平與患者年齡、病理學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)有關(guān),提示SF3B1在乳腺癌初期可能扮演關(guān)鍵角色,并有可能成為乳腺癌治療的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。SF3B1可通過激活RAS及MAPK等信號(hào)傳導(dǎo)途徑,以及介導(dǎo)細(xì)胞因子與其受體之間的相互作用,進(jìn)而參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性,包括絲氨酸和蘇氨酸的代謝過程,尤其是RAS信號(hào)途徑的持續(xù)活化,促進(jìn)正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)變,并觸發(fā)細(xì)胞的無(wú)限制增殖現(xiàn)象[22-23]。當(dāng)MAPK信號(hào)途徑被過度激活或表達(dá)增強(qiáng)時(shí),細(xì)胞內(nèi)會(huì)觸發(fā)一系列的鏈?zhǔn)椒磻?yīng),這些反應(yīng)會(huì)影響細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,導(dǎo)致與細(xì)胞生長(zhǎng)、擴(kuò)增、遷移和死亡相關(guān)的基因的過量表達(dá),同時(shí)使來(lái)自外界生長(zhǎng)因子的信號(hào)作用增強(qiáng),以此機(jī)制促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖[24]。研究[25]顯示,SF3B1的反復(fù)突變與乳腺癌不同剪接活性相關(guān),并且年齡較大的患者突變風(fēng)險(xiǎn)更高,與年齡呈現(xiàn)明顯相關(guān)性。然而與其他臨床病理學(xué)因素沒有顯著相關(guān)性,這可能是由于樣本量的限制,此外,由于腫瘤的內(nèi)在異質(zhì)性,SF3B1在各種腫瘤信號(hào)途徑中可能有不同的功能。同時(shí),腫瘤的體積和研究操作中的變異也可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)的不一致性,從而影響研究結(jié)果。因此,關(guān)于SF3B1與腫瘤的臨床病理特性和其深層次的分子機(jī)制仍需深入探討。

綜上所述,SF3B1在乳腺癌患者體內(nèi)的表達(dá)水平顯著提高,其在乳腺癌的早期診斷中顯示出較高的應(yīng)用價(jià)值。SF3B1的表達(dá)與患者的年齡、病理等級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況等多個(gè)臨床病理指標(biāo)緊密相關(guān),表明其可能在乳腺癌的發(fā)展、局部侵犯及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等關(guān)鍵過程中扮演著重要角色,并有助于在臨床上對(duì)乳腺癌進(jìn)行診斷和評(píng)估病情。