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中藥復(fù)方參麻頸復(fù)顆粒治療腦梗死的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2024-02-27 11:46:48何瑞華
藥學(xué)實踐雜志 2024年2期
關(guān)鍵詞:靶點(diǎn)通路腦梗死

徐 熠,何瑞華,黃 瑾

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科, 上海 200437)

參麻頸復(fù)顆粒是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院經(jīng)典的自制制劑,由丹參、山茱萸、梔子、續(xù)斷等10 余味藥物組成,具有活血通絡(luò),寧神安腦,健筋壯骨的功效。通過益氣活血、滋陰降火、補(bǔ)肝益腎、溫脾化痰以達(dá)到氣血雙補(bǔ)、上中下統(tǒng)調(diào)的治療作用[1],多用于頸椎病、腦供血不足、頭昏脹痛、夜寐夢擾等。腦梗死屬于中醫(yī)“中風(fēng)”范疇,是指各種原因引起的腦部血液供應(yīng)障礙,使局部腦組織發(fā)生不可逆性損害[2],主要采用溶栓、抗血小板或抗凝、調(diào)脂藥以及腦保護(hù)藥等治療手段。參麻頸復(fù)顆粒作為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽醫(yī)院(本院)的特色自制制劑,在數(shù)十年的臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其對腦梗死患者的預(yù)后有明顯的治療作用,研究表明該方中當(dāng)歸[3]、川芎[4]、蒺藜[5]、杜仲[6]、天麻[7]等藥味均對腦梗死有一定的療效,但作用機(jī)制尚不清楚。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,對參麻頸復(fù)顆粒治療腦梗死的作用機(jī)制進(jìn)行研究,預(yù)測可能的活性成分、作用靶點(diǎn)及通路,為該制劑的進(jìn)一步研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 參麻頸復(fù)顆?;钚猿煞趾Y選及對應(yīng)靶點(diǎn)的收集

參麻頸復(fù)顆粒共由十二味中藥組成,本研究利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP 數(shù)據(jù)庫)[8]、中藥百科全書數(shù)據(jù)庫(ETCM 數(shù)據(jù)庫)[9]、中醫(yī)藥資料庫檢索參麻頸復(fù)顆粒中組成中藥的化學(xué)成分,TCMSP 數(shù)據(jù)庫沒有收錄中藥天麻和首烏藤,因此天麻的化學(xué)成分從ETCM 數(shù)據(jù)庫檢索,首烏藤的化學(xué)成分從中醫(yī)藥資料庫數(shù)據(jù)庫檢索[10-11],鑒于不同數(shù)據(jù)庫中化學(xué)成分名稱可能不同,因此將檢索的化學(xué)成分根據(jù)其CAS 匹配到 TCMSP,找到該化學(xué)成分并獲取其作用靶點(diǎn)。其余十味藥通過TCMSP 查找并導(dǎo)出用于篩選活性成分的相應(yīng)數(shù)據(jù),根據(jù)參數(shù)的口服生物利用度( oral bioavailability,OB) 和類藥性( drug-likeness, DL)[12],以O(shè)B≥30%且DL ≥0.18 作為條件篩選出活性成分,再利用TCMSP,關(guān)聯(lián)相應(yīng)的靶點(diǎn),得到潛在靶點(diǎn)蛋白,并通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)[13]匹配靶點(diǎn)蛋白所對應(yīng)的基因。

1.2 參麻頸復(fù)顆?;钚猿煞?預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將參麻頸復(fù)顆粒的活性成分及潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件,構(gòu)建參麻頸復(fù)顆粒的活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 腦梗死相關(guān)靶標(biāo)蛋白質(zhì)的收集

基于OMIM 數(shù)據(jù)庫[14]檢索腦梗死相關(guān)靶蛋白基因,以腦梗死(cerebral infarction)和缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke)為關(guān)鍵詞進(jìn)行靶標(biāo)檢索,所有靶標(biāo)均通過UniProt 數(shù)據(jù)庫獲取其UniProt ID 信息。

1.4 參麻頸復(fù)顆粒相關(guān)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將OMIM 中收集到的與腦梗死相關(guān)的所有蛋白質(zhì),導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫,導(dǎo)出分值>0.7 的高置信度蛋白相互作用數(shù)據(jù),用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建與治療腦梗死有關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI) 網(wǎng)絡(luò)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)合并

利用Cytoscape 3.7.2 軟件中Merge 功能,將參麻頸復(fù)顆?;钚猿煞?預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與腦梗死的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)合并,確定兩者是否存在交集,通過Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建參麻頸復(fù)顆粒活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),系統(tǒng)分析參麻頸復(fù)顆粒治療腦梗死的潛在作用靶點(diǎn)。

1.6 參麻頸復(fù)顆粒治療腦梗死預(yù)測靶標(biāo)富集分析

采用DAVID 數(shù)據(jù)庫( https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)[15-17],對與腦梗死相關(guān)的參麻頸復(fù)顆?;钚猿煞?潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行基于KEGG 的生物通路富集分析,并利用OmicShare 對通路進(jìn)行可視化,采用DAVID 數(shù)據(jù)庫,對與治療腦梗死相關(guān)的參麻頸復(fù)顆?;钚猿煞?潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行GO 功能富集分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 參麻頸復(fù)顆粒活性成分篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中對十二味藥的活性成分進(jìn)行檢索,共得到183 個潛在有效成分(表1),其中有13 個為共有成分(表2)。

表1 參麻頸復(fù)顆粒中藥對應(yīng)潛在有效成分個數(shù)

表2 參麻頸復(fù)顆粒中藥共有潛在有效成分

2.2 參麻頸復(fù)顆?;钚猿煞?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選出的參麻頸復(fù)顆粒183 個潛在有效成分導(dǎo)入到TCMSP,查找相應(yīng)的靶點(diǎn),得到1 785 個潛在靶點(diǎn)蛋白,并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫匹配其蛋白所對應(yīng)的基因。將結(jié)果導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2 軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,得到參麻頸復(fù)顆粒主要活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(見表1 和圖1)。該網(wǎng)絡(luò)共有519 個節(jié)點(diǎn)、1 927 條邊,矩形方陣中淺藍(lán)色菱形表示單味藥的作用靶點(diǎn)、藍(lán)色菱形表示共有的作用靶點(diǎn)、八邊形圖標(biāo)表示參麻頸復(fù)顆?;钚猿煞?、黃色箭頭圖標(biāo)表示共有活性成分。參麻頸復(fù)顆粒的活性成分按度值排序,前四名分別為槲皮素、山柰酚、β-谷固醇、豆甾醇。該網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建提示參麻頸復(fù)顆粒的組成中藥均具有多活性成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

圖1 參麻頸復(fù)顆粒主要活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 腦梗死相關(guān)靶點(diǎn)信息的收集和篩選

在OMIM 數(shù)據(jù)庫檢索與腦梗死相關(guān)的基因,共檢索到216 個相關(guān)基因靶點(diǎn)。參麻頸復(fù)有效成份的1 785 個潛在靶點(diǎn)蛋白,刪除重復(fù)項后得到384個相關(guān)靶點(diǎn)。將成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)輸入BioVenn在線軟件進(jìn)行交集分析,繪制韋恩圖,篩選出腦梗死與參麻頸復(fù)活性成分共有30 個共同靶點(diǎn)(圖2)。

圖2 參麻頸復(fù)活性成分與腦梗死共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 參麻頸復(fù)顆粒治療腦梗死靶標(biāo)蛋白-蛋白相互作用分析及網(wǎng)絡(luò)可視化構(gòu)建

將參麻頸復(fù)顆粒預(yù)測所得的基因與腦梗死相關(guān)基因進(jìn)行映射后得到共有靶基因,輸入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用分析。在分析過程中,選取物種為Homosapiens ,并將蛋白-蛋白互作得分>0.7 的基因輸入Cytoscape 3.7.2 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化,共有30 個節(jié)點(diǎn),253 個連線。應(yīng)用軟件中的Network analysis plugin 對網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)(Node)進(jìn)行統(tǒng)計,分析其在圖中的作用,自由度(Degree)越大,該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的生物功能則越多。同時,顏色越深代表該節(jié)點(diǎn)自由度較大、生物功能較多(圖3)。進(jìn)一步對與腦梗死潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,得到網(wǎng)絡(luò)中潛在靶點(diǎn)的度值,網(wǎng)絡(luò)中有20 個靶點(diǎn)的度值>16.86(平均度值),可能為參麻頸復(fù)顆?;钚猿煞职l(fā)揮作用的潛在靶點(diǎn)。

圖3 參麻頸復(fù)顆粒治療腦梗死的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

利用DAVID 平臺進(jìn)行GO 功能富集分析,對與腦梗死相關(guān)的參麻頸復(fù)顆?;钚猿煞?潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中涉及的30 個蛋白在基因功能中的作用進(jìn)行研究,得到了151 個GO 條目,根據(jù)P<0.05,篩選出117 個GO 條目,針對前10 條BP 分析、CC 分析、MF 分析繪制直方圖(圖4)。其中,生物過程相關(guān)的條目最多,有74 個,結(jié)果顯示參麻頸復(fù)顆粒主要對基因表達(dá)的正向調(diào)控、白細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)節(jié)等方面影響較大;分子功能相關(guān)的條目23 個,結(jié)果顯示參麻頸復(fù)顆粒主要對蛋白質(zhì)結(jié)合、鈣離子結(jié)合、受體活性、細(xì)胞因子活性等方面影響較大;細(xì)胞組成相關(guān)的條目20 個,結(jié)果顯示參麻頸復(fù)顆粒主要對細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜、細(xì)胞表面、胞外區(qū)等方面影響較大。

圖4 參麻頸復(fù)顆粒治療腦梗死潛在靶點(diǎn)的GO 富集分析

利用DAVID 平臺的KEGG 通路富集分析功能,對與腦梗死相關(guān)的參麻頸復(fù)顆?;钚猿煞?潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中涉及的蛋白信號通路中的作用進(jìn)行研究,得到19 條信號通路,包括補(bǔ)體和凝血級聯(lián)通路、NF-κB 信號通路、HIF-1 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、HTLV-I 感染、神經(jīng)活性配體受體相互作用等。

2.6 藥物-化合物-靶點(diǎn)-通路圖的構(gòu)建

基于上述信息,構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路圖,以全面闡述參麻頸復(fù)顆粒腦梗死的作用機(jī)制(圖5、表3),圖中有74 個節(jié)點(diǎn)和188 條邊,黃色菱形代表參麻頸復(fù)顆粒活性成分,綠色圓形代表潛在靶點(diǎn),紅色箭頭代表信號通路,邊代表三者之間的相互作用。從結(jié)果可以看出參麻頸復(fù)方中槲皮素、β-胡蘿卜素、柚皮素、西紅花酸、大黃素、報春色素苷、表兒茶素等活性成分可能是參麻頸復(fù)治療腦梗死的關(guān)鍵成分。

圖5 參麻頸復(fù)顆粒治療腦梗死的“活性成分-靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖

表3 參麻頸復(fù)顆粒活性成分對照表

3 討論

中藥復(fù)方具有多活性成分、多作用靶點(diǎn)的特性,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段,可以有效預(yù)測參麻頸復(fù)顆粒治療腦梗死的作用機(jī)制。通過藥物-化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,可以發(fā)現(xiàn)參麻頸復(fù)顆粒中的陳皮、川芎、梔子、蒺藜、杜仲、天麻、首烏藤、山茱萸等藥味中的槲皮素[18]、β-胡蘿卜素[19]、西紅花酸、柚皮素[20]、大黃素、報春色素苷、表兒茶素等活性成分可改善腦梗死患者的預(yù)后情況。研究顯示槲皮素可通過抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激水平,改善腦梗死受損神經(jīng)功能,改善腦纖溶功能。β-胡蘿卜素能阻止腦組織因自由基激活的氧化損傷,保護(hù)低密度脂蛋白免遭氧化損傷,在降低腦血管病危險因素方面有一定的作用。柚皮素可降低缺血再灌注損傷側(cè)腦組織含水量、縮小腦梗死體積、降低腦組織MDA 含量,提高SOD 活性,對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。通過GO 功能富集結(jié)果提示,參麻頸復(fù)顆??赡芡ㄟ^作用于纖溶酶原激活物抑制物1、血栓調(diào)節(jié)蛋白、凝血因子Ⅶ、血管內(nèi)皮生長因子A 等多個靶點(diǎn),干預(yù)血小板激活、改善受損神經(jīng)功能、保護(hù)腦缺血再灌注損傷,從而有助于腦梗死患者的恢復(fù)。

腦梗死后出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)與腦損傷存在一定的關(guān)系,KEGG 生物通路富集分析結(jié)果提示參麻頸復(fù)顆粒在干預(yù)腦梗死相關(guān)通路中,TNF 信號通路和NF-κB 信號通路起到了治療腦梗死后炎癥反應(yīng)的重要作用。 IL-6 靶點(diǎn)和TNF 信號通路是腦梗死后重要的炎癥反應(yīng)通路[21]。NF-κB 信號通路對炎癥反應(yīng)具有顯著的影響,是腦缺血后炎性級聯(lián)反應(yīng)的始動因素[22],NF-κB 被激活,使其調(diào)控的靶基因轉(zhuǎn)錄活性升高,可誘導(dǎo)TNF 和IL-6 等炎癥因子的產(chǎn)生,促進(jìn)炎癥發(fā)生發(fā)展和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡加重腦缺血的損傷。因此,參麻頸復(fù)顆??赡苁峭ㄟ^抑制NF-κB、TNF 等炎癥信號通路,起到保護(hù)腦血管損傷的作用。

HIF-1 信號通路參與腦缺血組織的血管再生和血腦屏障的維持[23],可以通過調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄,對抗低氧造成的細(xì)胞功能紊亂。HIF-1 可以調(diào)控10 余種下游基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而對多種細(xì)胞的多種生物學(xué)活動有重要影響[24]。因此,參麻頸復(fù)顆??赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)HIF-1 信號通路促進(jìn)對腦血管組織的再生,維持腦梗死患者的血腦屏障,改善腦梗死患者的預(yù)后情況。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)和方法,通過中藥活性成分的篩選、靶點(diǎn)預(yù)測、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析,從“藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病”的關(guān)聯(lián)性對中藥復(fù)方參麻頸復(fù)顆粒治療腦梗死的相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行分析,預(yù)測參麻頸復(fù)顆粒治療腦梗死的主要活性成分、作用靶點(diǎn)及信號通路,為進(jìn)一步的實驗驗證提供依據(jù)。

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